Name: phagosome migration and velocity measured in live primary human macrophages infected with hiv-1
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1 at JoVE.com

We thank Dr Jamil Jubrail for reading the manuscript. This work was supported by grants from CNRS, Inserm, Universit&#233; Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for GLB) and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales (ANRS, including a post-doctoral fellowship for CD) to FN. A. Dumas was supported by doctoral fellowships from Universit&#233; Paris Descartes and Sidaction.

O protocolo tem de ser efectuada em estrita conformidade com as legislações nacionais e internacionais e regulamentos locais. O sangue de doadores saudáveis ​​que deram o seu consentimento para doar sangue para fins de pesquisa foi obtido a partir de centros de transfusão de sangue com o qual as instituições assinaram acordo. protecções especiais devem ser tomados ao usar sangue humano. As experiências com o HIV-1 deve ser realizado em um nível de segurança biológica, ou 2 3 (BSL-3 ou 2) laboratório de acordo com a legislação local. 1. Preparação de macrófagos humanos Monócitos-derivados (hMDMs) por centrifugação em gradiente de densidade e por adesão Selecção <ol><li> Comece com o sangue fresco de dadores saudáveis ​​(9 mL). Dilui-se todo o volume de sangue fresco com 1x estéril salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+ para se obter um volume final de 70 ml e adicionar cuidadosamente o sangue diluído em dois tubos de 50 mL cónicos (35 mL por tubo) , no topo de 15 ml de umaeutral, altamente ramificado, de elevada massa, polissacárido hidrófilo na solução já em cada tubo. </li><li> Centrífuga ambos os tubos de sangue a 537 xg durante 20 min a 20 ° C sem travão. Em seguida, recolher as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contidos no anel célula nebuloso na interface e transferi-las para um novo tubo de 50 ml contendo 15 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em 45 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+, e contar as células por diluição para uma diluição final de 1/200 em azul de tripano. </li><li> Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina e 100 ug / ml Penicillin-estreptomicina a ter 7 x 10 6 PBMC por cavidade em 2 ml de meio em cada poço de uma placa de 6 bem. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 h. Após 2 h os monócitos vai aderiram ao plástico. </li><li> Para permitir que os recém-isolados monócitos de se diferenciar em hMDMs, Aspirar o meio e substitui-la com 2 ml hMDM meio (RPMI 1640, 10% descomplementado Soro Fetal de Vitela (FCS), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado com factor de estimulação do macrófago humano recombinante Colony (RHM-CSF), a uma concentração final de 10 ng / ml. </li><li> Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 11 dias (Figura 1). </li><li> No dia 11, remover o meio e lava-se 2 vezes com 2 ml de meio por poço hMDM frio. De seguida, lavar cada poço 2 vezes com 1 ml de PBS frio 1x. </li><li> Para retirar hMDMs totalmente diferenciadas, lavar cada poço 1 hora com 1 ml de PBS frio 1x com ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incuba-se as células em 2 ml de PBS frio 1x com EDTA 2 mM por poço, durante 15-60 min a 4 ° C. NOTA: Os métodos alternativos para separar existem as células (por exemplo, tripsina ou atividades de tripsina-like) que possa dar bons resultados 11. </li><li> Depois de descolamento (concluído com cuidado pipetando cima e para baixo no poço), recolher as células e colocá-los em um tubo de 50 ml de gelo contendo 10 ml de meio hMDM frio. </li><li> Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de meio frio hMDM, e contar as células por diluição de 1/20 em azul de tripano. </li><li> Semear as células a 1 x 10 6 hMDMs por 35 milímetros de vidro da classe microscopia prato inferior e incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 1 