Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Preparação para a Formação de alginato de Discos <ol><li> Prepara-se uma 4% (w / v) em solução de alginato de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio e colocar num banho de água a 37 ° C. As concentrações da solução de alginato pode variar, mas 1-4% (w / v) de soluções de alginato são recomendados. </li><li> Misturar a solução de alginato a uma razão de 1: 1 com a base de meios de cultura de célula quente (por exemplo, Modified Eagle Médium da Dulbecco.) Para o tipo de célula desejado. A concentração de alginato é agora metade da concentração original, isto é., 2% (w / v). Esterilizar solução de alginato / mídia usando filtros de seringa de nylon de 0,2 um estéreis. </li><li> Preparar um banho de cloreto de cálcio di-hidratado 102 mM estéril em água estéril com solução suficiente para submergir moldes (~ 200 - 300 ml). </li><li> Recolher o estéril &quot;molde de formação de gel&quot; (diâmetro x 3 mm poços cilíndricos de altura de 6 mm em um 3 in x 3 em chapa de alumínio, consulte <strong&gt; Figura 1) e placas terminais (inferior: um 3 em x 3 em chapa de alumínio, Top: um 1,5 em x 3 em chapa de alumínio) e preparar moldes da seguinte forma: <ol><li> Cortar papel grosso filtro (filtro de papel mata-borrão) ea membrana microsieve celular (10 de tamanho de poro) para os tamanhos de parte superior e placas terminais inferiores e colocá-los no banho de cloreto de cálcio até à saturação, a cerca de 1 min. Se desejado, esterilizar o papel de filtro grosso e a membrana microsieve através de autoclave ou luz ultravioleta durante 30 min antes da utilização. </li><li> Defina-se a metade (metade inferior) da construção de moldes. <ol><li> Colocar os seguintes itens cima da outra na seguinte ordem e suavizar usando uma espátula estéril: grande placa terminal (3 em x 3 pol), papel de filtro de espessura, e, em seguida, a membrana microsieve. </li><li> Invertido e pressionar o molde para uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio. </li><li> Coloque a &quot;gel de molde de formação&quot;, com os poços cilíndricos no topo do cell membrana microsieve e suavemente aperte o molde juntos em dois lados usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. Certifique-se de deixar espaço suficiente para a parte superior da placa terminal (1,5 in x 3 in) para cobrir os poços completamente mais tarde. </li></ol></li><li> Defina-se a segunda metade (metade superior) da construção de moldes. <ol><li> Coloque os seguintes itens em cima de um ao outro na seguinte ordem e suavizar: pequena placa terminal, papel de filtro grosso, membrana microsieve. </li><li> Invertido e pressiona esta metade do molde sobre uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio. Não fixe nesta parte do molde utilizando grampos da pasta no momento. </li></ol></li></ol></li><li> células de cultura, tal como recomendado por instruções do fabricante. Colheita das células desejadas para incorporar nos hidrogéis de alginato em camadas. A densidade celular recomendada é de 1 - 2 x 10 6 células / ml, mas isto pode ser variado dependendo experiências desejadas. Nota: Ao usar este métodopara fazer camadas com diferentes tipos de células, certifique-se de cultura dois tipos de células em paralelo para mergulhar. As células estaminais mesenquimais (MSCs) semeadas a uma densidade celular de 1 x 10 6 células / ml será utilizado como um exemplo para o seguinte protocolo. O número de células e o número de disco pode ser dimensionado para as experiências conforme necessário. <ol><li> Uma a duas semanas antes da incorporação, as células estaminais mesenquimais semente a uma densidade celular de 3000 - 5000 células / cm2 em 10 mL de meio de crescimento basal (Dulbecco Modified Eagle Médium, 10% de Soro Fetal Bovino, 2% de L-Glutamina, 1 % Aminoácidos não essenciais, 1% de penicilina / estreptomicina) em frascos T-75. </li><li> Remova a mídia passou a cada 2 - 3 dias, e substituir com 10 ml de meio de crescimento basal até que as células são 80 - 90% confluentes. </li><li> Para colher as células, remova meio gasto e pipeta de 3 ml de 1x Dulbecco salina de tampão fosfato sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio para lavar as células. Remover esta solução, pipeta 3 ml de 0,25% Trypsin-EDTA sobre as células que crescem em frascos T-75, e incubar durante 5 min a 37 ° C. Após as células têm levantado da superfície aderente, adicionar 6 - 9 ml de meio de crescimento basais. </li><li> MSCs centrifugue-as a 600 xg durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e re-suspensão em 1-5 ml de meio de crescimento