Name: techniques for imaging prometaphase and metaphase of meiosis i in fixed drosophila oocytes
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes at JoVE.com

We thank Christian Lehner for providing the CENP-C antibody and Eric Joyce for recommendations on FISH. Work in the McKim lab was funded by a grant from NIH (GM101955).

Nota: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra maneira. incubadoras de temperatura controlada são usados ​​para manter as temperaturas para criação mosca e cruza salvo indicação em contrário. 1. Preparações <ol><li> Prepare Moscas. <ol><li> Prometáfase enriquecido coleções de ovócitos. <ol><li> Limpar moscas adultas a partir saudáveis, jovens de ações ou transversais culturas. garrafas de idade para dois dias a 25 ° C. Nota: Geralmente duas garrafas saudáveis ​​serão suficientes, embora mais podem ser necessários para algumas culturas cruzadas. </li><li> Após dois dias, recolher ~ 100 a 300 (fêmeas que são 0 a 2 dias de idade, neste ponto) de garrafas. As fêmeas não precisa ser virgens. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocá-30 fêmeas e 10 machos e 15 cada um em frascos yeasted. frascos de idade para dois dias a 25 ° C. </li></ol></li><li> Metaphase enriquecido ovócitos Collections. <ol><li> Recolha ~ 100 a 300 fêmeas de estoque ou cross cultures. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocar cada 30 fêmeas (sem machos adicionados) para dentro de frascos yeasted. frascos de idade para três a cinco dias a 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare Solutions. Nota: As soluções podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra maneira. <ol><li> Preparar tampão de modificação de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de sacarose, acetato de sódio 275 mM, acetato de potássio 200 mM, glicose 50 mM, cloreto de magnésio a 6 mM, e cloreto de cálcio 5 mM. Use 10 N 11: 8 de hidróxido de sódio: hidróxido de potássio para trazer o pH para 7,4. Esterilizar por filtração; Não autoclave. Armazenar a -20 ° C. Descongelar conforme necessário para preparar ~ 200 ml de 1x Robb por ovócitos prep. </li><li> Fixação Solutions. <ol><li> Opção # 1: Prepare formaldeído / fixação heptano. Preparar tampão de fixação: solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS), mais 150 mM de sacarose. Para usar, faça fresco com 687,5 ul Fixação de buffer e 312,5 mL de 16% de formaldeídopor prep oócito. CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formaldeído em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Opção # 2: Preparar o formaldeído / fixação cacodilato. Prepare a mistura Fix: sacarose 250 mM, acetato de potássio 100 mM (pH 7,5), acetato de sódio 25 mM (pH 7,0), e EGTA 25 mM (pH 8,0). Para usar, faça fresco com 400 ul Fix Mix, 100 cacodilato ul de potássio (1 M, pH 7,2), e 500 mL de 16% de formaldeído por prep oócito. CUIDADO: cacodilato de potássio contém arsênico. </li></ol></li><li> Prepare PBS / Triton X-100: 1x PBS mais 1% ou 0,05% de Triton X-100. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare PBS-Tween 20 Albumina de Soro Bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, BSA a 0,5% (w / v) e 0,1% de Tween-20. Pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana. </li><li> A fluorescência in situ fluorescente (FISH) Soluções. <ol><li> Prepara-cloreto de sódio 20X Citrato de sódio (SSC): 3 M de cloreto de sódio e citrato de sódio 0,3 M. </li><li> Prepare 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2 x SSC mais 0,1% de Tween-20. Faça frescas, ~ 20 ml por prep oócito. </li><li> Preparar soluções de formamida: 2 x SSC, 0,1% de Tween-20, além de formamida. Adicione fresco, 1 ml de 20% de formamida, 0,5 ml de formamida a 40%, e 2 ml de formamida a 50% por preparação de oócitos. CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formamida em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Preparar a solução de hibridização: 2 x SSC, formamida a 50%, e 10% de sulfato de dextrano (w / v). Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Sondas peixe. <ol><li> Oligonucleotídeos ordem (ver Tabela 1 para sequências) com HPLC e desejado 5 &#39;modificação fluorescente (por exemplo, Cy3 ou Cy5). Ressuspender em Tris-EDTA (TE) a 50 ng / ul. NOTA: Proteja oligos da exposição à luz em todos os momentos. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Recolha de tarde-estágio Drosophila Oócitos <ol><li> Como <em&gt; oócitos de Drosophila com membranas íntegras vai ficar com plástico e vidro, pré-revestir o interior de um tubo de 5 ml e uma pipeta de Pasteur por prep ovócito com PTB. </li><li> Anestesiar todos os ~ 100 a 300 moscas yeasted com dióxido de carbono e adicionar a um misturador contendo ~ 100 ml de 1X tampão de Robb. Pulso três vezes (~ 1 segundo cada). Mantenha oócitos em Robb para &lt;20 min para evitar a activação. NOTA: Como alternativa, os oócitos podem ser mão-dissecados das fêmeas. A vantagem deste método é que ele exige menos fêmeas. No entanto, os cuidados devem ser tomadas para limitar a exposição ao dióxido de carbono para apenas alguns minutos para evitar erros associados à hipóxia 7. </li><li> Filtrar através de malha grande (~ 1.500 mm) em 250 ml copo para remover partes do corpo grandes. Se muitos abdomens intactas permanecer no material de malha, re-moagem usando adicional buffer de Robb e filtro novamente. Vamos resolver ~ 2 min, em seguida, aspirar off camada superior, removendo como muitos dos grandes partes do corpo quanto possível. </li><li> Filtro através de malha pequena (~ 300 uM) para uma proveta de 250 ml. Lavar ovócitos restantes fora do primeiro copo usando adicional de Robb e revestido Pasteur pipeta. Vamos settle ~ 3 min; oócitos vai resolver fora. Aspirar off todos, mas ~ 10 ml. </li><li> Despeje o máximo de 10 ml como se encaixam em revestido tubo de 5 ml. Vamos resolver, remover o líquido, e repita com o restante. Lavar ovócitos restantes fora do copo usando Pasteur pipeta adicional de Robb e revestido. Vamos resolver em 5 ml tubo para ~ 3-5 min. </li></ol> 3. Os tratamentos medicamentosos (Opcional) <ol><li> Revestimento de um segundo tubo de 5 ml com PTB para cada prep oócito. Adicionar solvente apropriado (controle) ou de drogas para 1 ml de Robb cada oócito para cada preparação (Tabela 2). </li><li> oócitos dividida em segunda revestido tubo de 5 ml. Vamos Settle, remover o líquido e adicionar 1 ml Robb das mais solventes em um tubo e 1 ml Robb de mais droga no segundo tubo. Nutar para a quantidade de tempo apropriado para o tratamento de drogas (Tabela 2). euet resolver. </li></ol> 4. Fixação <ol><li> Aspirar off todo o líquido e imediatamente adicionar 1 ml Fix. </li><li> Opção # 1: Formaldeído / fixação heptano (Tampão de Fixação mais 5% de formaldeído). <ol><li> Fixar para 2.5 min em um nutator. Adicionar 1 ml de heptano e vortex 1 min. Vamos settle ~ 1 min. </li><li> Retire todo o líquido e, em seguida adicionar 1 ml 1x PBS. Vortex 30 seg. Vamos settle ~ 1 min. </li><li> Retire todo o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS. NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Opção # 2: fixação de formaldeído / cacodilato (Fix Mix mais 8% formaldeído e cacodilato 100 mM). <ol><li> Correção para 6 min em um nutator. Vamos contentar 2 min. Remover o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS. NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Removendo