dia. </li></ol> 2. Produção e quantificação do VIH-1 reservas virais NOTA: NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP (Green Fluorescent Protein) carregando um envelope R5-trópico, presente de M. Schindler 10 é utilizado para infectar macrófagos e células infectadas para ver em tempo real. <ol><li> Produção de reservas virais através de transfecção de células humanas embrionárias de rim 293T (2 x 10 6 em 100 milímetros prato) com 6 ug do ADN pró-viral correspondente usando um reagente de transfecção comercial. </li><li> Quantificar a infecciosidade das reservas de vírus com as células indicadoras HeLa TZM-bl (possuindo o gene ß-galactosidase sob o controlo do HIV-1 LTR) utilizando diluições em série dos stocks virais, seguido de uma coloração ß-galactosidase das células e contagem células de azul 12. </li></ol> 3. A infecção de hMDMs com HIV-1 <ol><li> Adicionar o vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) 0,02-0,03 em 1 ml de meio para hMDM hMDMs (células plaqueadas em 1,13). Para controlar poços adicionar apenas 1 ml de meio hMDM e incubar os pratos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 dias (Figura 1). </li><li> No dia 2 lavar as células com hMDM medio 3 vezes e adicionar 1 ml de meio hMDM fresco por prato. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6 dias (Figura 1). </li></ol> 4. Opsonização de ovelhas Glóbulos vermelhos <ol><li> Para a preparação de 7 x 10 6 por placa de SRBCs, lavar os SRBCs duas vezes em 100 ul de solução contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS 1x com centrifugação a 600 x g durante 4 min. </li><li> Ressuspender as SRBCs lavadas com 500 ul de 1x PBS / BSA a 0,1% com IgG de coelho anti-SRBCs a uma concentração sub-aglutinação por 5 ul de SRBCs e incubar com rotação à temperatura ambiente durante 30 min. NOTA: Para determinar a concentração sub-aglutinação de anti-IgG de SRBCs, preparar diluições em série de IgG (concentração de estoque de 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 em 20 ul numa placa de 96 poços. Adicionar 2 x 10 6 SRBCs em 20 ul em cada cavidade e colocar a placa de um quarto escuro durante várias horas. A concentração sub-aglutinação é adiluição do poço imediatamente antes do poço com aglutinação (IgG + SRBCs formando uma rede). </li><li> Após rotação, centrifugar os SRBCs-IgG-opsonizadas a 600 xg durante 4 min e lava-se com 100 ul de 1x PBS / BSA a 0,1%, com centrifugação a 600 x g durante 4 min. </li><li> Ressuspender as SRBCs-IgG-opsonizados em meio pré-aquecido Fenol RPMI sem vermelho suplementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / prato). </li></ol> 5. células vivas Vídeo Microscopy fagocitose Assay <ol><li> Usar um sistema de imagiologia confocal, tais como um sistema de disco giratório equipado com uma câmara de aquecimento a 37 ° C com CO 2 passando através de um frasco com água para a humidificação. </li><li> Ligar a câmara de aquecimento antes da experiência ter a platina do microscópio a 37 ° C antes do início do ensaio de fagocitose. Ligue o microscópio e computador e carregar o software de imagem. </li><li> Otimizar as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, Magnificatião, resolução, etc, para ter pelo menos uma célula por campo e a imagem de um quadro de cada minuto entre 60 a 120 min. NOTA: Aqui, a amostra é fotografada um quadro a cada minuto durante 60 min com 63x lente. </li><li> Coloque o prato de imagem no palco microscópio. Ajustar o foco e o local para encontrar apenas um conjunto de macrófagos infectados pelo HIV-1 no campo. Use as configurações de excitação / emissão adequadas com base no sistema de imagem usados ​​e sonda. Incluir um canal brilhante campo (BF) para observar phagosomes (Figura 1ii). Optimizar a aparência das diferentes imagens de canal, ajustando a percentagem de tempo de exposição a luz e transmitidos. NOTA: Aqui, NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP estava animado usando um