Name: protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice at JoVE.com

This work was supported by "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [grant number BIO2014-5258P], "European Commission" by the H2020 programs [grant numbers TBVAC2020 643381].

Todos os ratinhos foram mantidos sob condições controladas e observados quanto a quaisquer sinais de doença. O trabalho experimental foi realizado de acordo com as directivas europeias e nacionais para a protecção dos animais experimentais e com a aprovação dos comités de ética locais competentes. 1. Preparação de Stocks quantificada glicerol de BCG dinamarquesa e H37Rv Mycobacterium tuberculosis Nota: Todos os protocolos descritos foram realizadas em condições BSL3. <ol><li> Estoques de glicerol congelado descongelar BCG Danish ou estirpes H37Rv e inocular 100 ul em 10 ml de meio 7H9 10 suplementado com Tween-80 0,05% (v / v) e ADC (albumina, dextrose, catalase) 10% (v / v). </li><li> Incubar sob condições estáticas durante uma semana a 37 ° C até a cultura está em crescimento de fase log. </li><li> Dimensionar-se a cultura bacteriana por transferência da cultura de 10 ml a 200 ml de meio fresco. Incubar por 20 adicionaldias, em condições estáticas. </li><li> Transferir para tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugar durante 15 min a 2500 x g. </li><li> Rejeitar sobrenadante e ressuspender sedimento bacteriano no volume residual. Adicionar a cada tubo de esferas de vidro de 3 mm de diâmetro estéreis (10 - 15) por tubo. </li><li> Vortex vigorosamente durante 1 min, a fim de dissociar aglomerados de bactérias. Ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS com Tween-80 a 0,05% (v / v). </li><li> Deixar os tubos durante 10 minutos permitindo que os maiores agregados bacterianos e contas de vidro para se estabelecer. </li><li> Recuperar 9,5 ml de sobrenadante a partir de cada um dos 4 tubos contendo pequenos aglomerados e bactérias individuais e volumes de transferência para um único tubo de centrífuga de 50 ml fresco (volume recuperado final de 38 ml). Centrifugar durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Recuperar 35 ml de sobrenadante (contendo as bactérias, principalmente simples) num tubo de centrífuga de 50 mL fresco e adicionar 15 ml de PBS com glicerol a 50% (v / v), obtendo-se uma concentração de glicerol final de 15% (v / v). </li><li> misture delicadamentee distribuir-se em alíquotas de 1 ml em tubos apropriados para congelação. Armazenar a -80 ° C (um lote fornece cerca de 50 alíquotas de stock de glicerol). </li><li> Para quantificar os estoques de glicerol, glicerol a descongelar um dia após a congelação e executar sete diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml contendo 900 ul separadas de PBS. </li><li> Placa de 100 ul de cada diluição em meio sólido 7H10 agar-10 suplementado com ADC a 10% (v / v) preparados em placas de Petri de diâmetro de 55 mm. </li><li> Adicionar cuidadosamente 3 mm de diâmetro contas de vidro (aprox. 10 por placa) e agitar suavemente placa para distribuir igualmente o volume sobre a placa de ágar. Descarte pérolas e selar placa de ágar com parafilme. </li><li> Incubar durante 21 dias a 37 ° C e determinar a concentração bacteriana por contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) nas diluições onde as colónias individuais podem ser distinguidos com precisão. </li></ol> 2. Rato Vacinação <ol><li> Descongelar um glicerol pré-quantificadas BCG e diluir em PBS para prepsão duas suspensões. Calcular o volume final, considerando a dose por animal é de 100 ul para a administração subcutânea (10 7 CFU por ml para vacinação por via subcutânea) e de 40 ul para a administração intranasal (2,5 x 10 7 UFC de vacinação intranasal). </li><li> Use uma estação de trabalho de anestesia especializada para roedores para anestesiar os ratos com uma mistura de isoflurano e oxigênio. Use isoflurano a 5% para induzir a anestesia e 2% para manter os ratos na câmara de anestesia. (Outro método de anestesia aceite pode ser usado). </li><li> Para a administração subcutânea de vacina encher uma seringa de 1 ml com uma agulha de 26 G com 1 ml de suspensão