The Authors would first like to acknowledge all students from the freshman Biology 121- Ecology Module lab at Juniata College for their help in generating data used in this study. We would also like to thank Dr. Randy Bennett, Chris Walls, Sherry Isenberg, and Taylor Cox for their assistance in acquiring materials necessary to develop this methodology. Additionally, we would like to thank Dr. Norris Muth and Dr. John Unger for their advice on methodological development and Dr. Jill Keeney and the Biology department for their support of this endeavor. We would also like to thank the anonymous reviewers that have helped to shape and focus this manuscript.&#160; Last but not least, I&#39;d like to thank Hudson Grant for his help with the initial stonefly collection for use in development of this technique

Nota: Este experimento não usar vertebrados e, portanto, não necessitam de aprovação pelo Instituto de Juniata College for Animal Care e do Comitê Use. No entanto, para os indivíduos adaptando este método para uso com vertebrados, aprovação IACUC deve ser procurado. Coleta de Amostras 1. Campo <ol><li> Determinar e avaliar os sites de campo potenciais para a capacidade de coletar, armazenar e stoneflies transporte rapidamente para minimizar o tempo em trânsito com um tempo máximo recomendado em trânsito de 1 hora. </li><li> Operações de amostragem kick-net no local campo selecionado seguindo os procedimentos pontapé-net padrão vezes o suficiente para recolher pelo menos 35 stoneflies 12. </li><li> Colete 50 L de água corrente e as rochas com um diâmetro máximo de 2 cm a partir de fluxos. </li><li> Coloque aquários num frigorífico ajustado para a temperatura do local de corrente. Distribuir rochas coletadas no local do fluxo em aquários e encher com 4 L de água corrente por aquário. coloque 20-30 Stoneflies recolhidos por aquário e colocar uma pedra borbulhante anexado a um bubbler aquário em cada tanque e ligue bubblers para adicionar continuamente o ar ambiente para a água. </li><li> Permitir que as stoneflies para se adaptar ao novo ambiente nos aquários para um período de 48 horas. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54430/54430fig1.jpg" /> Figura 1. Configurar a manipulação de oxigénio dissolvido. (A) 1) Montagem de tubo de cobre para espigão macho 2) Localização do selo rolha para examinar para assegurar o bem vedação frasco. (B) 1) 2 L frasco de braço lateral cheio com 1,9 L de água 2) do tubo de gás e um borbulhador de ar (azul) para uso em borbulhamento de azoto e quarto borbulhamento de ar, respectivamente, 3) tanque de azoto e os valores calibrados 4) 2 L balão cheia com 0,4 L de água com tubo de vácuo submersa 5) dissolvido medidor de oxigênio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54430/54430fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para</a>ver uma versão maior desta figura. 2. Experimental Set up <ol><li> No topo de uma bancada, ligar um tubo de vácuo de paredes padrão para o braço lateral de um frasco de braço lateral de 2 L como é mostrado (1 na Figura 1B). </li><li> Encha o frasco com 1,9 L de água corrente a partir de 3 L recipientes de plástico de retenção de água corrente coletado em frigorífico ajustado a 12 ° C. </li><li> Colocar o balão e tubos em uma bandeja grande o suficiente para conter um banho de gelo em torno do frasco de braço lateral sem obscurecer a visão do interior balão e encher a bandeja com gelo. </li><li> Perfurar dois buracos de 3 mm de diâmetro em uma rolha de borracha para permitir a passagem de 1) um tubo de cobre para distribuir o gás para o recipiente e 2) a sonda de um medidor de OD para o frasco de braço lateral de 2 L (1 na Figura 1B) . </li><li> Adicione uma incisão lateral a partir da borda da tampa de um dos furos para permitir que o assento de fio de a sonda de OD na rolha. </li><li> Conectar um acoplador macho com uma mangueira de 3 milímetrosfarpa a um pedaço com 2 mm de diâmetro de tubo de cobre (1 na Figura 1A). Assegure-se que este tubo é suficientemente longo para alcançar a menos de 10 cm do fundo do frasco, para se alcançar através da rolha. </li><li> Colocar o tubo com acoplador embora o segundo buraco na tampa até que o comprimento da parte inferior da rolha é suficiente para alcançar a menos de 10 cm do fundo do frasco. </li><li> Conectar um comprimento de 0,75 m, tubo de parede fina de polietileno de gás com um diâmetro de 3 mm para o engate no tubo. </li><li> Deslize tanto a sonda de OD e tubo de cobre para o balão e selar a garrafa com a rolha. </li><li> Entrada para uma vedação perfeita entre a tampa e a garrafa, bem como um ajuste confortável entre o tubo e o fio de sonda no interior da rolha. </li><li> Encher um balão de 1 L com 0,4 L de água da torneira e colocar ao lado da bandeja