laser de 491 nm com 50 ms de tempo de exposição com 20% do laser (Figura 1-I). </li><li> Remover o prato de imagem e adicionar 1 ml de uma suspensão SRBC a 7 x 10 6 / ml SRBCs ao prato (Figura 1). </li><li> Centrifugar a 500 xg durante2 min à temperatura ambiente para sincronizar a fagocitose, registar o tempo no final desta centrifugação e devolver o prato para a fase. </li><li> Optimizar a captura de foco e GFP e imagens BF em z-pilhas (em toda a espessura da célula com um passo a distância de 0,3 um - 20 geralmente planos) a cada minuto durante pelo menos 1 h. Salvar o vídeo de lapso de tempo no arquivo de formato nativo do sistema de imagem utilizado. NOTA: Aqui, os filmes de lapso de tempo foram salvos no formato nativo, arquivos * .stk. </li></ol> 6. Análise da Time-lapse Filmes <ol><li> Para edição de vídeo, clique no menu drop-down &quot;Apps&quot; e na guia &quot;Análise multidimensional de dados&quot; no software de edição de vídeo. <ol><li> Para abrir o arquivo, clique em &quot;Selecionar Arquivo Base&quot;, em seguida, em &quot;Selecionar Directory&quot;. No &quot;Conjuntos de dados&quot;, selecione a aquisição de analisar (em formato .nd) e clique em &quot;Ver&quot;. Os dados são representados numa tabela com o tempo em uma colunad Z-plano na linha. </li><li> Para representar a infecção em um Z-projeção (Figura 2, painéis da esquerda), selecione 491 nm de comprimento de onda na caixa &quot;comprimentos de onda&quot; e clique na aba &quot;Z projecção&quot; com &quot;todos os planos&quot;. </li><li> Para analisar uma seqüência de tempo, selecione o comprimento de onda BF na caixa &quot;comprimentos de onda&quot; e escolha o plano ideal no eixo Z para distinguir SRBCs externos (Figura 2, seta vermelha), SRBCs internos (Figura 2, círculo vermelho) e o núcleo ( Figura 2, círculo azul). </li><li> Para salvar as montagens de vídeo, clique em &quot;Selecção [do X]&quot; e depois em &quot;Load Image (s)&quot;. Por fim, salve as imagens carregadas em formato .tif e abri-los em seguida em software ImageJ. </li></ol></li><li> Use o plugin &quot;Rastreio Manual&quot; no software ImageJ para medir a posição do núcleo e os diferentes phagosomes observadas no canal BF (Figura 3). <ol><li> DowNload o plug-in &quot;Manual de Rastreamento&quot; no site do ImageJ. No ImageJ, abra o plugin e a sequência de imagens a serem analisadas (Figura 3, passo 1 e 2). </li><li> Introduzir as definições tais como &quot;intervalo de tempo&quot; que representa quantidade de tempo entre quadros adjacentes, eo &quot;calibração x / y&quot;, que representa a distância per pixel (Figura 3, passo 3). NOTA: Aqui, guardar a sequência de imagens com um intervalo de tempo de 1 minuto entre cada armação e a calibração x / y de 0,205 uM porque o zoom 63X e uma câmara com tamanho de pixel de 6,45 x 6,45? M 2 são usados. </li><li> Para iniciar o rastreamento, clique em &quot;Adicionar faixa&quot; (Figura 3, passo 4) e clique em um centro de SRBC no primeiro tempo quando é internalizado. O próximo quadro aparece automaticamente. </li><li> Continue a clicar sobre o centro SRBC em todos os quadros de ter posições diferentes durante o tempo (Figura 3, Passo 6 na caixa vermelha). <ol><li> Começar a controlar o núcleo que a sua posição em todos os quadros, clicando em seu centro. Próximo acompanhar os phagosomes (clicando em seu centro), um por um na época (frame) de sua interiorização, diferente em função do SRBCs. Para maior comodidade para ver SRBC no canal BF, use a janela &quot;Brilho e Contraste&quot; durante o acompanhamento (Figura 3, passo 5). </li></ol></li><li> Entre cada rastreamento SRBC, clique em &quot;Adicionar faixa&quot; (Figura 3, passo 4) para ter uma nova pista. O número de rastreamento será alterado na segunda coluna, &quot;Track n °&quot; da tabela de resultados (Figura 3, passo 6). </li><li> Salvar os dados em uma planilha para continuar para a próxima etapa da análise. </li></ol></li><li> Use um