Este trabalho foi apoiado por uma concessão de APART da Academia Austríaca de Ciências (CTH), a agência de tecnologia da República Checa projeto n. TA04010877 (CTH, VH e JGS), e a Fundação de ciência Checa (GACR) projeto não GA16-01246S (para JGS). Agradecemos a W. Tecumseh Fitch para sua sugestão de usar creme fixador de dentadura e Ing. P. Liska do serviço de floresta de exército Checa por sua ajuda na aquisição de larynges o veado extirpado.

Os espécimes animais analisados neste trabalho foram tratados em conformidade com as exigências do padrão éticas da Universidade Palacky em Olomouc, República Checa. Eles derivam de red deer descontroladamente vivendo em florestas, que foram caçadas pelo exército checo floresta serviço durante uma temporada de caça regular.
1. preparação da amostra Hemi-laringe
Nota: Só os espécimens correctamente preparados devem ser usados, como indicado na4 . Rápido congelamento da laringe25 imediatamente após a excisão e armazenamento a-80 ° C minimiza o potencial de degradação do tecido e alteração das propriedades biomecânicas e permite a realização dos experimentos em qualquer momento conveniente.
<ol><li>
Descongelação a laringe
	<ol>
<li>Inserir a laringe congelada em dois sacos de autoclave ou qualquer outros sacos de plástico com vedação impermeável. Selar os sacos e colocá-los em um banho de água aquecido a 30 ° C até a laringe é completamente descongelada. A duração necessária varia de algumas horas a mais do que um dia, dependendo do tamanho da laringe e da temperatura de congelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpeza da laringe
	<ol>
<li>Depois que a laringe é descongelada, removê-lo do saco e limpe-a completamente com solução salina (0,9% NaCl).</li>
		<li>Remova cuidadosamente o tecido supérfluo como aplicável (músculos do pescoço ou seja, externo, osso hioide, etc.) sem danificar as principais estruturas da laringe e encurtar a traqueia de um comprimento adequado para a montagem da laringe, um tubo de alimentação de ar (geralmente ca. 4-5 cm).</li>
		<li>Verifique se o tecido laríngeo para potenciais anomalias de tecido, tais como feridas, deformações orgânicas ou rachaduras potencialmente ocorrendo desde o processo de congelamento, o que poderia fazer com que a laringe inadequado para o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exposição de cartilagens tireoide e cricoide
	<ol>
<li>Remova partes do tecido do músculo laríngeo externo ao redor da cartilagem tireoide e cricoide, usando um bisturi, expondo assim as cartilagens em preparação para o corte médio sagital, criando a hemi-laringe. Nesta fase de preparação é retratada na figura 1A e 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corte médio-sagital através da cartilagem tireoide
	<ol>
<li>Faça um corte vertical inicial através da parte anterior da cartilagem tireoide.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente o corte um pouco mais para o lado que está prestes a ser removido, para não danificar a prega vocal que precisa permanecer preservada. Se possível, use um bisturi para cortar. Se a cartilagem é ossificada, use uma pequena serra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corte a cartilagem cricoide
	<ol>
<li>Levar o corte verticalmente (inferiormente) de entre as cartilagens aritenoide e, em seguida, através da cartilagem cricoide para um nível de aproximadamente horizontal do entalhe da tireoide inferior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remoção de uma prega vocal, criando uma incisão em forma de L na laringe
	<ol>
<li>Faça uma horizontal corte começando da extremidade inferior do corte vertical feito anteriormente na cartilagem cricoide e levar o novo corte para a ranhura inferior da tireoide. Anteriormente, dobre o lado da laringe que vai ser removido.</li>
		<li>Fazer um vertical cortar o tecido mole no lado interno da cartilagem tireoide - cuidado quando liderava o corte entre o anexo anterior das pregas vocais para a cartilagem tireoide, evitando assim danos a prega vocal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Refinamento do corte através da cartilagem tireoide
	<ol>
<li>Uso um bisturi, uma serra ou um arquivo, a fim de aplicar um corte reto precisamente na cartilagem tireoide e obter como perto possível para a parte anterior da prega vocal previamente inspecionada.</li>
		<li>Remover também uma pequena parte da cartilagem tireoide posterior, a fim de criar espaço para inserir o pino para adducting a aritenoide a cartilagem e, assim, o vocal dobram (veja abaixo). Nesta fase de preparação é retratada na Figura 1 e 1 D. Nota: Dependendo da questão de investigação, exposição completa da prega vocal toda pode ser necessária para permitir sua visibilidade de cima. Nesse caso, devem ser removidas as estruturas acima da prega vocal (verdadeira) (ou seja, a ventricular ou vestibular dobra, conforme aplicável, tendo em conta a anatomia da amostra). Em algumas amostras de tecido mole interno da laringe acima das pregas vocais pode perder sua conexão com a cartilagem tireoide e interfere com a prega vocal durante a vibração, potencialmente causando espúrios padrões oscilatórios (principalmente irregular). Nesse caso a remoção cuidadosa de que o tecido é inevitável.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig1.jpg"> Figura 1 : Montagem e preparação de Hemi-laringe. (A) e (B) limpo espécime de laringe, vista medial e posterior, antes da remoção da prega vocal esquerda; (C) e (D) preparado hemi-laringe com incisão em forma de L (esquerda prega vocal removida), medial e posterior exibição. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55303/55303fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