membranas ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Usando revestido pipeta de Pasteur, adicione ~ 500 a 1.000 oócitos para a parte fosco (jacto de areia) de uma lâmina de vidro. Remover todas as partes do corpo e materiais usando uma pinça estranhos. Não deixe oócitos secar; adicionar 1x PBS conforme necessário. </li><li> Coloque uma lamela em cima dos oócitos e gentilmente oócitos &quot;Roll&quot; até que todas as membranas são removidos (arrastando a borda da lamela entre os oócitos funciona melhor.) Verifique periodicamente o progresso sob o microscópio, adicionando mais 1x PBS, conforme necessário. Tome cuidado como muita pressão irá destruir os ovócitos. NOTA: Para imunofluorescência somente, continue com o Passo 6. Para peixes (com ou sem imunofluorescência), continue na Etapa 7. </li></ol> 6. Coloração de anticorpos de Drosophila Oócitos <ol><li> Extração e Bloqueio <ol><li> Lavar oócitos enroladas em um tubo cónico de 15 mL contendo ~ 15 mL de PBS / 1% de Triton X-100. oócitos nutar nesta solução por não menos do que 1,5 horas e não mais do que 2 h.Este passo permite a penetração do anticorpo. </li><li> Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remover o líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível, em seguida, adicionar PBS / 0,05% de Triton X-100. NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados. </li><li> Deixe oócitos resolver ~ 2 min, em seguida, remover todos, mas ~ 1 ml de líquido. oócitos de transferência para se formou 1,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Adicionar 1 ml de TBP para o bloqueio e nutar durante 1 h. </li></ol></li><li> coloração de anticorpos <ol><li> Pré-absorção de anticorpos secundários contra embriões. NOTA: Este passo elimina a coloração de fundo a partir de interações de anticorpos não específicos com proteínas de Drosophila. <ol><li> Recolher e corrigir embriões de Drosophila (~ 25 ul) por típico procedimento 8. Armazenar em metanol a -20 ° C. </li><li> Remover o metanol a partir de embriões, adicionar 800 mL de metanol, com 200 ul de 1x PBS, e nutar durante 15 min. Retirar 500 ul de sobrenadante e substituir com 500 ul de PBS 1x. Então nutar para 15 min. Repita duas vezes (para um total de ~ 1 hr de lavagens), e depois terminar no PTB. NOTA: Os embriões podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator por várias horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o líquido, encher com PTB para 200 mL por prep oócito, e adicionar anticorpos secundários fluorescente-etiquetados em diluições adequadas (tendo em mente que o volume final será de 300 ul;. Consulte o passo 7.4) nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. NOTA: Os anticorpos pré-absorvida irá ser utilizado no Passo 6.2.4. NOTA: Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados. </li></ol></li><li> Remover o líquido a partir de oócitos, encher com PTB até 300 ml, e adicionar anticorpos primários nas diluições apropriadas. Nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. </li><li> Lavar oócitos quatro vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB. </li><li> Removerlíquido a partir de oócitos, adicionar 200 ul de sobrenadante a partir de embriões pré-absorvida (anticorpos secundários). Em seguida, preencha com PTB para 300 l. Nutar à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas (preferivelmente) ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 1 ml PTB, remover o líquido. Em seguida, adicione 0,5 mL Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar para 7 min. </li><li> Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB. NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até estar pronto para a imagiologia. </li></ol></li></ol> 7. FISH (Continue a partir do passo 5 acima) <ol><li> Lavar oócitos enroladas em um tubo cônico de 15 ml contendo ~ 15 ml 2x SSCT. Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remova todos, mas ~ 0,5 ml de líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível. NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados. </li><li> Transferência de oócitos para 0,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Sucessivamente adicionar e remover 500 mL20%, 40%, 50% e soluções de formamida, de nutação durante 10 minutos em cada solução. NOTA: Os oócitos vai resolver mais lento com maiores percentagens de formamida. </li><li> Remover o líquido, em seguida, adicionar solução de formamida a 500 ul de 50%, e nutar a 37 ° C durante 1 a 5 horas. NOTA: Longer incubações resultar em uma melhor penetração da sonda. </li><li> Remover o líquido, deixando para trás nada mais do que ~ 100 ul de oócitos, e adicionar 36 ul de solução de hibridação mais 2 ul de sonda (50 ng / mL) e 2 mL de água ou 2 mL de uma sonda 2 ND (Tabela 1). </li><li> Incubar a 91 ° C durante 3 min (apenas FISH) ou 80 ° C durante 20 min (FISH e de imunofluorescência), seguido por incubação num banho de água a 37 ° C durante a noite. NOTA: Estes passos podem ser efectuados num termociclador. </li><li> Não remover o líquido. Adicionar 500 ul de solução a 50% de formamida e nutar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Vamos Settle, remover o líquido, adicione a solução de formamida 500 mL de 50%, umd nutar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Vamos assentar, remover o líquido, adicionar solução de formamida a 500 ul de 20%, e nutar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Execute três lavagens rápidas em 500 ul 2x SSCT (vamos Settle, remover, em seguida, adicione o líquido, inverter várias vezes, repetir.) Vamos Settle, remover o líquido, em seguida, adicionar 500 mL PTB e nutar durante 4 h. </li></ol> 8. Coloração de anticorpos após FISH <ol><li> Remover o líquido a partir de oócitos, encher com 300 uL de TBP, e adicionar anticorpo anti-tubulina α 10 ul conjugado com FITC. Alternativamente, outros anticorpos podem ser utilizados, seguindo o protocolo acima. Nutar à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 500 uL PTB, remover o líquido, em seguida, junta-se 0,5 ul de Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar durante 7 min. </li><li> Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 500 ul PTB. NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até pronto para serimagiologia. Mantenha oócitos no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Repita Nome </td><td fo:width="1in"> Cromossoma </td><td> Seqüência Oligo * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeca </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 sequência de Eric Joyce, comunicação pessoal, outras sequências de Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabela 1: sondas de peixe para repete centroméricas de Drosophila. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Solvente </td><td> da concentração </td><td> A concentração final </td><td> Tempo de tratamento </td><td> Efeito </td></tr><tr><td> colchicina </td><td> etanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 uM </td><td> 10 min ou 30 min </td><td> desestabilizar não cinetocoro (10 min), 9 ou todos os microtúbulos (30 min) </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td> 10 min </td><td> estabilizar microtubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 uM </td><td> 20 min </td><td> inibir Aurora B quinase 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: O tratamento medicamentoso.