com o banho de gelo e frasco de vácuo. </li><li> Submergir o tubo de polietileno proveniente do balão de vácuo grande para a água do balão de 1 L. Fixe otubo com fita adesiva de tal modo que ele irá permanecer submerso por meio da experiência. </li><li> Ligue a linha de gás de 3 mm de diâmetro do balão de vácuo a um bubbler sala de ar do aquário. Comece a bolha da água no balão de 2 L ligando o bubbler aquário, que introduz ar ambiente e oxigênio para a água. </li><li> Monitorar a concentração de OD e temperatura da água com o medidor de OD durante 5 min ou até que o equilíbrio de OD é estabelecida dentro da câmara de tal modo que pouca mudança no DO está a ocorrer. </li></ol> 3. Teste a estabilidade da montagem experimental <ol><li> Teste cada configuração para a estabilidade DO antes da adição de stoneflies. </li><li> Adicione três ou quatro pedras para o balão de 2 L de modo que stoneflies tem substrato propício para flexões. </li><li> Comece uma manipulação experimental de DO, desligando o tubo do gás proveniente do borbulhador e anexá-lo para a linha de gás nitrogênio. </li><li> Comece borbulhando azoto a 20 pés cúbicos por hora (CFH) por aproximadamente 40s a 1 min. </li><li> Uma vez que a DO caiu para menos de 0,5 mg / L de concentração do alvo, reduzir o fluxo para 15 CFH e permitir que a concentração diminuir para o alvo. </li><li> Cessar o fluxo de nitrogênio imediatamente uma vez que a concentração alvo é atingido. </li><li> Use o bubbler sala de ar do aquário para retornar a concentração para a concentração de destino se a DO diminui abaixo da meta. </li><li> Se a DO é instável durante o teste de um set-up, em seguida, verificar o volume de água ainda está em 1,9 L e nenhuma água foi originado fora, a temperatura da água é estável e não mudando, e os selos em todos os acessórios parecem ser apertado e selado. </li><li> Depois de três ensaios foram realizados e o analista tem confiança na capacidade para controlar DO, anexar a linha de gás para o bubbler e bolha ao equilíbrio novamente. </li><li> Bolha até ao equilíbrio, anexando a linha de gás de 3 mm de diâmetro para o borbulhador de aquário e iniciando a adição de ar ambiente para a água até que a concentração dede oxigénio na água não aumentar ou alterar durante 3 min. </li><li> Uma vez em equilíbrio, parar borbulhando e abre o frasco. </li></ol> 4. Stonefly Experiment Push-up <ol><li> Dividir o número total de stoneflies ao número de observadores para determinar o número de ensaios a realizar. </li><li> Determinar diferentes níveis de OD entre 2 e 10 mg / L para avaliar a resposta comportamental de stoneflies (número de flexões). </li><li> Configure um frasco por tentativa e adicionar um número igual de stoneflies como há observadores para o frasco (4 stoneflies dentro deste design), coloque a sonda e o tubo de volta para o balão, em seguida, feche o frasco com a tampa de borracha. Nota: Uma concentração de DO inicial de 10 mg / L foi escolhido como o primeiro ponto de observação, uma vez que era a concentração de OD da corrente a partir de onde os stoneflies foram amostrados. </li><li> Uma vez que a água é de 10 mg / L por borbulhamento seguintes etapas 2,10-2,11, registar a temperatura da água inicial e permitir ostoneflies para anexar ao substrato rocha no frasco. </li><li> Atribuir apenas um observador para assistir a um único stonefly para garantir uma contagem precisa do comportamento do push-up, que é o movimento do corpo para cima e para baixo exibida pela stonefly. </li><li> Contar e registrar o número de flexões observados ao longo de um período de observação 3 min. </li><li> Manipular FAZER para o próximo nível de OD experimental e repetir período de observação de 3 minutos para os níveis experimentais adicionais. Nota: Dentro deste desenho experimental, três níveis de OD diferentes foram avaliados. </li></ol> 5. Análise Estatística <ol><li> Para executar número médio utilização análise estatística de flexões nas quatro stoneflies através de um grupo para um determinado julgamento DO. </li><li> Use o software estatístico R computação livre de 12 para executar uma análise de variância (ANOVA) sobre o número de flexões e as concentrações fazer usando a ordem de cada ensaio experimental (DO nível) e temperatura que covariates. Analisados ​​fazer como níveis discretos de um único fator. </li><li> Use um teste de normalidade de Anderson-Darling na resíduos para verificar a normalidade 13. </li><li> Executar uma regressão linear nos dados locando a média do número de flexões contra concentrações de OD. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoback, W., Stanley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+in+hypoxia.">Insects in hypoxia.</a> J. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