2. experiência Hemi-laringe
<ol><li>
Instalação de Hemi-laríngeo
	<ol>
<li>Use um tubo de alimentação de ar que fornece ar aquecido e umidificado para a laringe.</li>
		<li>Construção de dois dispostas perpendicularmente placas transparentes como uma substituição para partes da laringe removidas.</li>
		<li>Uso de pinos 4 para aumentar a estabilidade da laringe e criando uma configuração adequada de laringe pre-phonatory por adducting a prega vocal restante para a placa de vidro vertical (ver Fig. 2A). Nota: Teoricamente, as pregas vocais podem também ser aduzidas por suturas e pesos em um sistema de polia-alavanca 26 . No entanto, essa abordagem, para melhor conhecimento desses autores, ainda não foi tentada por uma preparação de hemilarynx.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig2.jpg">
Figura 2 : Instalação de Hemi-laringe. (A) estruturas de apoio: tubo de alimentação, arranjo de placa de vidro em forma de L, pontas de adução de ar. (B) montado preparação hemi-laringe com pinos de adução. (C) e (D) close-ups de hemi-laringe-preparação, visto do lado e da parte superior, respectivamente. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55303/55303fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>
Montagem a hemi-laringe
	<ol>
<li>Cobrir o tubo de alimentação de ar com fixador de dentadura creme e montar a laringe usando a parte restante de sua traqueia. O creme fixador funciona como um adesivo e fecha potenciais lacunas, criando assim um selo hermético.</li>
		<li>Aperte a traqueia com uma cinta ou um grampo de aperto de plástico.</li>
		<li>Também cobrir as bordas do corte através da cartilagem tireoide com o fixador creme, evitando espalhar creme fixador sobre a prega vocal ou tecidos moles internos da laringe.</li>
		<li>Anexe as placas transparentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabilização da cartilagem tireoide, adução da prega vocal usando pinos
	<ol>
<li>Use os pinos para aduto a prega vocal à placa e estabilizar a cartilagem tireoide.</li>
		<li>Depois fixou-se o creme fixador, aplica o fluxo de ar a fim de estabelecer a oscilação da prega vocal e verificar possíveis vazamentos entre a hemi-laringe e as placas de vidro.</li>
		<li>Sele as lacunas eventualmente ocorrendo, adicionando mais creme fixador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A preparação de hemi-laringe compartilha as vantagens da instalação do "convencional" laringe extirpado (completo): em tal abordagem experimental, físicas e fisiológicas condições de contorno e parâmetros (como pressão subglottal ou alongamento de prega vocal) podem ser controlado razoavelmente bem. O comportamento do hemilarynx é homólogo para que de uma laringe completa com um perfeito lateral simetria, com a exceção que magnitudes de alguns parâmetros (ex., taxa de fluxo de ar, pressão sonora) são reduzidos em cerca de 50%, no entanto, sendo ainda dentro intervalos realista16. A principal desvantagem da abordagem completa laringe extirpado, i. e., a falta de visibilidade da superfície da prega vocal ao longo da dimensão (anteriores-craniana) superior-inferior, é superar na configuração da hemi-laringe, fornecendo uma vista lateral da vibração vocal Dobre. A configuração de hemi-laringe assim permite avaliação do movimento de prega vocal em várias dimensões, que é crucial ao tentar compreender os detalhes mais finos do mecanismo de geração de som biofísicos em seres humanos e mamíferos não-humanos.
Aqui, vários aplicativos exemplares da instalação do hemi-laringe foram demonstrados. A documentação da vibração da prega vocal de dois ângulos de câmera permite a análise de dados mais qualitativos e quantitativos. A análise de kymographic glotal movimento na direção vertical, recém introduzida neste trabalho, permite a reconstrução das variações geométricas temporais da glote ao longo de uma posição selecionada no eixo antero-posterior (dorso-ventral) glotal. Quando repetir esta análise para vários pontos equidistantes espaçados ao longo do eixo glotal, o movimento glotal inteiro poderia ser reconstruído. Observe que essa abordagem fornece comparável mas não idênticos resultados, em comparação com avaliação da prega vocal movimento pela marcação e acompanhamento individual "fleshpoints" no tecido da prega vocal (também em pontos não formando a glote), por exemplo, com microsuturas20 ou carboneto de silício partículas5,40. Um conhecimento preciso sobre a geometria glotal em três dimensões, variáveis no tempo é crucial para investigar mais detalhes sobre o fluxo de ar glotal e sua interação com o tecido vibração laríngea. Por exemplo, modelos computacionais do vocal auto-sustentável dobram a vibração pode ser melhorada como dados mais empíricos sobre o ponto de separação do jato do fluxo de ar médio 41,42,43,44, 45,46,,47,48 se tornam disponíveis.
Conforme ilustrado na Figura 5, a preparação de hemi-laringe permite a avaliação da área de contato de prega vocal (VFCA) durante a vibração da prega vocal auto-sustentado. Por um, conhecimento da magnitude variáveis no tempo relativo de VFCA é útil para validar os resultados de medições electroglottographic27, como o ovo é um método amplamente utilizado para avaliação não invasiva do vocal fold vibração em vivo. Além disso, a medição da sua variação ao longo do tempo e a geometria exata do VFCA pode vir a ser crucial para compreender melhor a noção de prega vocal contato profundidade 49 e sua potencial relação com a velocidade da onda da mucosa chamada50 , 51 , 52 , 53. lá, uma onda viajante orientado a fluxo de ar ocorre dentro da camada de cobertura de superfície do tecido a prega vocal. Esta onda move inicialmente junto com o fluxo de ar glotal trans do inferior para o superior vocal dobre a borda, e então ele propaga lateralmente através da superfície superior prega vocal uma vez cada ciclo oscilatório54.
Apesar de tudo, a abordagem de hemi-laringe é constituinte, potente e não muito usado atualmente disponível arsenal de métodos empíricos para a ciência básica de voz. Aqui, um tutorial para a criação de uma preparação de hemi-laringe é apresentado, e algumas potenciais aplicações futuras são discutidas. As dada instruções podem ajudar a melhorar a repetibilidade de experimentos em laboratórios diferentes, fornecendo, assim, os cientistas de voz com potencial para entender melhor a biomecânica da produção da voz.