bacteriana (10 7 CFU / ml). Remover bolhas de ar. </li><li> Coloque um rato anestesiado numa superfície plana na posição de bruços no interior de uma câmara de fluxo laminar e inocular subcutaneamente 100 ul (10 6 CFU / dose) de vacina num flanco do rato para trás. Devolver o mouse para a gaiola e monitorá-lo para garantir que ele PROPErly recupera da anestesia. </li><li> Mudar a agulha da seringa entre cada administração mouse. Removido bolhas de ar, como descrito acima. </li><li> Para administração intranasal, coloque um rato anestesiado em decúbito dorsal no interior do exaustor. </li><li> Com uma micropipeta ter 20 ul da suspensão com 2,5 x 10 7 CFU / mL. Coloque a gota-a-gota de inóculo entre as duas narinas até que todo o volume foi depositado, deixando tempo entre gotas para permitir que o mouse respirar o volume. Nota: os ratos podem sofrer de desconforto respiratório durante este procedimento para que eles devem ser deixadas para assimilar cada gota antes de administrar a próxima para evitar tanto quanto possível. </li><li> Voltar a encher a micropipeta com uma outra 20 ul e repetir a operação. Se o rato começa a acordar da anestesia após a primeira inoculação, colocá-lo na câmara de anestesia antes da segunda. Devolver o mouse para a gaiola e garantir que ele corretamente recuperada anestesia. </li></ol> 3. Rato intranasal Desafio com H37Rv Strain <ol><li> Descongelar uma pré-glicerol quantificada H37Rv e dilua em PBS para preparar uma suspensão de bactérias de 2500 CFU por ml. Calcule volume final considerando a dose por animal é de 40 mL. </li><li> H37Rv é inoculado por via intranasal, tal como descrito em 2,5-2,7. Dose de desafio final por ratinho é de 10 2 UFC / 40 mL. </li></ol> 4. Análise do induzida resposta imune nos pulmões <ol><li> Lung suspensão celular NOTA: Avaliação da resposta imune adaptativa induzida pela vacina em pulmões requer a geração de suspensão de células individuais. Para este fim, usamos um Dissociator tecido tais como gentleMACS. <ol><li> Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Dentro de uma capela de fluxo laminar, extrair o lUNGS usando tesouras e pinças esterilizadas e coloque-os em uma superfície limpa. pulmões limpas retirando da traqueia e do tecido conjuntivo, e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com PBS (manter em gelo até que o processamento). </li><li> Para gerar uma suspensão celular, colocar os pulmões em um tubo adequado para a dissociação do órgão (tubo de C-Dissociator) contendo 5 ml de HEPES-NaOH 10 mM pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2 e 1,8 mM de CaCl2 amortecedor. </li><li> Adicionar 100 ul de colagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentração final), e 40 ul de ADNase I 20000 IU / ml (160 UI / ml de concentração final. NOTA: As soluções-mãe de colagenase D ou ADNasel são preparados dissolvendo enzimas liofilizadas em PBS ou glicerol 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respectivamente. </li><li> Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o m_lung_01 programa predefinido para a fragmentação do pulmão. Incubar o tubo a 37 ° C num banho de água durante 30 min. </li><li> º lugare tubo no Dissociator e usar o m_lung_02 programa predefinido para homogeneização completa do pulmão em suspensão celular única. </li><li> Passar a suspensão celular através de um coador de células de nylon de 70 ^ M equipado com um tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar o filtro com 10 ml de meio RPMI 1640. </li><li> centrifugar células durante 5 minutos a 400 xg e elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de lise de eritrócitos, misturar em vortex e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Adicionam-se 10 ml de meio RPMI 1640 células médias e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de meio completo de RPMI 1640 suplementado com-inactivado pelo calor 10% de Soro Fetal Bovino (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina, 100 IU / ml de penicilina e 50 ^ M de 2-mercaptoetanol. NOTA: FCS é inactivada por incubação a 56 ° C durante 30 minutos. </li><li> Contar as células e adicionar RPMI completo 1640 para alcançar a