basais. Contar as células usando um hemocitômetro utilizando as instruções do dispositivo. </li><li> Retirar 1 x 10 6 células da resuspensão de células totais, de centrifugação utilizando as mesmas condições, e aspirar o sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. Formação de celulares Seeded alginato Discs <ol><li> Re-suspender o sedimento de células com 1 ml de solução de alginato / meios estéreis para atingir uma densidade celular de 1 x 10 6 células / ml. A mistura de células-alginato será homogeneamente um aspecto turvo, quando as células são misturadas de forma adequada. </li><li> Pipete 130 pi da mistura de células-alginato em poços seis altos 6 mm de diâmetro x 3 mm na metade inferior do moldeconstruir gota a gota, de modo a não criar quaisquer bolhas. Um ligeiro menisco convexo deve ser visível acima do bordo de cada poço. </li><li> Cuidadosamente suavizar a metade superior da construção do molde usando uma espátula estéril e entregá-lo, de modo que a membrana da célula é microsieve na parte superior dos poços. Coloque o molde na construção de topo dos poços, tendo o cuidado de cobrir os poços que contêm células e a mistura de alginato completamente. </li><li> Levante a construção do molde carregado e, enquanto pressiona firmemente no centro, Mola os restantes dois lados (superior e inferior) para prender as metades superior e inferior da construção do molde. As soluções de células-alginato deve ser firmemente situado nos poços neste momento. </li><li> Mergulha-se o construto de molde fixada no banho de cloreto de cálcio 102 mM, certificando-se que toda a construção é submerso. Incubar na capa de cultura de células à temperatura ambiente durante 90 min. </li><li> No final dos 90 minutos, remover a construção do molde a partir do cloreto de cálcio 102 mMbanho e coloque em uma pilha de toalhas de papel na capa de cultura de células. Remove todos os quatro grampos da pasta e separar as duas metades do molde de construção. Hidrogéis formados nos poços não deve ter quaisquer bolhas e deve encher os poços completamente. </li><li> Com uma espátula, rastrear cuidadosamente o bordo dos poços contendo os hidrogéis para soltar cuidadosamente e cunha os hidrogeles. Depois de retirar os hidrogeles a partir da construção de moldes, soltar os hidrogéis directamente para um banho de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Cobrir os geles completamente para lavar o excesso de solução de cloreto de cálcio para 1-5 min. </li><li> Transferir os hidrogeles em solução basal meio de crescimento em prato desejado (por ex., Placas de 6 cavidades) que cobre completamente os hidrogeles. Incuba-se durante pelo menos 1 hora na incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2 antes de continuar para o passo de estratificação. Nota: Os hidrogeles que contêm as células podem ser mantidas ema incubadora de cultura de células indefinidamente neste momento até camadas de géis com uma outra população celular é desejada, desde que mudanças de suporte são concluídos a cada 2 - 3 dias. </li></ol> 3. Camadas de alginato de Discos <ol><li> Durante a última meia hora da incubação de 1 hora, recolher e preparar moldes e solução estéril para o recozimento os géis. <ol><li> Prepara-se o &quot;molde de corte&quot; pela fixação de um molde que tem cavidades de metade da altura do &quot;molde de formação de gel&quot; (6 mm de diâmetro x 1,5 mm de poços altos em um 3 em x 3 na placa de alumínio) a uma placa terminal (3 em x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. </li><li> Preparar o &quot;molde de recozimento&quot;, fixando um molde que é de 3 mm de diâmetro maior do que o &quot;molde de formação de gel&quot; (9 mm de diâmetro x 3 mm poços altos em um 3 in x 3 em chapa de alumínio) a uma placa terminal (3 in x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. </li><li> Prepara-se uma solução decitrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetra-acético ácido) em água estéril. </li></ol></li><li> Remover géis de populações de células desejadas (neste exemplo, dois discos com hMSCs) dos meios de comunicação no prato e colocar nos poços &quot;corte do molde&quot;. Cada gel deve caber confortavelmente nas cavidades com metade do gel salientes acima do molde. </li><li> Utilizando um bisturi, cortar o gel ao longo da superfície do molde (isto reduzirá o hidrogel em meio). Virar a metade superior do gel e colocá-lo em um poço de molde aberto. A metade do gel também deve caber dentro do molde bem, mas agora ambos os géis metade deve ser a altura do molde, com a superfície interior cortado visível. Repita com o segundo gel. Nota: Atenção: Só as superfícies de corte interiores irá formar discos em camadas. Usando as superfícies exteriores resultará na separação metades. Suspeita-se que a textura da membrana microsieve transferida para a superfície do gel de evitarO sucesso do processo de recozimento. </li><li> Coloque um pedaço de membrana celular microsieve seco no topo das cavidades, certificando-se que a membrana microsieve está em contacto com todas as metades de gel a ser recozido e cobrindo-as totalmente. Coloque papel de filtro grossa no topo da membrana microsieve, certificando-se de cobrir completamente os géis. </li><li> Pipetar uma solução de citrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetraacético ácido) para o papel de filtro de espessura até que seja saturado. Cerca de 750 ul é suficiente para quatro poços. </li><li> Incubar os géis durante 1 min à temperatura ambiente. Em seguida, retire a membrana microsieve celular e papel de filtro grosso e descartá-las. Remova os grampos da pasta e abrir o molde. </li><li> Para cada gel recozido, transferir um citrato de sódio half / tratado com EDTA do hidrogel ao preparado &quot;molde de recozimento&quot;, com superfície de corte virada para cima. Isto será um meio de const recozidoruct. </li><li> Usando uma espátula, levantar e colocar a / half-gel tratado com EDTA citrato de segunda sódio (pode conter um tipo de célula diferente) sobre o gel já no &quot;molde de recozimento&quot;, lançando nesta segunda meia-gel para que a superfície de corte está em contacto com a superfície do corte do gel já no &quot;molde de recozimento&quot;. </li><li> Pressione com cuidado os dois géis usando uma espátula para remover quaisquer bolhas de entre os dois géis. Além disso, reposicionar os géis, conforme necessário para garantir que eles estão directamente em cima uns dos outros. </li><li> Levante cuidadosamente o &quot;molde de recozimento&quot; e submergi-lo no banho de cloreto de cálcio 102 mM durante 30 minutos. Não cubra os poços com uma placa terminal. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, retire o &quot;molde de recozimento&quot; e colocá-lo para toalhas de papel. Remova os grampos da pasta e separar o molde da placa terminal. </li><li> Com uma espátula, recolher os géis recozidos e colocá-los em uma de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e mbanho de cloreto de agnesium para lavar os géis. Subsequentemente, transferir hidrogéis recozidos a meios de cultura de células em um prato desejado (por ex., Placa de 6 poços) durante a cultura. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a formação de discos de hidrogel de alginato em camadas para estudar a co-culturas de várias populações de células, tais como aqueles em tecidos fisiologicamente em camadas, por exemplo, cartilagem. estruturas em camadas, tal como a plataforma de cultura descrito, pode ser usado para examinar a interacção entre as duas populações de células distintas sujeitos ao mesmo ambiente de cultura ou sob carga. O alginato é um polissacarídeo linear aniónico que foi encontrado para ser biocompatível e tem sido utilizado com sucesso para a biologia e a engenharia de tecidos da cartilagem pesquisa 12,14. Hidrogeles de alginato são formadas utilizando catiões divalentes para a ligação cruzada, por exemplo., Os iões de cálcio. Estas ligações cruzadas pode ser desfeita, removendo os catiões utilizando um quelante, tal como citrato de sódio ou EDTA, e este processo tem sido usado previamente para isolar condrócitos que foram cultivadas nos géis 3,4,12. Da mesma forma, o mesmo princípioTambém tem sido aplicado com sucesso por aderir folhas de alginato em camadas duplas ou mesmo grupos de contas de alginato juntos 11,12,15. A plataforma descrito aqui baseia-se este mesmo processo, mas é usado para formar pequenas hidrogeles em camadas em forma de disco. Este é um processo de duas etapas em que em primeiro lugar, discos de alginato são formadas utilizando moldes submersos num banho rica em cálcio. Estes são, em seguida, cortada ao meio e tratou-se com uma solução de quelante de cálcio para libertar localmente os iões de cálcio a partir do alginato de ligação cruzada. Ao colocar estas superfícies tratadas em conjunto e re-imergindo os discos em uma solução rica em cálcio, as reticulações são reformados, fazendo construções bi-camadas. Estas pequenas géis em camadas eliminar a necessidade de punções para gerar amostras fáceis de cultura compatíveis com os ensaios e experiências tais como ensaios mecânicos, como mostrado na Figura 4, minimizando assim a perda de células muitas vezes preciosos, bem como materiais de fabricação. Como