Voz é geralmente criado por vibração tecido laríngeo (principalmente as pregas vocais), que converte um fluxo de ar constante, fornecido pelos pulmões, uma sequência de pulsos de fluxo de ar. A forma de onda de pressão acústica (ou seja, o som principal) emergindo esta sequência de pulsos de fluxo acusticamente excita o trato vocal que filtra-los, e o som resultante é radiado da boca e (até certo ponto) o nariz1 . A composição espectral do som gerado é em grande parte influenciada pela qualidade da vibração da prega vocal, regulada por interações com o fluxo de ar traqueal2e biomecânica da laringe. Tanto em uma clínica e um contexto de pesquisa, documentação e avaliação da vibração da prega vocal é assim de maior interesse ao estudar a produção da voz.
Em humanos, direta investigação endoscópica da laringe durante a produção do som na vivo é um desafio, e é praticamente impossível nos mamíferos não-humanos, tendo em conta os meios tecnológicos atuais. Portanto e em ordem de garantia cuidadosamente controlada física e/ou fisiológicas limite condições experimentais, a utilização de extirpado larynges3,4 é em muitos casos uma substituição adequada para a investigação de in vivo mecanismos de produção de voz.
Vibração da prega vocal é um fenómeno tridimensional complexo5. Enquanto métodos de investigação convencionais como endoscopia laríngea (na vivo) ou laringe extirpado preparações geralmente fornecem somente uma vista superior da vibração de pregas vocais6, eles não permitem a completa análise tridimensional de movimento da prega vocal. Em particular, na vista superior as margens inferiores (caudais) das pregas vocais são invisíveis durante uma parte importante do ciclo vibratório. Isto é devido ao atraso de fase entre a inferior (caudal) e a borda superior (cranial) das pregas vocais, um fenômeno que é normalmente visto durante a oscilação de prega vocal5. Como evidência empírica direta para fazer backup de resultados de modelos matemáticos e físicos é escassa, conhecimento da geometria e do movimento o vocal inferior dobre borda7e, portanto, a geometria do canal subglottal8,9 , 10 é crucial para a melhor compreensão da interação entre o fluxo de ar na laringe, tecido de prega vocal e a resultante das forças e pressões11,12. Outro aspecto da vibração da prega vocal que é escondido do habitual vista superior é a profundidade vertical (anteriores-craniana) do contato entre as duas pregas vocais. A profundidade vertical de contato está relacionada com a espessura vertical das pregas vocais, que é um potencial indicador de registo vocal usado em canto ("peito" vs "falsetto" registo)13,14.
A fim de superar as deficiências das preparações convencionais laringe extirpado (completo), pode ser utilizada uma configuração chamada hemi-laringe, onde metade da laringe é removido, facilitando assim a avaliação das características vibratórias dos restantes prega vocal em três dimensões. Surpreendentemente, desde a introdução desta configuração na década de 1960 a15 e uma validação inicial do conceito em 199316, não há muitos laboratórios realizaram experimentos com esta promissora abordagem experimental17,18 ,19,20,21,22,23. Uma explicação para isso pode ser encontrada nas dificuldades da criação de uma preparação de hemi-laringe viável. Enquanto a preparação convencional extirpado (completo) laringe é bem documentada4, sem tais instruções detalhadas ainda estão disponíveis para a criação de uma configuração de hemi-laringe. É, portanto, o objetivo deste trabalho para fornecer um tutorial para estabelecer uma configuração confiável reprodutíveis hemi-laringe, complementada por resultados experimentais de espécimes de veado-vermelho.
Uma configuração de hemi-laringe compartilha muitas características com uma configuração de laringe extirpado "convencional", tais como equipamentos de medição, de alta velocidade ou outra tecnologia de imagem para documentar adequadamente as vibrações das estruturas da laringe durante a geração de som, ou adequada fornecimento de ar aquecido e umidificado. Estas considerações de configuração geral são descritas em detalhe em um capítulo do livro4 e um relatório técnico do centro nacional de voz e fala24. Reiteração destas instruções estaria além do escopo deste manuscrito. Aqui, apenas as directivas especializadas para gerar uma configuração de hemi-laringe são apresentadas.