densidade celular final de 10 7 células / ml. NOTA: Para contagem de células, usamos o contador de células automatizado. </li><li> Distribuir 100 ul de suspensão celular em placas de 96 poços de fundo em U estéril (10 6 células / poço). </li><li> Adicionar 50 ul / poço de meio completo de RPMI 1640 com 15 ug / ml de H37Rv comercial derivado de proteína purificada (PPD) (5 ug / ml de concentração final). </li></ol></li><li> Recolha de sobrenadante para a determinação da citoquina por ELISA <ol><li> Incubar a placa a partir de 4.1.14 durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> placa Centrifugar durante 5 minutos a 400 xg e recuperar 100 ul de sobrenadante. </li><li> Armazenar a -80 ° C. </li><li> Dilui-se sobrenadantes de 1/10 e 1/2 no tampão de ensaio para determinação de IFN-y e IL17A, respectivamente. Determinar a concentração de citocinas com kits comerciais de ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (kits de desenvolvimento de ELISA). </li></ol></li><li> Coloração intracelular para a determinação da citoquina-producing células CD4 + através de citometria de fluxo <ol><li> Incubar a placa a partir de 4.1.14, durante 18 h a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 1,5 uL de Brefeldina A 1 mg / ml (estoque dissolvido em DMSO) a cada (concentração final 10 ug / mL) bem e incubar durante seis horas adicionais. </li><li> Centrifugar a placa a partir de 4.3.2, durante 1 min a 3200 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 50 ul de anti-rato CD4-FITC diluído em meio RPMI 1640 com FCS a 10% (1/500) e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a placa a partir de 4.3.4, durante 1 min a 3200 xg, descartar o sobrenadante e adicionar / poço de solução de fixação 100 ul. Incubar a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização. NOTA: 10x Estoque concentrado é diluído em água desionizada para preparar a solução de trabalho 1x. </li><li> Ressuspender as células em 50 ul de anti-ratinho de IFN-y-APC e anti-rato IL17A-APC.Cy7 diluído em permeabilsolução ização (1/250 ambos os anticorpos). </li><li> Incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS para aquisição de citometria de fluxo. </li></ol></li></ol> 5. Análise das imunoglobulinas em Lavagem Broncoalveolar (BAL) <ol><li> Obtenção de amostras de LBA <ol><li> Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Expor a traquéia usando adequada precisão pinça e tesouras estéreis e realizar um pequeno corte na traqueia, certificando-se de não extirpar completamente. Tome cuidado para não causar sangramento que poderia contaminar amostras BAL. </li><li> Introduzir na traqueia uma cânula ligada a uma seringa esterilizada de 1 ml com 800 ul de PBS gelado. </li><li> Inocular lentamente o PBS nos pulmões e, em seguida, recover volume de BAL puxando para trás do êmbolo da seringa muito lentamente, a fim de evitar o colapso do pulmão. NOTA: Recuperação de 500 a 600 ul é satisfatória. </li><li> Transferir o volume BAL em um tubo de 1,5 ml e confirmar BAL permanece incolor, indicando que não está contaminada com sangue (manter em gelo até que o processamento). </li><li> Centrifugar as amostras BAL durante 5 minutos a 400 xg, e transferência de sobrenadante para um novo tubo. </li><li> sobrenadantes armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Determinação dos níveis de IgA em LBA sobrenadantes NOTA: Todos os reagentes utilizados são à temperatura ambiente. <ol><li> Revestimento de poliestireno de ligação elevada de proteínas de fundo plano de placas de 96 poços com 100 ul de PPD diluído em PBS (10 ug / ml) para M. tuberculose determinação IgA -específica, ou com 100 uL de sobrenadante BAL diluídas 10 vezes em PBS para determinação de IgA total. </li><li> Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante e toque a placa em papel toalha para dry. Lava-se com 200 ul / poço de PBS. </li><li> Bloquear com 200 ul / poço de albumina de soro bovino (BSA) a 1% (w / v) em PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de bloqueio). </li><li> Incubar 1 hora à TA. </li><li> Lavar uma vez com 200 ul / poço de PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de