software de planilha para calcular a distância percorrida de phagosomes contendo SRBCs para o núcleo e a velocidade dos phagosomes durante os primeiros 5 minutos após a internalização de SRBCs (Fifigura 4). <ol><li> Abra a tabela de folha de cálculo e um novo arquivo de planilha. Transferir para este novo arquivo os seguintes parâmetros somente, tempo, o X e Y coordenadas do núcleo e todos os SRBCs (Figura 4A). </li><li> Para calcular a distância entre o núcleo e SRBCs com apenas as suas coordenadas, considerar o núcleo e uma SRBC num plano XY de coordenadas (Figura 4B). NOTA: A distância entre dois pontos é o comprimento do caminho de os ligar. No plano, a distância entre o núcleo e SRBC é dada pelo teorema de Pitágoras. <ol><li> Se C (a distância entre o núcleo e o SRBC) indica o comprimento da hipotenusa e a e b representam os comprimentos dos outros dois lados, expressar o teorema de Pitágoras como a equação de Pitágoras: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> NOTA: Ao mesmo tempo, no ortonormal, a distância horizontalum é (x núcleo -x SRBC) e a distância vertical b é (Y-Y núcleo SRBC). </li><li> Assim, o cálculo da distância entre o núcleo e o SRBC (Figura 4A, a caixa roxo) por: <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> NOTA: multiplicar o valor de distância obtida (em pixels) por x / y de calibragem ter a distância em uM. Aqui, a calibração x / y é 0,205 uM. </li><li> Em cada tempo, subtrair a distância entre o núcleo e o SRBC à distância inicial (Figura 4C). </li><li> Traça-se a medição em função do tempo para os primeiros 5 min. Aplicar uma linha de tendência linear (Figura 5A) para a trama e determinar a inclinação da linha de tendência linear que representa a velocidade fagossoma para o núcleo durante os primeiros 5 minutos após a internalização SRBC. </li><li> Agrupar os dados para calcular o erro médio e de estatísticaos valores de velocidade e traçar-los em uma forma adequada, utilizando o software apropriado (Figura 5B). </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Esta técnica tem várias etapas críticas. Em primeiro lugar, a preparação de hMDMs e a sua infecção por HIV-1 é crítica, porque a percentagem de infecção é dependente do dador. De nota, decidimos usar macrófagos que não são polarizados in vitro antes da infecção, pois o estado de macrófagos potencialmente encontradas pelo vírus in vivo não foi bem caracterizada medida. Nós verificamos a expressão de vários marcadores de superfície, o que indica que os macrófagos são nem nem M1 M2, e verificou-se a expressão de CD4 e CCR5. As taxas de infecção são variáveis ​​e variam de 10 a 40%, e por vezes inferior. Esta taxa de infecção é variável porque pode ser difícil encontrar um VIH-1 infectado hMDM fluorescente sob o microscópio. Além disso, o tempo necessário para encontrar uma célula infectada com HIV-1, imediatamente após o passo de centrifugação pode também conduzir a um atraso no início da aquisição. Fagocitose poderia ser iniciado sem a synchronizatioN de ligação e absorção gerado por centrifugação. No entanto, esta opção não foi selecionada para SRBCs que flutuam antes de alcançar as células. Poderia ser uma boa opção com miçangas. Para minimizar o tempo necessário para encontrar as células infectadas, os pratos de vidro de fundo em grade pode ser usada para identificar o HIV-1 hMDMs infectadas antes de prosseguir para iniciar o ensaio de fagocitose. As células infectadas pelo HIV selecionados que têm um número &quot;razoável&quot; de SRBCs ao seu redor, então, ser rapidamente escolhido para iniciar as aquisições. &quot;Quantidade SRBC razoável&quot; significa o suficiente para ter pelo menos 10 SRBCs por célula e não são muitas para evitar que os SRBCs externos de mascarar os phagosomes. Além disso, é importante optimizar as condições de opsonização para assegurar que não haverá o reconhecimento e a absorção eficiente pelas células. A fagocitose mediada por FcR é constitutiva