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The authors have nothing to disclose.

Staging Drosophila Oócitos Embora um cariossomo alongada é muitas vezes visto em oócitos prometáfase, usando cariossomo forma de distinguir prometáfase a partir de oócitos metafase pode ser problemático. Durante prometáfase, o cariossomo começa como uma forma redonda, alonga, e, em seguida, se retrai para uma forma redonda como o oócito se aproxima da prisão metáfase. Isto significa que muitos oócitos prometáfase não tem uma cariossomo alongado. Além disso, se os oócitos mutantes ou tratados com fármaco são examinados, cariossomo forma pode ser afectada, se opõe a utilização deste método para a fase oócitos. Uma vez que outros marcadores para distinguir estas fases não estão disponíveis no momento, que utiliza o método acima descrito para manipular a velocidade de postura de ovos de fêmeas de Drosophila para enriquecer em oócitos quer em prometáfase ou metafase. O raciocínio é que, se oócitos passar um determinado período de tempo em prometáfase, e uma quantidade indefinida de tempo arrresse em metáfase, que dura até de postura, então mais rápido postura de ovos irá inclinar em direção a uma maior percentagem de oócitos prometáfase, enquanto mais lento postura de ovos irá enriquecer para metáfase. A quantidade de esforço necessário para recolher fêmeas virgens ou coletar mulheres ao longo de um período de tempo mais curto do que 2 dias, como descrito por Gilliland et al. 6, não é recompensado por um aumento apreciável em oócitos prometáfase. Também é impossível usar os apêndices dorsais para encenar oócitos preparados com este protocolo como apêndices dorsais são removidos juntamente com as membranas. Embora não seja possível para a fase oócitos individuais com 100% de certeza utilizando este método, os dados de prometáfase enriquecido ou colecções enriquecido em metafase pode ser tomados em conjunto para tirar conclusões sobre estas diferentes fases 9. Oócitos de Drosophila não são fertilizados até que eles passam através do oviducto; portanto, porque os ovócitos recolhidos para the protocolos descritos aqui examinar oócitos tomadas antes postura de ovos, esses ovócitos não foram fertilizados. A passagem através do oviducto também faz com que o oócito para activar e retomar a progressão do ciclo celular. Métodos para examinar as fases do ciclo celular após metaphase eu existo 11,12, mas estão fora do âmbito deste protocolo. Considerações método de fixação Nós descrevemos dois métodos distintos para a fixação do estágio final de ovócitos de Drosophila. O método de fixação de formaldeído / cacodilato foi primeiramente descrita por Theurkauf e Hawley 3 e o método de fixação de formaldeído / heptano foi primeiramente descrita por Zou et al. 4. Além disso, um terceiro método (fixação metanol) é usado cerca de 13, mas não descritas aqui. A remoção das membranas de oócitos é um pouco mais difícil após fixação formaldeído / heptano em relação ao formaldeído / cacodilato. Isto porque &quot;rolling&quot; dependerás no atrito entre a lamela e de oócitos, e formaldeído fixação / heptano faz com que os oócitos mais escorregadia. Apesar desta dificuldade adicional, a nossa primeira escolha do método de fixação ao testar novos anticorpos é formaldeído / heptano porque ele funciona melhor para a maioria dos anticorpos que temos tentado. Por outro lado, prefere-se o formaldeído / cacodilato de fixação para os peixes, primeiramente para a facilidade de remoção da membrana, embora a fixação de formaldeído / heptano também tem sido bem sucedida. Ambos os métodos preservar a