As etapas críticas Este procedimento proporciona um modo simples e eficaz para manipular OD num ambiente de laboratório para realizar estudos comportamentais em organismos aquáticos. Descobrimos que haja vários críticos passos / itens para estar ciente de quando realizar este experimento que directamente relacionada com os resultados. Dentro de um teste, é crítica para manter a pressão da câmara a fim de evitar alterações na pressão parcial de gases acima da água, e subsequente FAZER flutuações. Se...

oxigênio dissolvido (OD) é um parâmetro físico-químico chave importante na mediação de uma série de processos biológicos e ecológicos nos ecossistemas aquáticos. Exposições a sub-letal hipóxia aguda e crónica reduzir as taxas de crescimento em certos insetos aquáticos e reduzir a sobrevivência dos insetos expostos 1. Este protocolo foi desenvolvido para fornecer um método controlado para manipular os níveis de OD em água corrente para observar os efeitos sobre o comportamento animal. Desde a sobrevivência todos os organismos aquáticos aeróbios &#39;depende da concentração de oxigênio para viver e se reproduzir, alterações na concentração de OD são muitas vezes reflete em mudanças de comportamento por organismos. Invertebrados aquáticos móveis mais e peixes foram observados para responder a baixas concentrações de oxigênio (hipóxia), buscando locais com maior DO 2,3. Para os organismos aquáticos menos móveis, adaptações comportamentais para aumentar a ingestão de OD pode ser a única opção viável. A ordem de macroinvertebrados aquáticos de Plecoptera (stonefly) foi anotado para realizar movimentos &quot;push-up&quot; para aumentar o fluxo de água e absorção de oxigênio, através de suas brânquias externas 4 - 6. Estes comportamentos adaptativos foram observados em ambientes naturais e em experiências de laboratório. manipulação laboratorial de OD na água abre oportunidades significativas para estudos de comportamento animal, mas existem lacunas significativas na implantação metodológica. Por exemplo, um estudo utilizou grandes aquários para avaliar o tempo fisiológico resposta do baixo Largemouth (Micropterus salmoides) para ambientes hipóxicos seguinte gaseamento com nitrogênio, mas pouca detalhe é dado para a metodologia 7. Outro estudo realizado na zebra peixes (Danio rerio) descreveu o uso de gás de azoto e uma pedra porosa para entregar gás para água e reduzir a DO da água 8. Para aplicações baseadas em química, métodos de desgaseificação de solventes utilizam especializadaAparelho 9-11 para remover o oxigénio a partir de solventes, mas não seria adequado para estudos de comportamento animal. Embora esses estudos empregar métodos para remover oxigênio da água, nenhum método descritivo puderam ser identificados que permitem a avaliação do comportamento animal em resposta a mudanças FAZER. Este método descrito a seguir é uma tentativa de descrever completamente um protocolo para a manipulação de OD de água utilizando gás nitrogênio. Além disso, este método foi desenvolvido no sentido de observar as relações entre o comportamento stonefly (flexões) e fazer isso era empregado em um laboratório de biologia de nível de calouro. Uma das principais vantagens deste método é que ele pode facilmente ser realizada dentro de um laboratório com vidros e materiais acessíveis para a maioria das instituições de ensino secundário e superior comum. O protocolo também é facilmente adaptável, permitindo a indivíduos para escalar o procedimento para cumprir os objectivos estabelecidos para aplicações de pesquisa ou de ensino. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>Filter flask 2 L</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stopper size 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z164534</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 Clear Plastic Tubing</td><td>Thermo Scienfitic</td><td>8001-1216</td><td></td></tr><tr><td>Whisper 60 air pump</td><td>Tetra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard flexible Air line tubing</td><td>Penn Plax</td><td>ST25</td><td></td></tr><tr><td>0.25 inch Copper tubing</td><td>Lowes Home Improvement</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>Male hose barb</td><td>Grainger</td><td>5LWH1</td><td></td></tr><tr><td>Female Connector</td><td>Grainger</td><td>20YZ22</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter</td><td>Extech</td><td>407510</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Matheson TRIGAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radnor AF150-580 Regulator</td><td>Airgas</td><td>RAD64003036</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple approach to manipulate dissolved oxygen for animal behavior observations

A capacidade de manipular o oxigênio dissolvido (OD) em um ambiente de laboratório tem aplicação significativa para investigar uma série de questões de comportamento ecológico e organismos. O protocolo aqui descrito proporciona um método simples, reprodutível e controlado para manipular DO para estudar a resposta comportamental em organismos aquáticos que resultam de hipoxia e condições anóxicas. Durante a execução de desgaseificação de água com nitrogênio é comumente usado em configurações de laboratório, nenhum método explícito para aplicação ecológica (aquático) existe na literatura, e este protocolo é o primeiro a descrever um protocolo para desgaseificar água para observar a resposta do organismo. Esta técnica e protocolo foram desenvolvidos para aplicação directa de macroinvertebrados aquáticos; No entanto, pequenos peixes, anfíbios e outros vertebrados aquáticos poderia ser facilmente substituído. Ele permite a fácil manipulação dos níveis de OD variando entre 2 mg / L até 11 mg / L, com estabilidade de até um período de observação de animais-5 min.Além de um período de 5 min de observação temperaturas da água começou a subir, e aos 10 min FAZER níveis tornou-se demasiado instável para manter. O protocolo é escalável para o organismo estudo, reprodutível e confiável, permitindo uma rápida implementação em laboratórios de ensino introdutório e aplicações de pesquisa de alto nível. Os resultados esperados desta técnica deve relacionar dissolvido mudanças de oxigênio para as respostas comportamentais de organismos.

<html> Seis estudos da configuração descrita foram realizados por 24 calouros estudantes de graduação em um ambiente de laboratório de ensino para quantificar o número de flexões stoneflies executar em resposta a concentração de OD diferente na água. O número médio de flexões realizada dentro de um nível de OD e dentro de cada ensaio foi reunida para traçar flexões contra o nível de OD na Figura 2. Uma análise de variância foi realizada inicialmente uti...