lavagem). </li><li> Adiciona-se 100 ul de sobrenadante BAL não diluído nos poços de PPD-revestidos. Incubar duas horas à temperatura ambiente. NOTA: Se a determinação de IgA total é feita em paralelo com o PPD-específico IgA, IgA totais deixar poços com tampão de lavagem de 100 ul durante esta incubação. </li><li> Lavar três vezes com 200 ul / poço de lavagem buffer.0170004 </li><li> Adicionar 100 ul de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated IgA anti-rato diluído em tampão (1 / 10.000) de bloqueio. </li><li> Incubar 1 hora temperatura ambiente. </li><li> Lavar cinco vezes com 200 ul / poço de tampão de lavagem. </li><li> Adicionam-se 100 ul / poço de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 20 minutos à temperatura ambiente em tele escuro. </li><li> Adicionam-se 100 ul / cavidade de H 2 SO 4 0,5 N. Ler a placa num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. determinação da carga bacteriana nos pulmões <ol><li> Lung homogeneização e chapeamento <ol><li> Quatro semanas após o desafio, sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Colocar o rato na posição supina fixo sobre uma superfície plana e desinfectados, dentro de uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Faça uma incisão e remover a pele da região torácica para deixar visível a área torácica. </li><li> Cortar as costelas e colher os pulmões eo coração, usando tesouras e pinças esterilizadas. Coloque órgãos sobre uma superfície limpa. </li><li> Limpar os pulmões através da remoção do coração, da traqueia e do tecido conjuntivo e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com 1 ml de água desionizada(Manter em gelo até o processamento). </li><li> Utilize uma pinça estéril para transferir os pulmões de cada rato para um tubo de órgão adequada para homogeneização (H - Dissociator tubo), contendo 1 ml de água desionizada. </li><li> Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o RNA_1 programa pré-definido de forma a homogeneizar os pulmões. </li><li> Adicione cinco diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml, começando com 100 ul de homogenato de pulmão diluído em 900 ul. </li><li> diluições em placa conforme descrito no 1,11-1,14. </li></ol></li><li> A diferenciação entre BCG e H37Rv por PCR Nota: Nas placas de 6.1.6 correspondentes para o grupo vacinado com a vacina BCG por via intranasal, analisou-se um número representativo de colónias por um PCR discernir entre BCG e H37Rv para assegurar que o CFU considerado para avaliar a eficácia de protecção conferido pela vacina correspondeu exclusivamente para H37Rv. Esta amplificação por PCR de alvos RD9, uma região genómica diferente em BCG e M. TUberculosis, dando um fragmento de 2618 pb para H37Rv e 465 pb para BCG 11. <ol><li> Prepare um estoque mestre mix para todas as amostras com volumes por amostra como indicado, e depois distribuir em tubos de PCR (9 l / amostra). NOTA: Tampão de 5x: 2 ul. Iniciador directo 25 mM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 mL, o iniciador inverso 25 mM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 ml, Taq polimerase 5 unidades / ul: 0,04 mL, desionizada H2O: 6,32 mL. </li><li> Toque em uma colônia com um palito estéril e mergulhe o palito com a amostra num tubo de PCR contendo a mistura principal. </li><li> Executar a PCR com o seguinte programa: 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 35 ciclos (30 segundos a 95 ° C, 1 min a 58 ° C e 4 min a 72 ° C). </li><li> Coloque as amostras de PCR num gel de agarose a 1% com amostras de brometo de etídio e correr para visualizar os fragmentos. </li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Although current vaccine against tuberculosis, BCG, is the most widely administered vaccine in history, tuberculosis remains one of the leading causes of death and morbidity from infectious diseases worldwide. This paradox is explained by the lack of protection of this vaccine against pulmonary tuberculosis, the responsible form of transmission. New vaccination approaches effective against pulmonary forms of the disease are urgently needed, as they would have the greatest impact on disease transmission globally.