mostrado emA Figura 3, este processo de formação de camadas e os hidrogéis resultou em viabilidade igualmente elevado como o controlo ou a granel hidrogéis indicando que este procedimento não é excessivamente tributar para a população de células, apesar de o comprimento e a ausência de nutrientes reabastecimento. A falta de uma região de sobreposição inicial no gel permite a separação física durante a co-cultura inicial e a capacidade de observar alterações para que a interface ao longo do tempo. Estudos têm demonstrado que ao longo de períodos longos de cultura esta interface pode perder devido à definição cruzada infiltração celular e a deposição de matriz extracelular 11. Enquanto o disco em camadas inicial não conter quaisquer moléculas de adesão, como a matriz extracelular é depositado, há também um potencial para investigar a fusão de populações de células e alterar a interface entre as camadas. Estes discos bi-camadas pode ser facilmente utilizado para a estimulação de compressão dinâmica. Fomos capazes de confirmar que these hidrogeles suportar a compressão dinâmica, sem separação das metades. No entanto, durante este processo, a carga de pico exibida pelos hidrogeles em camadas durante a compressão cíclico de quatro horas foram consideradas significativamente diferentes dos não-camadas, em massa, hidrogéis. Este resultado sugere complexo, transferência de estirpe não-linear entre as camadas e revelam a necessidade de um gel de controlo fisicamente em camadas, por ex., Hidrogel bi-camadas com a mesma população de células / condição em cada camada, um pormenor importante notar ao planear a delineamento experimental para estudos envolvendo carga mecânica. Melhor compreensão das diferenças observadas poderia ser alcançado através de modelagem computacional de mecânica espaciais dentro desses géis. Não só se tais análises ajudar a esclarecer a distribuição e transferência de tensão entre as camadas, mas seria também instrumental para interpretar o comportamento celular nestes géis em camadas, especialmente com camadas de diferentes características mecânicas. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Trata-se de um sistema de cultura versátil que pode ser usado para a separação física de populações de células durante a co-cultura, tal como descrito. Além disso, ele também pode ser usado como uma estrutura de base para o desenvolvimento. As alterações à estrutura existente podem incluir o aumento do número de camadas, alterando os tamanhos ou a rigidez relativa das camadas, e a incorporação de componentes de matriz extracelulares adicionais em uma ou mais das camadas. No entanto, estas expansões exigirá uma avaliação cuidadosa. Em adição a alterações na distribuição de forças ao longo dos discos, aumentando o tamanho e o número de camadas pode levar a uma diminuição da viabilidade celular no centro dos géis e instabilidade física durante a estimulação mecânica. Além disso, grandes adições de matriz extracelular e proteínas de estimulação ou de alterações do alginato para proporcionar porções de adesão podem interferir com os processos de formação de gel e recozimento. Este wa plataforma de culturas desenvolvido para aplicações de pesquisa para investigar as relações entre diferentes populações de células em cultura 3D. Assim, é limitada pela sua falta de escalabilidade para aplicações clínicas. Métodos alternativos para a criação de hidrogéis em camadas, como a impressão em 3D, pode vir a ser mais clinicamente relevante devido aos avanços de escalabilidade futuros antecipados, o controle sobre microestrutura no interior do disco, e personalização de características geométricas macroescala. Para aplicações de pesquisa, como apresentado aqui, os discos de alginato não fornecem independentemente porções de adesão para as células, o que pode limitar a sua aplicação a outros tipos de células. A alternativa comparável ao alginato quando considerando a facilidade de utilização é de agarose, que sofre de limitações similares. Além disso, requer o uso de enzimas para libertar as células para análise a jusante, enquanto que as reticulações de alginato pode ser removido com segurança a utilização de agentes quelantes de cálcio. Principalmente, esta plataforma de cultura vai ajudar com a melhoria da understanding de relações entre as populações de células em hidrogéis e potencialmente os efeitos de estimulação mecânica destas co-culturas. Este entendimento vai, em seguida, informar o desenvolvimento de terapias para tecidos heterogêneos, especialmente carregar tecidos que ostentam tais como cartilagem articular ou discos intervertebrais.

tecidos que suportam cargas de compressão, tais como a cartilagem articular ou discos intervertebrais consistem em regiões de tecidos heterogéneos que são críticas para a função tanto biomecânico e mecano-transdução adequada no tecido. Não só é a organização celular e a função distinta em diferentes regiões, mas as matrizes extracelulares (ECM) são também variou em composição e organização. Por exemplo, a cartilagem articular é constituído por três zonas primárias com morfologia, variando de células, função mecânica, e ECM. As diferenças na sua vantagem ECM para diferencial responsabilidades suporte de carga; a camada superficial está envolvida principalmente em resposta à tração para carregar, enquanto as zonas média e profunda são principalmente responsáveis ​​pela resposta à compressão 1. Da mesma forma, no disco intervertebral, um núcleo pulposo do tipo gel é rodeado por um anel fibrose lamelar e as células dentro dessas duas áreas distintas experimentar diferentes tipos de estímulos biofísicos2. Nestes tipos de tecidos, células e as matrizes extracelulares no interior das camadas de tecido interagir uns com os outros como o tecido sofre e responde a forças mecânicas. Recapitulação de tais estruturas de tecidos heterogêneos continua a ser um desafio em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, e nossa compreensão de seu significado biológico é limitado. Existe uma necessidade para a cultura de plataformas para analisar tecidos estratificados, bem como co-culturas de diferentes populações de células dentro de uma construção. Na engenharia de tecidos de cartilagem articular, construções de andaime-menos camadas foram construídos através do aproveitamento da capacidade dos condrócitos zonal para depositar ECM variou para imitar as diferentes camadas desse tecido 3,4. No entanto, as construções de hidrogel em camadas proporcionam uma oportunidade para estudar a interacção de diversos tipos de populações de células que não possuem a capacidade para formar um tecido robusto independentemente. Por exemplo, pop diferenteulations de células estaminais mesenquimais podem ser co-cultivadas dentro de construções em camadas. Tais andaimes em camadas têm sido utilizados com ambas condrócitos e diferenciação de células-tronco mesenquimais para melhorar a engenharia de tecidos 5. Não só pode ser co-cultivadas em populações de células diferentes camadas de hidrogel semelhantes, mas um único tipo de células também podem ser cultivadas dentro de camadas que foram manipuladas para ter diferentes rigidez ou conteúdo bioquímico para desencadear respostas diferentes a partir de células de 6,7. Muitos hidrogeles biomaterial diferentes têm sido utilizados para a camada de populações de células para engenharia de tecidos de cartilagem, tais como aqueles utilizando polietileno-glicol ou álcool polivinílico bases 7-9. No entanto, os hidrogéis de alginato são um dos biomateriais mais simples do que para criar andaimes em camadas para o estudo de populações de células heterogéneas em co-cultura. Embora os hidrogéis de agarose são também facilmente formado, hidrogéis de alginato tem a vantagem adicional de permitir fácil éolation de células a partir da construção 3-D para a análise de células individuais como foi anteriormente descrito 10. Em estudos anteriores, os hidrogéis de alginato bi-camadas foram formadas em folhas finas e a partir destas folhas, secções foram cortados (por exemplo., Utilizando um punção de biópsia) para aplicações particulares, tais como por análise de conteúdo bioquímica ou propriedades de cisalhamento interfacial 11,12. Outro método para a formação de folhas finas de alginato tem sido descrita com o potencial para a estratificação em camadas múltiplas, mas mesmo assim iria requerer uma alteração ao hidrogel para utilização em testes mecânicos 13. Aqui, apresentamos um método para criar reproducibly discos de hidrogel de alginato bi-camadas para uso em co-cultura de diferentes populações de células. Esta plataforma disco de alginato possui várias vantagens. Em primeiro lugar, a forma reprodutível e tamanho pequeno é propício para a estimulação mecânica das células incorporados sem a necessidade de uma biópsia PUNCH ​​ou outra alteração física para o hidrogel para muitas aplicações. Além disso, a viabilidade das células permanece elevada durante o processo de separação e, após formação de gel uma clara separação das duas populações de células dentro do gel é visível sem região de sobreposição inicial.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

A Figura 1 descreve a formação e estratificação dos hidrogéis de alginato. Completado géis bi-camadas exibem uma separação inicial completa de populações de células, como mostrado na Figura 2. A viabilidade celular das células estaminais mesenquimais humanas) incorporado dentro desses hidrogeles e camadas continua a ser elevada e comparável com os hidrogeles a granel, como mostrado na Figura 3. A viabilidade foi avaliada após o recozimento, cortando os géis verticalmente para acessar o centro e, em seguida, coloração das células vivas nos géis recozidos com um rastreador de células vivas, CMFDA (verde) e as células mortas (vermelho) com Ethidium homodímero-1 utilizando as instruções do fabricante. Confocal Z-pilhas foram tomadas da superfície de corte utilizando um microscópio de fluorescência de aproximadamente 100 ^ M para o gel. Estas imagens foram projetadas em uma imagem 2D. células vivas e mortas foram então quantificados utilizando o recurso de analisador de partículas no software ImageJ. <p<html> classe = &quot;jove_content&quot; FO: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Quisemos verificar que estes hidrogeles em camadas, as células falta, seria capaz de suportar a compressão cíclico, semelhante à necessária para induzir uma resposta condrogénica. Descobrimos que os hidrogéis que permanecem intactos depois de sete dias em cultura e subsequente compressão cíclico não-confinado durante 4 horas a 1 Hz 0-10% de deformação. No entanto, depois de se isolar o pico de tensão de cada ciclo e analisando as tendências durante a estimulação de quatro horas, as tendências indicam que os hidrogeles em camadas têm uma resposta diferente à compressão cíclico em comparação com a maior parte, não-camadas, hidrogéis. Compressão cíclica mais de quatro horas resultou em significativamente diferentes (p = 0,03) tendências pico de estresse entre géis em camadas e não em camadas (Figura 4). As estatísticas foram cumpridas por meio de teste T-Student (alfa = 0,05). jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemático de formação em camadas Hidrogel A. Imagem do molde empilhadas para a adição de 2% de alginato + mistura de células com uma representação da ordem de empilhamento para as metades do molde de fundo e de topo. B. Esquema procedimento que descreve para camadas do gel. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54380/54380fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig2.jpg" /> Figura 2:. Separação Representante de populações de células numa linha celular Layered Hidrogel Modelo células 293FT HEK foram quer corados com rastreador de células vivas CMFDA (verde) ou CMTPX (vermelho). Cada um destes grupos de células foram embebidos em 2% (w / v) de alginato de discos, e, em seguida, as metades de estes discos foram mergulhados em conjunto. Um pedaço foi cortado do lado da CMTPX para identificá-lo durante o exame. Barra de escala = 100 &amp; #181;. M <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54380/54380fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig3.jpg" /> Figura 3:. Viabilidade alta celular dentro de camadas de hidrogel após Camadas processo está completo células-tronco mesenquimais humanas incorporadas em hidrogéis a granel e bi-camadas foram coradas com células vivas (verde) rastreador CMFDA e células mortas (vermelho) foram coradas com Ethidium homodímero-1 . Viabilidade manteve-se elevada para ambos os grupos de hidrogel após o processo de estratificação. Barra de escala = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54380/54380fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54380/54380fig4.jpg" /> Figur. E 4: Trends significativamente diferente de camadas de hidrogel cíclico de compressão de Resposta para cíclico de compressão hidrogéis foram incubadas numa incubadora de cultura de células durante sete dias e, subsequentemente, submetidas a 0 - 10% de compressão cíclico não-confinado durante quatro horas a 1 Hz. as tensões de pico (± SEM) para cada ciclo foram isolados e as tendências ao longo do período de carregamento analisados. Tendências sob compressão cíclica unconfined 0-10% de deformação de camadas (n = 9) e volume (n = 8) géis são significativamente diferentes (p = 0,03). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54380/54380fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K visualizações.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Vídeo: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicina

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Suporte composto de matriz extracelular microgel para impressão 3D incorporada de construções neurais humanas

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...