<table><tbody><tr><td>Surgical blades</td><td>Surgeon</td><td>Jai Surgical Ltd., New Delhi, India</td><td></td></tr><tr><td>Saw</td><td>Hand saw (Lux, 150 mm length)</td><td>Lux, Wermelskirchen, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Testo 922</td><td>Testo Ltd., Hampshire, UK</td><td>K-type Probe, Operating temperature -20 to +50 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Autoclave bags</td><td>Autoclave bags</td><td>vwr.com, VWR International s.r.o., Stribrna Skalice, Czech republic</td><td></td></tr><tr><td>Conductive glass plates</td><td>Custom made</td><td>UPOL - Joint laboratory of Optics&lt;br/&gt; Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td><td></td></tr><tr><td>Fixative cream</td><td>Denture fixative cream</td><td>Blend-a-dent Natural</td><td></td></tr><tr><td>Prongs and fastening system</td><td>Customized Kanya Al eloxed profiles</td><td>Distributor: VISIMPEX a.s.. Seifertova 33, 750 02 Prerov, the Czech Rep.;</td><td>&amp;nbsp;Combination of Kanya RVS and PVS fastening systems (http://www.kanya.cz/) + custom made prongs</td></tr><tr><td>Mounting tube</td><td>Custom made</td><td>UPOL - Joint laboratory of Optics,&lt;br/&gt; Trida 17. listopadu 50A, 772 07 Olomouc, the Czech Rep.</td><td></td></tr><tr><td>LED Light</td><td>Verbatim 52204 LED Lamp</td><td>Mitsubishi Chemical Holdings Corporation, Tokyo, Japan</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Canon EOS1100D</td><td>Canon Inc.</td><td>18-55 mm lens</td></tr><tr><td>Airpump</td><td>Resun LP100</td><td>Resun</td><td></td></tr><tr><td>Strobe light</td><td>ELMED Helio-Strob micro2</td><td>ELMED Dr. Ing. Mense GmbH, Heiligenhaus, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>Custom made</td><td>Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td><td></td></tr><tr><td>Subglottic tract</td><td>Custom made adjustable subglottic tract</td><td>Voice Research Lab, Dept. Biophysics, Faculty of Sciences, Palacky University Olomouc, Czech republic</td><td>Hampala, V., Svec, Jan, Schovanek, P., and Mandat, D. Uzitny vzor c. 25585: Model subglotickeho traktu. [Utility model no. 25585: Model of subglottal tract] (In Czech) Soukup, P. 2013-27834(CZ 25505 U1), 1-7. 24-6-2013. Praha, Urad prumysloveho vlastnictvi</td></tr></tbody></table>