e hMDMs são rotineiramente muito eficientes na absorção de FcR-mediada. Além disso, para a fagocitose correcta, as condições têm de be óptimo com a câmara de aquecimento a 37 ° C e 5% de CO 2. É necessário verificar o gás e a temperatura, antes de iniciar o ensaio de fagocitose. Finalmente, a discriminação de SRBCs externos de fagossomas internos e a identificação do núcleo no canal BF são importantes para a análise com o software ImageJ. É por isso que as definições deste canal são importantes. Tendo em conta que o foco pode ser perdido durante a aquisição, recomendamos adquirir pilhas de imagens no eixo Z para ter a certeza de ter o plano ideal para analisar a velocidade fagossomo. É preferível ter uma única célula em um campo para analisar todos os SRBCs internalizados para cada célula. Por isso, a escolha da lente e é importante aqui que ter usado 2 lentes como uma função do tamanho da célula. Era mais fácil para nós para acompanhar phagosomes com uma lente 100X, mas às vezes as células eram muito grandes, então tivemos que mudar para uma lente de 63X. A escolha da lente também é fundamental quando se pensa imanálise da idade usando ImageJ e uma mesa de folha de cálculo, porque ambas as lentes implicam diferentes X / Y calibrações. A primeira limitação desta técnica é o número de amostras que necessitam de ser adquirido a ter resultados estatisticamente significativos. Podemos registrar vários filmes por doadores, mas geralmente não mais de 2 células por condição, por prato. As soluções para esta limitação para aumentar o número de amostras são repetir experiências com mais doadores ou para fazer imagiologia XY multi-ponto, dependendo do microscópio. O inconveniente de o último método é o potencial de perda de foco durante a digitalização XYZ motorizado. Outra limitação é que a quantificação da velocidade Manual é longo e tedioso em comparação com uma análise automatizado. Para a análise automatizado completo, é necessário utilizar partículas marcadas por fluorescência, tal como relatado em estudos pioneiros 4 com esferas de látex acopladas a gelatina de pele de peixe que foram seguidas com um algoritmo de seguimento de software Matlab. Marcado com fluorescência opsonizantes anticorpos ou grânulos pode ser uma alternativa, mas são sujeitas a branqueamento, o que é um problema quando a gravação a fagocitose, durante 1 h. Outros estudos relatam o uso de esferas de látex 13,14. Notamos, porém, que a internalização de esferas de látex é menos facilmente detectado do que a ingestão de SRBCs. Com efeito, a ponto de a cinética da migração intracelular de partida é importante saber para detectar defeitos precoces em movimento phagosomal. A principal vantagem do método descrito aqui é a sua simplicidade e a utilização de um software livre. Para realizar o acompanhamento manual, utilizando o software ImageJ, que tem que usar a posição do fagossoma e o núcleo, assim, é necessário usar o teorema de Pitágoras para calcular a distância entre o fagossoma e o núcleo, e têm a velocidade depois de um regressão linear em software de planilha. Esta análise 3 passos pode ser reduzido a um passo, o acompanhamento, em software gelada com o &amp; #34;. Rastreio Manual &quot;plug-in Os dados de saída são, em seguida, directamente a velocidade da partícula a seguir, e, mais particularmente, a velocidade relativa entre os 2 grupos (tais como fagossomos e núcleo) Finalmente, o cálculo permite medir a velocidade relativa de. uma partícula em relação a uma outra partícula que também pode estar em movimento. O potencial de aplicação futura desta análise de lapso de tempo de vida pode ser para partículas visíveis no campo claro, como bactérias, fungos ou restos celulares. tratamentos diferentes ou condições de infecção suficientes para modificar maturação phagosomal e as propriedades de activação de macrófagos iria beneficiar de uma tal análise de movimento refinado phagosomal direcção ao centro da célula.