morfologia do oócito melhor do que a fixação de metanol, e, portanto, recomendamos a fixação metanol apenas nos casos de anticorpos que são refratários ao métodos de fixação à base de formaldeído. Os protocolos descritos aqui em foco de imagem fixa, de modo a demonstrar métodos eficazes para render oócitos maduros Drosophila passíveis de penetração de anticorpos, ou seja, através da remoção das membranas de oócitos. Métodos alternativos para a remo membranaval (usando uma pinça 14 ou sonicação 13) são possíveis; No entanto, encontramos &quot;rolar&quot; a ser o método mais eficiente e confiável. Técnicas de imagem ao vivo também têm sido descritos em outros lugares 14-16 e estão fora do âmbito deste protocolo. Recomendações PEIXES FISH em oócitos de Drosophila foi descrito originalmente por Dernburg et al. 5. Este protocolo foi concebido para proporcionar condições ideais para a hibridação sonda para os cromossomas de ovócitos condensadas, mas o protocolo original não era ideal para imunofluorescência. O método descrito acima inclui adaptações que fizemos para aumentar a coloração de anticorpos de α-tubulina, que é essencialmente o que usamos na realização de FISH. Para outros anticorpos, diminuindo a temperatura do passo de desnaturação (Passo 7.5) a partir de 80 ° C pode ser necessário. As sondas são listadas aqui para oseqüências repetitivas no heterocromatina perto dos centrômeros. Porque estas sequências são altamente repetitiva, as sondas emparelhar com vários lugares e os sinais coletivos são bastante fortes. Temos tido pouco sucesso com sondas para sequências na eucromatina, possivelmente devido à estrutura única dos cromossomas, enquanto contida na cariossomo condensado. imagiologia Oócitos Drosophila maduros, como os ovócitos da maioria dos organismos, são células grandes, único. Isto significa que existe um grande volume de citoplasma que contém um único núcleo. Felizmente, este núcleo, também conhecido como um cariossomo em Drosophila, pode ser prontamente identificado uma vez que está normalmente localizado a apenas sob os apêndices dorsais junto ao córtex. Os apêndices dorsal são removidos juntamente com as membranas de oócitos, mas o cariossomo ainda pode ser localizado encontrando o pequeno torrão no córtex oócito onde os apêndices ódno foram. As melhores imagens são obtidas a partir de oócitos que foram montados com este torrão de frente para a lamela uma vez que este coloca o cariossomo mais próximo do objectivo. Embora possa ser possível organizar os oócitos Nesta orientação antes da montagem, prefere-se montar muitos oócitos aleatoriamente e então procurar o diapositivo para aqueles na orientação preferida. Aplicações futuras No futuro, será importante para identificar marcadores que distinguir de forma confiável prometáfase I e metaphase fusos I. Ser capaz de organizar de forma mais confiável os oócitos irá reduzir a dependência de mais alternativas de trabalho intensivo, tais como imagiologia grande número de oócitos enriquecido em palco ou imagens ao vivo, o que também tem os seus problemas de teste. Este método é um método de base, que pode ser usado para tirar partido dos avanços no campo da genética de Drosophila como novas ferramentas tornam-se disponíveis para modificar ou knock out produtos de genes. Isto inclui métodosde alvejar diretamente a atividade da proteína com novas drogas ou estratégias de degradação alvejados. Além disso, estes métodos não estão limitados a imagiologia de eixos meióticos. Qualquer estrutura dentro do oócito, tais como o citoesqueleto de actina, podem ser analisados ​​utilizando estes métodos.

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster1. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.
Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans2. A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.
We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley3, Zou et al.4, and Dernburg et al.5. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.6. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>HAZARDOUS; once opened, discard after one month</td></tr><tr><td>250 ml beakers</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>active dry yeast</td><td>Various</td><td></td><td>mix with water to make a paste the consistency of peanut butter</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody conjugated to FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>clone DM1A</td></tr><tr><td>Binucleine 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>blender</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicine</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>dextran sulfate</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont tweezers high precision grade style 5</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>glass slides</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>graduated 1.5 ml tubes</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>available from several venders</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>large mesh (~1,500 &amp;micro;m)</td><td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh</td></tr><tr><td>small mesh (~300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>variety of formats, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 146 422 or 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipets</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>potassium acetate</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylic acid</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted</td></tr><tr><td>potassium hydroxide</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium acetate</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium citrate</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for imaging prometaphase and metaphase of meiosis i in fixed drosophila oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Os métodos que descrevemos aqui resultará na coleta de oócitos em estágio final de Drosophila representam três fases da meiose (Figura 1). Os oócitos na profase distinguem-se pela presença do envelope nuclear, que é visível pela falta de sinal de tubulina na região em torno do cariossomo (Figura 1A). Prometáfase é o período após nuclear quebra envelope durante o qual os monta fuso. Durante prometáfase, o cariossomo assume uma forma distinta, tornando-se alongado muitas vezes com o 4º cromossomos Além dos principais massa cariossomo (Figura 1B). Prometáfase conclui com metáfase, na qual oócitos Drosophila naturalmente prender até a ovulação. Em oócitos metafase, o cariossomo tenha se retratado em uma forma redonda (Figura 1C). Descrevemos aqui métodos para manipular a velocidade de postura de ovos das fêmeas de Drosophila para enriquecer oócitos quer em prometáfase ou metáfase. Oócitos de prometáfase enriquecidas coleções com freqüência mostram a cariossomo alongada (Figura 2A), enquanto coleções metafásicas enriquecido ou coleções de fêmeas virgens de Drosophila, que eliminam quase completamente postura de ovos, mostram principalmente o cariossomo round (Figura 2B). Curiosamente, prometáfase enriquecidas coleções mostram também tipicamente muito mais robusto fusos, sugerindo que tanto a mudança cariossomo eo eixo entre prometáfase e metaphase em Drosophila oócitos 9. A Figura 3 mostra imagens representativas dos dois protocolos descritos aqui. Os anticorpos contra α-tubulina (para mostrar o eixo), CENP-C (para mostrar centrómeros), e INCENP (para mostrar o eixo central) foram utilizados em oócitos fixo com formaldehyde / heptano (Figura 3A). As sondas para as sequências centroméricos repetitivas no cromossoma 2 ND (AACAC) e 3 rd cromossoma (Dodeca) foram usadas em oócitos fixas com formaldeído / cacodilato e co-coradas com um anticorpo α-tubulina de acordo com o protocolo de FISH (Figura 3B). A sonda AACAC aparece como vários focos de cluster enquanto a sonda dodeca aparece como um único foco por cromossomo. Os oócitos tratados com colchicina 150 uM durante 10 min foram fixados com formaldeído / heptano (Figura 3C). Este tratamento elimina a maioria dos não-cinetócoro-microtúbulos, o que resulta em todos os microtúbulos em contacto com o ADN em focos marcado com centrómero. Os oócitos tratados com paclitaxel a 10 uM durante 10 min mostrar microtúbulos excessivas no citoplasma, mas pouco efeito sobre os microtúbulos do fuso (Figura 3D). Oócitos tratados com 25 mM Binucleine 2 por 20 min para inibir a perda de Aurora B quinase show completo demicrotúbulos fusiformes (Figura 3E). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54666/54666fig1.jpg" /> Figura 1: Três fases de oócitos maduros Drosophila:. Prophase, Prometáfase e Metaphase imagens confocal de oócitos de Drosophila em prophase (A), prometáfase (B) e metáfase (C) do DNA da meiose I. é mostrado em azul e tubulina é mostrado em verde em imagens fundidas. As inserções em (B) e (C) mostram ADN em branco. Barras de escala = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54666/54666fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54666/54666fig2.jpg" /> Figura 2:Prometaphase- vs. coleções metafásicas enriquecido de oócitos de Drosophila. Imagens confocal de oócitos de Drosophila de prometáfase enriquecido (A) ou coleções enriquecido em metáfase (B). DNA é mostrado em azul e tubulina é mostrado em verde. Barras de escala = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54666/54666fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54666/54666fig3.jpg" /> Figura 3: coloração de anticorpos, peixe e drogas tratamentos de oócitos Drosophila imagens confocal de oócitos de Drosophila com DNA em azul e tubulina no verde.. Barras de escala = 10 uM. (A) Imunofluorescência em formaldehyde / heptano fixação com INCENP (eixo central) em vermelho e CENP-C (centrômeros) em branco. (B) FISH na fixação de formaldeído / cacodilato com AACAC mostrado na dodeca vermelho e mostrado em branco. (C) O tratamento com 150 colchicina M para 10 min com CENP-C mostrada em vermelho. O tratamento com paclitaxel 10 mM durante 10 min (D) ou 25 mM Binucleine 2 para 20 min (E). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54666/54666fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

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Universidad San Sebastian

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Molecular Biology

Biology

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Unit 2

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K visualizações.  Rutgers University. We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Vídeo: Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Biologia do Desenvolvimento

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biologia

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

Migração Nuclear no Oócito de Drosophila

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane

Source: Radford, S. J., McKim, K. S. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54666/" target="_blank">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes</a>. J. Vis. Exp. (2016).
Immunostaining of Drosophila late-stage oocytes can prove challenging due to the oocytes&#39; surrounding membranes. This video describes a high-throughput method for obtaining oocytes, their fixation, and membranes&#39; removal for immunostaining. The featured protocol demonstrates these techniques with late-stage oocytes used to visualize different stages of meiosis.

Preparação de oócitos fixos de Drosophila para imunocoloração: um método de alto rendimento para fixar e remover a membrana externa

Source: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
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Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed

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