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A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

Este artigo descreve um protocolo simples e reprodutível para manipular condições de oxigénio dissolvido em um ambiente de laboratório para estudos de comportamento animal. Este protocolo pode ser utilizado tanto em ambientes de ensino e laboratórios de investigação para avaliar a resposta do organismo de macroinvertebrados, peixes, anfíbios ou a alterações na concentração de oxigênio dissolvido.

Uma abordagem simples para manipular oxigênio dissolvido para o comportamento animal Observações

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

a-simple-approach-to-manipulate-dissolved-oxygen-for-animal-behavior

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

9.2K visualizações.  Juniata College.  Este artigo descreve um protocolo simples e reprodutível para manipular condições de oxigénio dissolvido em um ambiente de laboratório para estudos de comportamento animal. Este protocolo pode ser utilizado tanto em ambientes de ensino e laboratórios de investigação para avaliar a resposta do organismo de macroinvertebrados, peixes, anfíbios ou a alterações na concentração de oxigênio dissolvido. 

Vídeo: A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The Benthic Exchange of O2, N2 and Dissolved Nutrients Using Small Core Incubations

The measurement of sediment-water exchange of gases and solutes in aquatic sediments provides data valuable for understanding the role of sediments in nutrient and gas cycles. After cores with intact sediment-water interfaces are collected, they are submerged in incubation tanks and kept under aerobic conditions at in situ temperatures. To initiate a time course of overlying water chemistry, cores are sealed without bubbles using a top cap with a suspended stirrer. Time courses of 4-7 sample points are used to determine the rate of sediment water exchange. Artificial illumination simulates day-time conditions for shallow photosynthetic sediments, and in conjunction with dark incubations can provide net exchanges on a daily basis. The net measurement of N2 is made possible by sampling a time course of dissolved gas concentrations, with high precision mass spectrometric analysis of N2:Ar ratios providing a means to measure N2 concentrations. We have successfully applied this approach to lakes, reservoirs, estuaries, wetlands and storm water ponds, and with care, this approach provides valuable information on biogeochemical balances in aquatic ecosystems.

The Benthic Exchange of O2, N2 and Dissolved Nutrients Using Small Core Incubations

Here, we present small core incubations for the measurement of sediment-water gas and solute exchange. These will provide reliable measurements of sediment-water exchange that assess the role of sediment in influencing biological and biogeochemical processes in aquatic ecosystems.

A Bolsa Benthic de O<sub&gt; 2</sub&gt;, N<sub&gt; 2</sub&gt; e nutrientes dissolvidos Usando pequeno núcleo incubações

The measurement of sediment-water exchange of gases and solutes in aquatic sediments provides data valuable for understanding the role of sediments in ...

Ambiente

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response to diel-cycling hypoxia. A Wheatstone bridge was connected to strain gauges that were attached to the shells of oysters (Crassostrea virginica). The recorded signals allowed for the opening and closing of the bivalves to be recorded continuously over two-day periods of experimentally-induced diel-cycling hypoxia and diel-cycling changes in pH. Here, we describe a protocol for developing an inexpensive strain gauge monitor and describe, in an example laboratory experiment, how we used it to measure the valve gape behavior of Eastern oysters (C. virginica), in response to diel-cycling hypoxia and cyclical changes in pH. Valve gape was measured on oysters subjected to cyclical severe hypoxic (0.6 mg/L) dissolved oxygen conditions with and without cyclical changes in pH, cyclical mild hypoxic (1.7 mg/L) conditions and normoxic (7.3 mg/L) conditions. We demonstrate that when oysters encounter repeated diel cycles, they rapidly close their shells in response to severe hypoxia and close with a time lag to mild hypoxia. When normoxia is restored, they rapidly open again. Oysters did not respond to cyclical pH conditions superimposed on diel cycling severe hypoxia. At reduced oxygen conditions, more than one third of the oysters closed simultaneously. We demonstrate that oysters respond to diel-cycling hypoxia, which must be considered when assessing the behavior of bivalves to dissolved oxygen. The valve SGM can be used to assess responses of bivalve molluscs to changes in dissolved oxygen or contaminants. Sealing techniques to better seal the valve gape strain gauges from sea water need further improvement to increase the longevity of the sensors.

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Understanding the behavioral responses of bivalve suspension-feeders to environmental variables, such as dissolved oxygen, can explain some ecosystem processes. We have developed an inexpensive, laboratory-based, strain gauge monitor (SGM) to measure valve gape responses of oysters, Crassostrea virginica, to diel-cycling hypoxia and cyclical pH.

Um Monitor de Strain Gauge (SGM) para válvula contínua Gape medições em moluscos bivalves em resposta à hipóxia laboratório induzido Diel-ciclismo e pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological states of islet hypoxia, especially in transplant environments. Standard hypoxic chamber techniques cannot modulate both stimulations at the same time nor provide real-time monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors. To address these difficulties, we applied a multilayered microfluidic technique to integrate both aqueous and gas phase modulations via a diffusion membrane. This creates a stimulation sandwich around the microscaled islets within the transparent polydimethylsiloxane (PDMS) device, enabling monitoring of the aforementioned coupling factors via fluorescence microscopy. Additionally, the gas input is controlled by a pair of microdispensers, providing quantitative, sub-minute modulations of oxygen between 0-21%. This intermittent hypoxia is applied to investigate a new phenomenon of islet preconditioning. Moreover, armed with multimodal microscopy, we were able to look at detailed calcium and KATP channel dynamics during these hypoxic events. We envision microfluidic hypoxia, especially this simultaneous dual phase technique, as a valuable tool in studying islets as well as many ex vivo tissues.

Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Bioengenharia

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Bioquímica

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Biologia do Desenvolvimento

A Low-Cost Method of Measuring the In Situ Primary Productivity of Periphyton Communities of Lentic Waters

Measuring the in situ primary productivity of periphyton during the growing season gradient can elucidate the quantitative effect of environmental drivers (mainly phosphorus concentration and light intensity) and species composition on primary productivity. Primary productivity is mainly driven by light intensity, temperature, availability of nutrients, and distribution of the ionic species of the carbonate system in the respective depths of the euphotic zone. It is a complex system that is very difficult to simulate in the laboratory. This cheap, transportable, and easy-to-build floating barge allows measuring the primary productivity accurately-directly under the actual natural conditions. The methodology is based on measuring the primary productivity in real time using noninvasive oxygen sensors integrated into tightly sealed glass jars, enabling online oxygen flux monitoring and providing new insights into metabolic activities. Detailed seasonal in situ measurements of gross primary productivity of microbial mats (or other benthic organisms) can improve current knowledge of the processes controlling primary productivity dynamics in lentic waters.

A Low-Cost Method of Measuring the In Situ Primary Productivity of Periphyton Communities of Lentic Waters

Presented here is a cost-effective and transportable method/facility for measuring the primary productivity of microbial mats under actual in situ environmental temperature and light conditions. The experimental setup is based on widely available materials and can be used under various conditions while offering the advantages of laboratory-based models.

Um Método de Baixo Custo para Medir a Produtividade Primária In Situ de Comunidades de Perifítons de Águas Lênticas

Measuring the in situ primary productivity of periphyton during the growing season gradient can elucidate the quantitative effect of environmental drivers ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Biologia

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Adaptando a microrrespirometria para Drosophila - Insights sobre o metabolismo mutante CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autor em destaque: Influência da temperatura na Drosophila melanogaster e besouros adaptados ao deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Uma abordagem simples para manipular oxigênio dissolvido para o comportamento animal Observações

Resumo

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