Macrophages play a major role in the innate immune system and in homeostasis. They are professional phagocytes that internalize and eliminate pathogens and debris by a process called phagocytosis 1,2. The phagosome, the closed compartment that forms after the engulfment of particulate material, undergoes a series of fusion and fission events with endocytic compartments, leading to a degradative compartment called the phagolysosome. This compartment has an acidic pH, due to the acquisition of proton-pumping v-ATPases, contains hydrolytic enzymes and is enriched in lysosomal-associated membrane proteins (LAMPs). The maturation of phagosomes is accompanied by their migration on microtubules 3,4 towards the cell center to reach a perinuclear location where lysosomes are accumulated.
Many pathogens have been reported to hijack phagosome maturation, including bacteria with intracellular lifestyles that modify the vacuolar environment where they reside 5. The Human Immunodeficiency Virus (HIV)-1 targets macrophages in addition to T cells. As macrophages are resistant to the cytopathic effects of the virus, unlike T cells, they can be considered as a reservoir for the virus. In addition, macrophages infected with HIV-1 show defective phagocytic functions and contribute to the emergence of opportunistic diseases. In particular, severe invasive non-typhoidal Salmonella disease caused by Salmonella Typhimurium ST313 has been prevalent for the last three decades in sub-Saharan African children or adults infected with HIV 6. It has been estimated that the risk of developing tuberculosis is more than 20 times greater in people living with HIV than among those without HIV infection. 
For all these reasons, it is important to better define the molecular mechanisms underlying the phagocytic defects in HIV-infected macrophages. We have shown that the uptake of particulate material, opsonized particles, bacteria or fungi, was inhibited in HIV-infected macrophages 7. Given that this inhibition is partial, we then set out to analyze the fate of the internalized phagosomes in HIV infected human macrophages 8. Because phagosome maturation is tightly connected with migration to the cell center and fusion with lysosomes, a defect in phagosomal maturation can be due to modifications of the trafficking modalities in the infected cell. The method described here uses IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells (IgG-SRBCs) as a model to target receptor-mediated phagocytosis and in particular receptors for the Fc portion of immunoglobulins (FcR). These particles are easier to image in bright field (BF) than latex beads because extracellular and intracellular SRBCs show different refraction properties 9. To measure the velocity of phagosomes moving towards the nucleus in HIV-infected macrophages, we used a fluorescent virus 10 and set up a simple manual tracking method that is described here. The method does not require advanced programming and simply uses ImageJ. It is amenable to adherent cells and any type of particle or pathogen that can be visualized with bright field microscopy or with fluorescent imaging.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>For viral production</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td>For acquisition</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates 6-well</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>For human monocyte-derived macrophages</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose)</td><td>GIBCO, Molecular probes</td><td>31966-021</td><td>Conserved at 4 &amp;deg;C ; for HEK cells culture</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&amp;nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>Conserved at 4 &amp;deg;C; for hMDMs culture</td></tr><tr><td>F&amp;oelig;tal Calf Serum (FCS)&amp;nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Conserved at -20 &amp;deg;C ; decomplemented</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Conserved at -20 &amp;deg;C ; for hMDMs culture</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use ; for phagocytosis assay</td></tr><tr><td>FuGENE6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Conserved at 4 &amp;deg;C ; for viral production</td></tr><tr><td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conserved in Alsever buffer at 4 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Anti-sheep red blood cells IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Conserved at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Conserved at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Inverted microscope DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Spinning Disk Unit&amp;nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Pixel size 6.45 &amp;micro;m x 6.45 &amp;micro;m ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5 software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>For the control of the microscope</td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td></td><td></td><td>For the statistics analysis</td></tr></tbody></table>