hemi-laryngeal setup for studying vocal fold vibration in three dimensions

A voz dos seres humanos e maioria dos mamíferos não-humanos é gerada na laringe através da oscilação auto-sustentável das pregas vocais. Documentação visual direta da vibração da prega vocal é um desafio, especialmente em mamíferos não-humanos. Como alternativa, laringe extirpado experimentos fornecem a oportunidade de investigar a vibração da prega vocal em condições físicas e fisiológicas controladas. No entanto, o uso de uma laringe completa apenas fornece uma vista superior das pregas vocais, excluindo partes cruciais das estruturas oscilantes de observação durante sua interação com forças aerodinâmicas. Esta limitação pode ser superada através da utilização de uma instalação de hemi-laringe onde metade da laringe é meados-essas removido, fornecendo um superior e uma vista lateral da prega vocal restante durante oscilação auto-sustentado.
Aqui, um guia passo a passo para a preparação anatômica das estruturas do hemi-laríngeo e sua montagem na bancada do laboratório é dado. Fonação exemplar da preparação hemi-laringe é documentada com dados de vídeo de alta velocidade, capturados por duas câmeras sincronizadas (vistas superiores e laterais), apresentando movimento de prega vocal tridimensional e variáveis no tempo correspondente a área de contacto. A documentação da instalação do hemi-laringe nesta publicação irá facilitar a aplicação e repetibilidade confiável em pesquisa experimental, fornecendo os cientistas de voz com o potencial para entender melhor a biomecânica da produção da voz.

Ilustrações da preparação hemi-laringe e sua montagem do tubo de fornecimento de ar, como referenciado na seção anterior, são apresentadas na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.
Documentação da vibração da prega vocal de dois ângulos de câmera
Induzida pelo fluxo de ar auto-sustentável oscilação da prega vocal hemi-laringe foi documentada de cima e do lado com dois sincronizados, câmeras de vídeo de alta velocidade (HSV) operadas a 6.000 quadros/s, complementado por tempo-síncrono gravações do acústico e electroglottographic (veja abaixo) dados de amostragem de 44,1 kHz. Mais informações sobre a configuração de aquisição de dados incluindo uma lista dos equipamentos utilizados podem ser encontradas em publicações anteriores por este grupo de autores 27,28. Imagens destas gravações de HSV é mostrada no que o acompanha vídeo. Ainda imagens, extraídas em momentos representativos dentro do ciclo vibratório, são mostradas na Figura 3. A vista superior (metade superior de cada painel) mostra movimento prega vocal medio-lateral, indicando uma glote aberta na Figura 3A, permitindo o fluxo de ar glotal, enquanto na Figura 3B-D a glote está fechada (a prega vocal é em contato completo com a placa de vidro vertical), assim, prender o ar glotal fluir. A vista lateral (metade inferior de cada painel) na Figura 3B-D sugere um grau variável de contato da prega vocal contra a placa de vidro, bem como uma geometria variável e localização vertical de que o contato.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig3.jpg"> Figura 3 : Vibração de prega vocal Hemi-laringe. (A-D) Imagens de imagens de vídeo de alta velocidade do topo (metade superior de cada painel) e as câmeras de visão lateral (metade de cada painel inferior), extraído em representante pontos dentro do ciclo vibratório. Observe a ausência da prega vocal contato no (A), e o (ambos na área, forma e posição) variando vocal fold contato (B-D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55303/55303fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Análise de movimento glotal kymographic
Análise quantitativa de movimento glotal é ilustrado na Figura 4. A glote é a variável de abertura entre a (vibração) pregas vocais29, criado por seus desvios durante a oscilação auto-sustentado. Análise do estado da arte da vista superior filmagens HSV permite rastrear os desvios laterais de pregas vocais30,31. A preparação de hemi-laringe descrita aqui adiciona a possibilidade de também avaliar os aspectos (anteriores craniana) verticais da vibração da prega vocal.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig4.jpg"> Figura 4 : Análise de movimento glotal kymographic. (A) e (B) vídeo stills mostrando vistas superiores e laterais da laringe-hemi, tirado de gravações de vídeo de alta velocidade do (HSV) em 6.000 quadros/s. As linhas verticais amarelas indicam a posição da linha de varredura de kymographic para os kymograms mostrado em painéis C e E para a vista superior e painéis D e F para a vista lateral. (C) e kymograms (D) Digital extraídos as filmagens HSV de topo e a vista lateral, respectivamente. (E) o deslocamento lateral da prega vocal, variáveis no tempo extraído do kymogram e rastreados com uma linha (traços curtos). (F) os desvios de variáveis no tempo das bordas inferiores e superiores da prega vocal, avaliados a partir do kymogram e rastreados com um tracejado e uma linha pontilhada, respectivamente. (G) Descrição sinóptica das estruturas glotais variáveis no tempo: deflexão de prega vocal Lateral (violet "top", pálido) e deflexão vertical do superior ("sup. de lado", vermelho escuro) e inferior ("lado inf", verde-escuro) vocal dobre bordas extraídas os kymograms mostrados nos painéis E e F. velocidades de movimento (H) derivadas dos dados de deslocamento glotal estrutura mostrados no painel G. (eu) e (J) reconstrução de movimento glotal derivado a partir dos dados de deslocamento do superior e margens inferior prega vocal mostradas no painel G. As setas indicam a direcção do movimento rotacional. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55303/55303fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dois kymograms Digitas foram gerados do superior ou lateral Vista dados HSV (figuras 4 e 4 D). Em um kymogram digital (DKG)32,33,34,35, os dados de pixel de uma única linha (normalmente no ponto de prega vocal máxima amplitude vibratória), tirado de um número de consecutivos de alta velocidade quadros de vídeo, são concatenados para formar um eixo temporal na abcissa. O deslocamento variáveis no tempo das estruturas cobertas pela linha de varredura DKG é visível na ordenada. No exemplo mostrado na Figura 4-F, o DKG digitalizar posições de topo de linha e vista lateral foram selecionados pela metade ao longo da dimensão (ventro-dorsal) antero-posterior da prega vocal, utilizando a abordagem descrita por Hampala et al., EQ. 127.
Os desvios laterais e anteriores-craniana da glote, delineado pelas bordas inferiores e superiores de prega vocal, foram rastreadas dentro dos dados DKG (figuras 4E e 4F) e expressos em unidades métricas, baseadas na informação de calibração e taxa do frame de vídeo incorporada em os vídeos (Figura 4 e H). Uma reconstrução do bidimensional movimento glotal (lateral e vertical) no meio da prega vocal (ou seja, o lugar da máxima amplitude vibratória) ao longo de três ciclos completos de glotais é mostrado na Figura 4E e F. Durante a maioria do ciclo glotal, a prega vocal estava em contacto com a placa de vidro (representando o fechamento glotal), mas com profundidade variando de contato. Durante a fase aberta (i. e., quando a prega vocal não está em contacto com a placa de vidro), os traços do vocal superior e o inferior dobram fusível de borda e eles exibem um padrão complexo movimento cíclico, em parcial acordo com resultados de outros estudos 5 , 20 , 36 , 37 (o padrão de movimento encontrado nos seres humanos tende a ser mais elíptica do que o espécime de red deer investigado aqui). Curiosamente, o deslocamento vertical atingiu uma amplitude vibratória de aproximadamente 10 mm, ou seja, quase uma ordem de magnitude maior do que o que foi encontrado em seres humanos.
Área de contato de avaliação da prega vocal
Electroglottography (ovo)38 é um método não invasivo utilizado para medir as mudanças na área de contato de prega vocal relativo (VFCA) durante a fonação. De fraca intensidade, corrente de alta frequência é passada entre dois eletrodos colocados ao nível da prega vocal em cada lado da laringe. As variações de admissão resultante da prega vocal (de) contactar durante a produção de som da laringe são em grande parte proporcionais a prega vocal relativa tempo-variando entre em contato com a área39. O sinal do ovo é considerado um correlato fisiológico confiável da vibração da prega vocal, refletindo a frequência fundamental e o regime oscilatório (irregular ou periódico, incluindo bifurcações). Apesar de sua ampla aplicação, a possível relação direta entre o VFCA e a forma de onda do ovo, até recentemente, só foi testada em um único estudo17, sugerindo uma relação aproximadamente linear entre VFCA e a magnitude do sinal de ovo. No entanto, a vibração da prega vocal induzida pelo fluxo não foi investigada nesse estudo. Portanto, uma rigorosa avaliação empírica de ovo como uma medida de VFCA relativo sob condições fisiológicas, portanto, ainda era necessário.
Abordando esse assunto, este grupo de autores investigou recentemente três larynges de veado vermelho em uma preparação de hemi-laringe extirpado utilizando uma condução de placa de vidro27. O tempo de contato variando entre a prega vocal e a placa de vidro foi monitorado por gravações de vídeo de alta velocidade, feitas no plano sagital em 6000 fps, sincronizados com o sinal de ovo com uma precisão de ± 0.167 MS. representante resulta de que estudo são mostrados na Figura 5, indicando uma média de boa concordância entre o sinal de ovo e VFCA – ver referência27 para detalhes).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55303/55303fig5.jpg"> Figura 5 : Comparação da área de contato de prega vocal (VFCA) e electroglottographic (ovo) forma de onda. (A-D) Vídeo fotos do dados de vídeo de alta velocidade, mostrando a visão lateral de uma veado vermelho hemi-laringe em quatro instantes dentro de um ciclo glotal. A área de contato manualmente avaliados prega vocal (ou seja, a área onde a prega vocal estava em contacto com a placa de vidro vertical na configuração da hemi-laringe) é sobreposta em ciano. (E) a comparação de dados normalizados de ovo e VFCA para a fase de contato de prega vocal de um ciclo glotal. Os dados VFCA que resultou da avaliação vocal dobram a área de contato (contada em pixels) ao longo do ciclo glotal. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55303/55303fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Este trabalho apresenta um protocolo para a preparação de espécimes de hemi-laringe facilitando uma visão multidimensional da vibração da prega vocal, a fim de investigar vários aspectos biofísicos da produção de voz em seres humanos e mamíferos não-humanos.

Hemi-laríngeo Setup para o estudo da vibração da prega Vocal em três dimensões

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

hemi-laryngeal-setup-for-studying-vocal-fold-vibration-three

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

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Vídeo: Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Sintéticos, Multi-Layer, auto-oscilante Fabricação Modelo Vocal Fold

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Bioengenharia

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biologia

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigando a separação de fluxo tridimensional induzida por um polip de dobra vocal modelo

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Impressão 3D de modelos de pregas vocais de silicone multicamadas

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Autor em destaque: Avanços na fabricação de modelos sintéticos de pregas vocais para aplicações fonéticas e robóticas

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Processo de Fabricação para Modelos de Pregas Vocais Supermacias Não Aderentes

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Engenharia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Hemi-laríngeo Setup para o estudo da vibração da prega Vocal em três dimensões

Resumo

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