Our data clearly show that a change in the route of administration of BCG to mimic the natural route of infection could be a successful strategy to prevent pulmonary tuberculosis. Our results are in accordance with other authors showing equivalent data in different animal models, including guinea pigs and non-human primates (NHP) 6,9,12.
Remarkably, our unpublished data indicated that the volume of administration by the intranasal route is a critical step of the protocol. These results revealed that following intranasal delivery of 100 H37Rv bacteria resuspended in 10 &#956;l (instead of 40 &#956;l), we only recovered lung CFUs from around 20% of the animals (data not shown. 
Importantly, one of the possible limitations of intranasal administration as a vaccine delivery route in clinic could be its proximity with the central nervous system13,14. In this regard, aerosol immunization might be safer as delivery route for pulmonary tuberculosis vaccines in humans.
This protocol describes a standardized methodology that can be adapted to other studies, as comparison of pulmonary vaccines, or different routes of pulmonary immunization, including aerosol.
Our data suggest that the analysis in parallel of protective efficacy and immune response, using lung samples from the same animal, could be a useful tool to identify biomarkers of protection. In this regard, our results reveal that lung IL17, but not IFN&#947;, seems to correlate with a better vaccine protective efficacy. These data highlight a possible role of IL17 in the protective response induced by intranasal BCG, which is in accordance with data reported by other authors using mucosal subunit TB vaccines 7,15. Our data also indicate that presence of IgA (both total and MTB-specific) in BAL samples correlates with protection conferred by intranasal BCG. Importantly, we described previously, in agreement with other works, that IL17 contributes to traslocation of IgA to respiratory airways and gut lumen.9,16,17

A tuberculose (TB) é uma das doenças infecciosas, causador de mortes associadas mais do que o HIV no mundo e combinada com o aumento do crescimento de estirpes resistentes a múltiplos fármacos torna a TB um problema de saúde mundial alarmante 1. Novas ferramentas de diagnóstico, drogas mais eficazes e menos tóxicos, e novas vacinas contra a tuberculose seguros e eficazes são uma necessidade urgente, especialmente nos países em desenvolvimento. Vivo atenuado Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) é atualmente a única vacina licenciada contra a tuberculose, que foi administrado por via intradérmica no nascimento desde 1970 em todo o mundo. BCG é considerada eficaz na prevenção de formas graves da doença (meningite e TB miliar) em crianças, mas tem demonstrado eficácia inconsistente contra a TB pulmonar responsável da transmissão da doença 2. vacinação pulmonar, que imita via natural de infecção por tuberculose, representa uma abordagem atraente para o priming resposta imune host locals. A este respeito, vários trabalhos pré-clínicos em diferentes modelos animais relevantes de TB demonstram maior eficácia da vacina após imunização pulmonar, em comparação com a via subcutânea ou intradérmica rota 3-6. No entanto, os mecanismos de protecção activadas por vacinação pulmonar não são bem compreendidos. Nos últimos anos, vários trabalhos têm apontado para resposta mediada por IL17 como um fator importante da resposta imune da mucosa específicos de TB, como em modelos de ratos deficientes em IL17 eficácia protetora induzida pela vacina da mucosa é prejudicada 7,8. Recentemente, demonstrou pela primeira vez que intranasal administração BCG protegido ratinhos DBA / 2, uma cepa de rato caracteriza-se pela falta de proteção após a BCG subcutânea imunização 9. Estes resultados sugerem que a vacinação TB respiratória poderia ser mais eficaz na redução da taxa de TB em países endêmicos, onde BCG intradérmica é considerado ineficaz contra pulmonTB ary.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&amp;rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Used as trachea cannula for BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&amp;alpha;-chain specific)&amp;minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>The kit Includes Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

Este trabalho descreve a comparação de duas vias de administração de BCG: subcutânea e intranasal. via subcutânea é comparável à intradérmica, que é a via clínica corrente de BCG em todo o mundo. Via intranasal de vacinação destina-se a imitar a via natural de infecção de M. tuberculose, com o objetivo de induzir resposta imune diretamente nos pulmões, o principal órgão alvo deste patógeno. A Figura 1 descreve o fluxo de trabalho seguido. Oito a fêmea DBA 10 semanas de idade / 2 ratos são vacinados com 10 6 CFU de BCG Danish por via subcutânea ou de administração intranasal. Oito semanas mais tarde, um grupo de ratinhos foi sacrificado para analisar pulmão resposta imunitária induzida por vacinação. amostras de LBA são primeiro obtidas e, em seguida, colhemos pulmões. A fim de estudar a eficácia protetora conferida pela vacina, nós inocular um differeNT grupo de ratinhos com um desafio intranasal de uma dose baixa de M. tuberculosis H37Rv. Um mês mais tarde, nós sacrificar animais e pulmões colheita. Neste caso, para cada animal que use o pulmão esquerdo para determinar a carga bacteriana e o pulmão direito de avaliar induzida pela vacina resposta imune pós-desafio. O objectivo é o de gerar a carga bacteriana e dados de respostas imunes em pulmões de cada animal, a fim de estudar potenciais indicadores de protecção. Como mostrado na Figura 2, os pulmões foram dissociadas para obter tanto um homogenato de órgão ou de uma suspensão celular. pulmões homogeneizados foram plaqueadas em meio de agar sólido para determinar a carga bacteriana quatro semanas pós-desafio. suspensão celular para estudar a resposta imune induzida pela vacina foi obtido após pulmão digestão enzimática com colagenase D e DNaseI. Os nossos resultados indicam claramente que, quando comparado tO a via subcutânea, a via intranasal de uma vacina confere protecção muito maior eficácia em pulmões de quatro semanas após a provocação (Figura 3A). Além disso, constatou-se que a carga bacteriana nos pulmões do grupo BCG-vacina intranasal correspondem à H37Rv e não a vacina BCG. Para este fim, analisamos um número representativo de colônias deste grupo por PCR específica para a região do genoma do RD9, que amplifica diferentes fragmentos de comprimento em BCG e M. tuberculose (Figura 3B). Figura mostrou claramente que todas as colónias analisadas proporcionado um fragmento de 0,4 kpb, o que correspondeu a H37Rv. Nossos dados revelaram uma correlação entre a eficácia protectora conferida por intranasal vacina BCG e da resposta imune induzida pela vacina nos pulmões antes do desafio. Intranasal BCG desencadeada claramente superior IL17 e produção de IFNy nos pulmões, medida através de ELISA (Figura4A). Estes dados foram confirmados por coloração intracelular (ICS) e citometria de fluxo (dados não apresentados). Além disso, encontramos também uma maior concentração de ambos concentração total e específica do PPD IgA em amostras de LBA (Figura 4B), indicando que a vacinação BCG pulmonar induz a produção de IgA e translocação para vias respiratórias. Finalmente, estudou-se a resposta imune induzida por BCG nos pulmões após desafio (Figura 5). Nossos dados revelaram diferenças entre IL17 e IFN-y; As células CD4 + produtoras de IL17A foram detectadas apenas no grupo BCG intranasal, enquanto que as células produtoras de IFNy foram encontrados em todos os grupos infectados com H37Rv, independentemente da vacinação. Representação de dados de cada animal que corresponde a células produtoras de IL17 e carga bacteriana mostrou uma correlação significativa entre a presença de IL17 e redução da carga bacteriana do pulmão, o que não foi observado no caso de IFN-y. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54440/54440fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de trabalho para comparação intranasal e subcutânea Via de Vacina BCG. Oito semanas após a vacina BCG, um conjunto de ratos (6 por grupo experimental) é usado para colher os pulmões e realizar uma BAL, e analisar a resposta imune pulmonar induzida pela vacinação. Outro conjunto de ratinhos (6 / grupo), é inoculado com um desafio intranasal de uma dose baixa de M. tuberculosis estirpe H37Rv (100 CFU). Um mês mais tarde, os animais são sacrificados e carga bacteriana é analisada no pulmão esquerdo e resposta imune específica PPD-no pulmão direito. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54440/54440fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54440/54440fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Processamento de amostras de pulmão. A Dissociator tecido foi usado para processar pulmões. Nas experiências para determinar a carga bacteriana, os pulmões foram homogeneizados antes da placa-los em meio de agar sólido. Em experimentos que requerem uma suspensão celular de pulmão, este foi gerado após a digestão enzimática com colagenase D e DNaseI. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54440/54440fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54440/54440fig3.jpg" /> Figura 3. Protecção eficácia conferida pelo BCG Imunização. Grupos de 6 ratinhos DBA / 2 foram vacinados pela via subcutânea (BCG sc), intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (Unvacc) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. Ao fim de dois meses após a vacinação, os ratinhos foram inoculados intranasalmente com uma dose baixa (100foi determinada CFU) desafio H37Rv, e um mês mais tarde carga bacteriana nos pulmões. A experiência representativa de dois independentes é mostrada. (A) de dados nos gráficos são representados como média + SD. Foi realizada One-way ANOVA com análise post Bonferroni para calcular a significância estatística. (B) Um número representativo de colónias individuais do grupo intranasal BCG foram analisados ​​por PCR específica para a região RD9 (diferente em BCG e H37Rv genomas) para discernir BCG e colónias H37Rv. (Anteriormente publicado 9). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54440/54440fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54440/54440fig4.jpg" /> Figura 4. Vacina-específica Pulmonar resposta imune analisados ​​antes de desafio com H37Rv. Grupos de seis ratinhos DBA / 2 foramvacinadas pela via subcutânea (BCG sc) ou intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (Unvacc) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. (A) Em dois meses após a vacinação, foi obtida uma suspensão celular a partir de pulmões colhidas. As células foram estimuladas com PPD, como descrito na secção de métodos e IL17A (painel da esquerda) e IFN-y (painel da direita) de produção foram analisados ​​por ELISA. (B) de IgA total, e M. tuberculosis (MTB) IgA especï¿½ico foram analisados ​​a partir de amostras de LBA por ELISA. Os dados recolhidos de dois experimentos independentes são mostrados. Os dados nos gráficos são representados como média + SD. (Anteriormente publicado 9). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54440/54440fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54440/54440fig5.jpg" /> Figura 5. Vacina-específicaResposta Imunológica pulmonar analisados ​​antes do desafio com H37Rv. Grupos de 6 ratinhos DBA / 2 foram vacinados pela via subcutânea (BCG sc) ou intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (NV) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. Um grupo de ratinhos não vacinados, de controlo não infectado foi também incluído (NV / NI). Ao fim de dois meses após a vacinação, os ratinhos foram desafiados intranasalmente com uma dose baixa de H37Rv (100 CFU), e um mês mais tarde os animais foram sacrificados. À esquerda e pulmões direito do mesmo animal foram usadas para determinar a carga bacteriana e IL17A- (A) ou IFNγ- (B) produzir células CD4 +, respectivamente. Dados em painéis da esquerda correspondem a percentagem de células produtoras de citocinas medida por citometria de fluxo, e são representados como média + SD. painéis da direita representam os dados de carga bacteriana e citoquinas produzir células CD4 + obtidos para cada ratinho. A regressão linear foi calculada e o valor p obtido em cada caso é mostrada, no caso de IL17A. agrupadadados de duas experiências independentes são apresentados na figura. (Anteriormente publicado 9). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54440/54440fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K visualizações.  University of Zaragoza. We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Imunologia e Infecção

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Medicina

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Acelerando a determinação da tuberculose usando o método de micro-UFC

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autor em destaque: Otimizando a determinação de UFC para avaliação eficiente da eficácia da vacina contra TB e análise de apresentação de antígeno 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Resumo

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Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

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