phagosome migration and velocity measured in live primary human macrophages infected with hiv-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

Fagocitose mediada por FcR-hMDMs HIV-1 infectadas e não-infectadas é descrito aqui usando SRBCs IgG-opsonizadas como alvos modelo (Figura 1). Os passos críticos deste protocolo são a preparação de hMDMs ea infecção com HIV-1. Com efeito, o rendimento e a qualidade dos macrófagos diferenciados varia entre dadores, bem como a taxa de infecção com eficiências na gama de 10-40%. Além disso, a preparação de IgG-opsonizado-SRBCs também é importante para evitar danificar os eritrócitos, porque isto poderia induzir o seu reconhecimento e absorção como detritos em vez de por fagocitose mediada por FcR. opsonização óptima irá garantir fagocitose eficiente. fagossoma no movimento vivo macrófagos infectados pelo VIH é analisado em tempo real com o canal de BF em um microscópio confocal de disco giratório no laboratório BSL-3. As configurações do canal BF são críticos to ver o núcleo (Figura 2, azul círculo) e para discriminar o externo (Figura 2, setas vermelhas) a partir das SRBCs internalizados (Figura 2, círculos vermelhos). A microscopia de BF é considerado como o mais simples técnica de iluminação microscopia óptica suficiente para ver os phagosomes, que são menos do que os refringentes SRBCs externas. O primeiro passo após a aquisição de sequências de imagens é rastreamento manual sobre o software ImageJ (Figura 3). Este ponto pode ser particularmente longa e fastidiosa, uma vez que é preferível para controlar cada fagossoma, um por um para todas as sequências da imagem e considera-se que os ensaios em ter de ser repetido com pelo menos 3 doadores por condição para atingir um tamanho de amostra suficiente para evitar a análise estatística (pelo menos 30 fagossomos com 3 doadores diferentes). O segundo passo é a análiseno software de planilha para calcular a velocidade fagossoma durante os primeiros 5 minutos após a internalização para cada SRBCs internalizados (Figura 4). Para isso, marcamos para cada fagossomo a distância percorrida durante os 5 primeiros minutos contra o tempo. Um exemplo representativo é mostrado na hMDMs não infectados em Figura 5A. Em seguida obtém-se a velocidade do fagossoma, o que é o declive da curva de regressão linear. Uma velocidade de 0,5384 pM / min foi encontrada para este fagossoma. De nota, é possível analisar a velocidade de fagossoma durante os primeiros minutos após a internalização, tal como descrito aqui ou em Dumas et al., 8, ou mais tarde por análise da velocidade em escalas de tempo mais longos. Em nosso estudo, observou-se que a velocidade fagossoma durante os primeiros 5 minutos após a internalização em hMDMs infectados pelo HIV é menor em comparação com hMDMs não infectados (Figura 5B). Figura 1. Preparação de controle e infectadas com HIV hMDMs para imagiologia de fagocitose. Os monócitos são purificados por aderência (1) e diferenciadas em macrófagos por 11 dias com M-CSF (2). Em seguida, hMDMs estão infectados com o VIH-NLR4.3 1Gag-IGFP i) a um MOI entre 0,02 e 0,03 para 8 dias com lavagem no dia 2 (3). (4) SRBCs IgG-opsonizadas são adicionados para hMDMs para fagocitose durante 1 hora. Os phagosomes contendo SRBCs são detectáveis ​​em imagens BF (círculo vermelho, ii). As imagens são imagens da base de dados Servier. Bar = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/54568fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568fig2.jpg" /> Figura 2. aquisição em tempo real durantefagocitose por controlo representativo e hMDMs infectados pelo HIV. hMDMs são preparados e infectadas, como descrito na Figura 1. As células NLR4.3 HIV-1Gag-IGFP infectadas são detectados com o laser de 491 nm. Z-pilhas de imagens confocal disco giratório são adquiridos e analisados ​​utilizando tanto o software de aquisição de microscópio e ImageJ (painéis da esquerda). Galerias de imagens BF representam um (painéis superiores correspondentes a Filme 1) não infectados e um NLR4.3 HIV-1Gag-IGFP infectadas (painéis inferiores correspondentes a Movie 2) celular durante uma aquisição de 45 min (46 imagens com o tempo indicado como hh :milímetros). A membrana celular (linha pontilhada preto), o núcleo (círculo azul), os SRBCs externos (alguns deles indicados com setas vermelhas) e os SRBCs internos (alguns deles indicados com círculos vermelhos) são detectáveis ​​em imagens BF. Bar = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/54568fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54568/54568fig3.jpg" /> Figura 3. passos de instrução para análise de imagem com o plugin O Tracking Manual on ImageJ. Depois de abrir o plug-in &quot;Manual de Monitoramento&quot; (1) e carregar o lapso de tempo vídeo no canal BF (2), digite os parâmetros de aquisição (3). Clique em &quot;Adicionar faixa&quot; (4) e iniciar a medição do tracking, clicando em um fagossoma (5) para obter uma nova janela com posições X e Y do fagossoma escolhido (6, caixa vermelha). Para seguir o fagossomo na sequência de tempo por conveniência, variar o brilho e contraste (5 &#39;). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/54568fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54568/54568fig4.jpg" /> Figura<html> 4. Passos de instruções para análise da velocidade de migração fagossomo em software de planilha de dados. (A) Montar a posição X e Y do núcleo e cada fagossomo (caixa vermelha) em uma tabela de planilha. Em uma outra coluna (caixa roxa), calcular a distância entre o fagossoma e o núcleo com o teorema de Pitágoras, onde c representa a distância entre o núcleo e o SRBC e a e b os comprimentos dos outros dois lados de um triângulo rectângulo ( B). (C) Finalmente, calcular a distância percorrida pelos phagosomes em cada tempo (caixa verde) subtraindo a distância entre o SRBC eo núcleo em um determinado momento da distância inicial no tempo 0. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/54568fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. A quantificação da velocidade de migração fagossoma no controle e hMDMs infectados pelo HIV. (A) para cada SRBC e apenas após a internalização SRBC, a distância percorrida para o núcleo é medida e representada graficamente contra o tempo. Sua velocidade durante a primeira 5 min é calculado por meio de regressão linear em software de planilha. A experiência representativa é mostrado (o SRBC interna da Figura 3-4). (B) Todas as velocidades durante os primeiros 5 min são medidos para 66 phagosomes em não infectados (5 doadores) e 60 phagosomes em células infectadas pelo HIV (4 doadores). Os dados representam a média ± SEM (teste t de Student não pareado com correção de Welch; **, P &lt;0,01). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/54568fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/Jove_movie1.mov" target="_blank">Filme 1: movimento fagossomo em um macrófago não-infectado representativa. . (Clique direito a download)</a> O movimento de glóbulos vermelhos opsonizadas foi detectado no canal BF durante 45 min da fagocitose com uma imagem por minuto (46 imagens com o tempo indicado como hh: mm). Barra = 10 uM. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54568/Jove_movie2.mov" target="_blank">Filme 2: movimento fagossomo em um macrófago representante infectado pelo HIV. (Clique direito a download).</a> HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag IGFP) infectados macrófagos foram identificados após iluminação com laser 491. O movimento de glóbulos vermelhos opsonizados foi detectada no canal de BF durante 45min da fagocitose com uma imagem por minuto (46 imagens com o tempo indicado como hh: mm). Barra = 10 uM.

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Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K visualizações.  Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité. We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes. 

Vídeo: Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Imunologia e Infecção

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

Macrophages are multifunctional cells essential to the immune system function, and the primary host cell in Leishmania braziliensis (Lb) infection. These cells are specialized in microorganism recognition and phagocytosis, but also activate other immune cells and present antigens, as well as promote inflammation and tissue repair. Here, we describe a protocol to obtain mononuclear cells from peripheral blood (PBMC) of healthy donors to separate monocytes that then differentiate into macrophages. These cells can then be infected in vitro at different Lb concentrations to evaluate the ability to control infection, as well as evaluate host cell immune response, which can be measured by several methods. PBMCs were first isolated by centrifuging with Ficoll-Hypaque gradient and then plated to allow monocytes to adhere to culture plates; non-adherent cells were removed by washing. Next, adherent cells were cultured with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) for 7 days to induce macrophage differentiation. We suggest plating 2 x 106&#160;cells per well on 24-well plates in order to obtain 2 x 105&#160;macrophages. Fully differentiated macrophages can then be infected with Lb for 4 or 24 hours. This protocol results in a significant percentage of infected cells, which can be assessed by optical or fluorescence microscopy. In addition to infection index, parasite load can be measured by counting the numbers of parasites inside each cell. Further molecular and functional assays can also be performed in culture supernatants or within the macrophages themselves, which allows this protocol to be applied in a variety of contexts and also adapted to other intracellular parasite species.

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

This protocol describes the process for obtaining human macrophages from monocytes for infection with Leishmania braziliensis. It also allows researchers to evaluate infection rate and parasite viability, ROS production by fluorescence microscopy, and the production of inflammatory mediators in culture supernatants to investigate macrophage response to infection.

Macrophages are multifunctional cells essential to the immune system function, and the primary host cell in Leishmania braziliensis (Lb) infection. These ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

Source: Marie-Ana&#239;s, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54470">&#34;Phagosome Closure Assay&#34; to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM).</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

Obtainment of Macrophages from Human Monocytes to Assess Leishmania braziliensis Infection Rate and Innate Host Immune Response

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos