We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundstr&#246;m at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Setup Assembléia <ol><li> Fabricação na arena em forma de estrela (19,5 cm por 19,5 cm por 0,7 cm) de politetrafluoretileno (PTFE), de acordo com o desenho (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) fornecidos. A arena podem ser fabricados por uma instalação de um costume ou comercial. </li><li> Adquirir duas placas de vidro (20,25 cm por 20,25 cm de altura com a espessura de 2 mm), e um furo (~ 0,7 cm de diâmetro) precisamente no centro de uma das placas de vidro, utilizando uma broca diamantada. </li><li> Fabricar uma caixa de comportamento à prova de luz para a arena comportamental. fabricar também uma caixa de câmera à prova de luz para a câmera de vídeo CCD infra-vermelho de acordo com os desenhos fornecidos (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). As caixas podem ser fabricados por um uma instalação personalizada comercial ou. </li><li> Montar o aparelho de ar condicionado na parede posterior e as matrizes de LED nas paredes laterais da caixa de comportamento. Coloque a sonda de temperaturana caixa de comportamento através de um orifício lateral para feedback de temperatura em tempo real e ajuste (ver Figuras 1 e 2 para detalhes). </li><li> Anexar o filtro IR e polarizador circular para a câmera, e montar o conjunto na caixa de câmera. A caixa de comportamento e caixa de câmera são separados por uma janela de vidro para melhor controle de temperatura da caixa de comportamento (ver Figuras 1 e 2 para detalhes). </li><li> Ligue a câmera CCD infravermelho a um adaptador de câmera. Ligue o adaptador de câmera para um conversor USB. Ligue o conversor USB a uma porta USB do computador para aquisição de dados. </li><li> Instalar o driver para o conversor de vídeo no computador de acordo com as instruções do fabricante. Opcionalmente, instale o software de processamento de imagem fornecida pelo fabricante do conversor de vídeo USB para acessar uma ampla gama de configurações de câmera e parâmetros de aquisição. </li><li> Ligue o aparelho de ar condicionado (por meio de &quot;output&quot;Na parte de trás do controlador de temperatura) e a sonda de temperatura (por meio de&quot; termopar &quot;na parte de trás do controlador de temperatura) para o controlador de temperatura. Colocar o sensor dentro da caixa de comportamento. Nota: O sistema de controle da temperatura no nosso esquema é capaz de manter a temperatura da caixa de entre 18 ° C e 30 ° C. Temperaturas ambientes mais elevadas ou mais baixas podem ser úteis para termogênico (ts dTrpA1, TRPM8 ou shibire) experimentos para manipular a actividade neuronal ou inibir a transmissão sináptica. Para a maioria das experiências, a temperatura é mantida a 25 ° C. </li><li> Monte o sistema de entrega de odor nas etapas seguintes (ver Figura 1B para esquemas detalhados e acessórios de conexão): <ol><li> Usar o regulador de pressão de ar para controlar a entrada de ar do sistema de ar condicionado central. Conectar um filtro de ar de carbono (cheio com carvão vegetal) para o regulador de pressão para purificar o ar a partir do centro de umsistema de IV. </li><li> Monte o sistema de controle de fluxo que consiste em múltiplos canais regulados por tubos do medidor de vazão de alta resolução. </li><li> Ligue a saída do filtro de ar de carbono para os tubos do caudalímetro através de um colector tal como mostrado na Figura 1B e 2F. Direcionar a saída dos tubos do medidor de vazão por meio de válvulas solenóide de 3 vias controlados eletronicamente para regular se o ar limpo deixando os medidores de vazão é expelido para a sala ou entrou em câmaras de odor feitas sob medida 24. </li><li> Instalar o controlador da válvula de solenóide de acordo com o manual do fabricante. </li></ol></li><li> Instalar o medidor de fluxo de ar electrónico, ligando-o a um dispositivo de aquisição de dados (DAQ) e uma fonte de alimentação de acordo com o manual do fabricante. Instalar o software de interface DAQ para verificar débitos iguais em cada quadrante da arena antes de cada experimento. </li></ol> 2. Olfativo Estímulos Preparação <ol><li> Prepare 5 odorcâmaras de formigas 24 que consistem em um recipiente de plástico exterior, vidro de embalagem interior, uma PTFE inserção tampa feito por encomenda, tampa do recipiente original com parte central removida e duas válvulas unidirecionais. Nota: Um anel em torno da tampa de PTFE pode ser usado para evitar fuga de ar da câmara de odores durante a perfusão de odor. Veja a Figura 1 para esquemática e a Figura 2 para fotos das câmaras. </li><li> Use quatro câmaras olfativos para controlos do solvente, e uma câmara para um odorante teste. Encher os recipientes de vidro com 1000 uL de diluição solvente ou odorante (odorantes de teste + solventes apropriados, misturar bem antes de experiências), colocar o recipiente de vidro no interior da câmara de plástico correspondente (não derramar o líquido para dentro da câmara de plástico) e aperte a tampa . Certifique-se de usar sempre uma câmara limpa para o odorante de teste e controlos do solvente. Nota: atração olfativo pode ser desencadeada por 1/16 de diluição de vinagre de maçã (5% de acidez) em water. Em contraste, o comportamento de repulsão olfactiva pode ser estudada utilizando uma diluição de 10% de propionato de etilo em óleo mineral. estímulos de controle nestes casos são câmaras de odor com óleo mineral puro. </li></ol> 3. Preparação Fly <ol><li> Traseira voa em meio fubá padrão. Coloque 30 do sexo masculino e 30 moscas parentais feminina em uma garrafa padrão, e deixá-los põem ovos durante 5 dias a 25 ° C ou à temperatura ambiente. </li><li> Para cada experiência, recolher recém eclosed (&lt;1 dia de idade) 25 do sexo masculino e 25 do sexo feminino voa sob breves CO 2 anestesia. </li><li> Manter moscas num frasco com meio de mosca padrão durante 2-4 dias. </li><li> 40-42 h antes da experiência, transferir as moscas sem CO 2 anestesia &#160; para um frasco com ~ 10 ml de gel de agarose 1%. Isto irá manter as moscas umidificadas sem alimentos, o que ajuda a aumentar a sua actividade locomotora. Nota: Mais de 90% das moscas deve sobreviver à inanição. Alguns genótipos são menos curartua e não pode fazê-lo através de uma fome de 40 horas. Nesses casos, períodos mais curtos, tais como 24-28 horas são aceitáveis, mas deve ser mantido o mesmo para todas as condições experimentais e repete. </li></ol> 4. Respostas comportamentais aos atrativos e repelente de Fragrâncias <ol><li> Ligue o controlador de temperatura e configurá-lo para 25 ° C. </li><li> Ligar as câmaras olfactivos (Fragrância de controlo e de teste) por inserção do tubo para a saída da câmara de odorante e ao premir-para-ligar montagem na caixa do comportamento. </li><li> Verifique a taxa de fluxo em cada quadrante usando o medidor de fluxo de ar para se certificar de que a corrente de ar e controle de odores é igual a 100 ml / min. </li><li> Limpar a arena PTFE mosca e as placas de vidro com etanol 70% 2-3 vezes e permitir-lhes totalmente ar seco (~ 3-4 min). </li><li> Cole as placas de vidro para com grampos na arena. </li><li> Transferência voa sem CO 2 em anestesia através do orifício de uma das placas de vidro na arena. à réer a transferência, colocar uma malha circular no furo para impedir que as moscas de escapar. Nota: CO 2 anestesia foi mostrada para afectar o comportamento de Drosophila 25 e não deve ser usada dentro de 24 horas de uma experiência de comportamento. </li><li> Coloque com moscas dentro da câmara à prova de luz da arena, conecte as correntes de ar quatro de controle, ligando o tubo ligado ao push-to acessório de conexão na caixa de comportamento para os cantos de arena, feche a porta da câmara e espere 10- 15 min para permitir que as moscas se aclimatar ao novo ambiente. Se possível, desligue as luzes na sala onde os experimentos são realizados, para evitar possível vazamento mínima luz que pode influenciar o resultado experimental. </li><li> Executar um experimento de controle 5-10 min, em que as moscas são expostos a correntes de ar 4 controle. </li><li> Analisar os dados imediatamente (ver secção A análise dos dados abaixo) para se certificar de que as moscas são distribuídos uniformemente na arena, e Índice da atração está pertoa 0. Este passo é essencial, uma vez que verifica se não existem fontes não controladas de preferências e aversões dentro da arena (por exemplo, luz vazamento do exterior, distribuição de temperatura desigual, arena irregular, contaminação odor, etc.). Se as moscas são distribuídos de forma desigual ou a sua actividade locomotora é baixo, descartar as moscas, limpar a arena de novo (passo 4.4) e utilizar um novo lote de moscas para repetir a experiência. </li><li> Ligue a câmara de teste odorante à configuração ligando as 3-way válvulas ou re-conectar os tubos conectores. </li><li> Execute experimento de teste para 5-10 min e analisar os dados como discutido na seção 5 abaixo (veja também a referência 14 e Figura 3). Gravações mais longos do que 20 minutos pode resultar em arquivos de dados que podem ser difíceis de processo computacionalmente. Se gravações mais experimentais são desejados, parar rapidamente e re-iniciar o programa de rastreamento. Isso resulta em um ~ 10 seg lacuna entre as gravações experimentais. </li><li> discarmoscas d. </li><li> Limpos arena e vidro placas com 70% de etanol (passo 4.4), e substituir os tubos conectores dentro do compartimento à prova de luz. Para agilizar experimentos, uma nova arena limpo pode ser usado, ea arena sujo limpo durante a realização de ensaios experimentais. </li><li> Executar outra experiência com um novo lote de moscas, se necessário. Se vários experimentos são executados no mesmo dia, tomar extremo cuidado para garantir que nenhum odorante é deixado no sistema a partir de um teste anterior. Isto não é normalmente um problema com baixas concentrações de odorantes ou com CO 2, mas pode ser necessário para estímulos altamente concentradas até um intervalo de 24 horas entre as execuções experimentais. Além disso, todos os tubos depois de os tubos de escoamento pode ser substituído se a contaminação odorante é suspeito durante as experiências de controlo. Sempre deixar o ar seco em entre as experiências para lavar continuamente o sistema </li></ol> Análise 5. Os dados Nota: A mosca sugeriu softwar aquisição de rastreamentoe (detalhado em Materiais), as faixas moscas em tempo real durante a aquisição, e salva o carimbo de tempo e coordenadas de todas as moscas detectados em formato * .dat. Nós desenvolvemos uma Matlab rotina feitos por medida para converter os dados para um formato Matlab, e para analisar os dados. exemplos de código são fornecidos em Materiais suplementares, mas os detalhes da implementação dependerá do software utilizado para a aquisição de dados. <ol><li> Carregar os dados brutos. Criar uma máscara espacial que segue os contornos da arena e aplicar a máscara para os dados em bruto para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena uma vez que representam ruído (Figura 4A, Recurso Código MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m). </li><li> Remove todos os pontos de dados que se movem a uma velocidade inferior a 0,163 cm / s durante mais de 3s, como estes dados é provável que seja o ruído gerado por moscas ou não em movimento (Figura 4B, Recurso Código TemporalFiltering.m). </li><li> Visualize dados restantespontos de plotagem-los todos de uma vez ou como trajetórias individuais (Figura 3, Código Complementar SingleTrajectoryViewer.m). Nota: A localização das fronteiras odor nos quatro campos provavelmente depende de um número de fatores, como as características de cada odorante e as taxas de fluxo de ar que está sendo usado. Por exemplo, odorants altamente voláteis provavelmente vai encher o quadrante odor mais completa do que odorants menos voláteis. Assim, é provável que cada odorante podem apresentar ligeiramente diferentes limites de odor. A utilização de um detector de fotoionização para medir limites de odores pode ser problemático, uma vez que utiliza uma amostra de ar de vácuo a partir de um determinado ponto, e assim interrompe a concentração odorante naquele ponto. No entanto, os limites de odores pode ser rapidamente calculada com base em dados do comportamento da mosca. Por exemplo, um limite de odor à base de pistas mosca acumulados em resposta a diferentes odores pode ser claramente observado nas Figuras 3C e 3D. </li><li> Calcular um índice atracção para determinar se experiências de controlo gerar nenhuma resposta preferência, e também para aceder a resposta a um odorante (ou optogenetic 9) estímulo. Para calcular uma atração Index (AI), use o último 5 min de um controle ou gravação de teste. Para se obter uma medida de atracção que se situa entre 1 (atracção absoluta) e -1 (repulsão absoluta), a seguinte fórmula é utilizada para calcular o AI: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> onde o teste N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, controlo N é o número médio de pontos de dados nas três quadrantes de controlo. Esta medida é intuitivo como nenhuma preferência seria indicado por valores próximos de zero. No entanto, ele não indica correctamente a proporção do número total de moscas que se encontram no quadrante odorante. Para obter esta medida, um Índice Percentagem (IP) podem ser utilizados: <img alt="equação 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; onde o teste N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, e N total é o número total de pontos de dados em todos os quatro quadrantes. Esta fórmula prevê uma medida que cai entre 0 e 1, com 0,25 correspondente a nenhuma preferência comportamental (Figura 3E e 4C, Recurso Código AttractionIndex.m). </li><li> Executar 5-10 repetições de cada condição experimental, usando um novo grupo de moscas para cada repetição. Comparar os índices de atração entre as condições ou contra controlos utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov não paramétrico (Figura 3F, função kstest2 em Matlab). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

O olfactómetro de quatro campos descrito aqui é um sistema comportamental versátil para estudar as respostas olfativas de populações grandes de tipo selvagem e mutante de Drosophila moscas. Cada experiência leva ~ 1 hr (incluindo instalação, ensaios experimentais, e limpeza) e 4-6 experimentos podem ser realizados rotineiramente a cada dia. Um ensaio típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos gera aproximadamente 450.000 rastreados pontos de dados para análise. A configuração descrita, também podem ser utilizados, com pequenas modificações, para controlar os movimentos de outros insectos e larvas de insectos, em resposta a olfativa ou outros estímulos sensoriais ao longo de um período de tempo, variando de minutos a dias. O ensaio de quatro quadrantes é sensível aos efeitos de ambos os estímulos atractivas e repulsivas. A maioria dos odores gerar índices Atração (AI) entre -0,9 e +0,9 (Equação 1). Um AI na gama de 0,5-1 significa comportamento forte atração das moscas aos estímulos, enquanto que AI na gama de -0,5 a -1 édesencadeada por repelentes fortes. De um modo geral, uma resposta neutra por controlar odores (ar seco, ar humidif içado, óleo mineral) deve situar-se entre 0,1 e -0,1. A AI muitas vezes muda durante todo o curso do experimento de teste, refletindo o tempo voa precisa para caminhar para as plumas olfativos, atração inicial e aumento da atividade locomotora em direção a um novo estímulo, ea eventual dessensibilização em resposta ao estímulo. controle pré-teste é executado são essenciais, e deve ser realizada com cuidado para garantir que as moscas foram distribuídos uniformemente na arena na ausência do estímulo desejado. As causas mais comuns de polarização espacial de moscas na arena são: fluxos irregulares de ar, possivelmente devido a tubulação desconectada ou placas de vidro inadequadamente apertados da arena em forma de estrela (em nossa experiência, as moscas são capazes de detectar diferenças de fluxo de ar de tão pouco quanto 15 ml / min); distribuição de temperatura desigual no interior da arena, que pode ser melhorada ajustando aar condicionado unidade para gerar fluxo de ar mais fraco e mais difusa e / ou longo período de pré-aquisição (~ 20 min) para garantir até mesmo a temperatura da arena; a fuga de luz mínima através da abertura sonda de temperatura, que pode ser reduzido por meio de selagem da abertura com uma fita preta; odor residual na arena ou no sistema de fornecimento de ar, caso em que a configuração (Arena, tubos de caudal, acessórios do invólucro à prova de luz, etc.) devem ser cuidadosamente limpas e deixou-se secar durante vários dias ou substituído sempre que possível. Manutenção do equipamento olfativo é importante para resultados confiáveis ​​e consistentes. Push-to-conectar acessórios na caixa do comportamento e as entradas de ar e as paredes interiores da arena deve ser limpo com etanol depois de cada experiência, se forem utilizadas odores fortes, e deixou-se secar completamente. As placas de vidro devem ser lavados três vezes com etanol a 70%, o que é geralmente suficiente para remover o odor residual e sujidade das placas, mas hexano é útilna remoção de composto orgânico depositado por moscas (por exemplo, feromonas que consiste em hidrocarbonetos de cadeia longa). Soap geralmente não é recomendado porque geralmente contém componentes aromáticos, o que poderia afetar comportamentos olfativos. A caixa de comportamento deve permanecer ligada às entradas de ar seco entre experiências (por exemplo durante a noite) para facilitar a remoção dos odores residuais do sistema. Se a atividade locomotora das moscas é baixa, eles podem gerar muito poucos pontos de dados, que muitas vezes resulta em um barulhento e variável Índice de atração. Mais longos tempos de fome e de gravação pode ajudar a resolver este problema. Em contraste, se as moscas estão doentes, 24-28 horas de jejum, em geral, ser suficiente para aumentar a actividade de locomoção como desde que seja consistente em todo experimentos. Há um bom equilíbrio entre a manutenção de um estado saudável das moscas e aumentando a locomoção. 40 h inanição pode ser utilizado como um ponto de partida, e depois modificado comonecessário com base nos resultados experimentais. Índices atração será um pouco afetada pela duração da fome, portanto, é essencial para morrer de fome todos os animais experimentais para o mesmo período de tempo, a fim de evitar os efeitos de confusão de tempo de inanição. tempos de fome mais longos fazem geralmente respostas repulsivas mais fraca (mais próximo a 0), e as respostas atraentes mais forte. as correntes de ar de controlo de ar seco tendem a desidratar as moscas, e não deve ser utilizada por mais de 40 min. O olfactómetro de quatro quadrantes pode ser usado para estudar as respostas de moscas individuais 16,18 ou múltiplas a um único estímulo ou para estudar preferência escolha entre estímulos. Por exemplo, odores diferentes poderia ser utilizado em cada um dos quatro quadrantes-. Isto também pode ser utilizado para determinar as respostas aos odor misturas examinando os limites do odor-quadrantes. Deve notar-se que, embora o sistema de rastreio permite faixas individuais para ser isolado a partir dos dados recolhidos, que épossível que as moscas individuais podem ter um comportamento diferente quando ensaiado como parte de um grupo que quando são testados isoladamente. Por exemplo, grupos de moscas apresentam maior repulsa guiada por odor devido às interações físicas entre moscas 26. O sistema de seguimento e a disposição também pode ser adaptado para utilização em ensaios não-olfactivos. O quadro ensaio pode facilmente acomodar uma matriz de LEDs 9 para a estimulação optogenética, ou uma placa térmica 27 para thermogenetics. O sistema também pode ser adaptado para estudar escolhas comportamentais de uma escala de tempo de muitas horas, por exemplo, para estudar o comportamento de postura 14. Neste caso, a taxa de quadros aquisição precisa de ser ajustada para evitar a produção de grandes quantidades de dados, e uma fonte de humidade e o substrato (gel de agarose a 1%) a necessidade de ser fornecido como substrato de postura de ovos. Uma limitação desta configuração é que as moscas são rastreadas como IR-refletindo objetos dentro e abaixo do Arena-se qualquer elemento de uma optogenetic ouexperimento termogênico reflecte IR, os pontos de dados irrelevantes terá de ser removido durante o pós-processamento. Actualmente, também não é possível filmar moscas com uma resolução espacial que permite que diferentes moscas para ser continuamente distinguíveis, mas isso pode ser melhorado no futuro, usando câmeras de vídeo mais avançados. Outra limitação do sistema atual é que o movimento de moscas é limitado a duas dimensões para promover comportamentos de passeio, e impedirá respostas aéreas induzida olfativos-. Deve notar-se que os ensaios automatizados adicionais também foram desenvolvidos para investigar os comportamentos de olfactivos individuais ou grupos de moscas. O design mais parecido com o ensaio aqui descrito é um método desenvolvido por Beshel e Zhong 28. Neste ensaio, as respostas de ~ 30 moscas são monitorizados em uma pequena área circular (cerca de um quarto da área da arena de quatro campos) em que odores são entregues a partir de um de quatro portas de odor ao longo da wa ArenaLL, e removido através de um buraco no centro da área circular. Além de uma arena menor, outras diferenças de design incluem comportamentos sendo realizados sob condições de luz e odores principalmente concentrando-se perto das portas de odor (em vez de todo o quadrante odorante, conforme indicado pelas paredes enrugadas da arena de quatro campos). No entanto, a área circular é um método adequado para o rastreio de respostas olfactivos de moscas, e pode ser adaptado para o desenho de acompanhamento mosca descrito aqui. Uma abordagem alternativa é a de controlar, simultaneamente, a actividade de muitas moscas individuais em resposta aos odores. No ensaio Flywalk, moscas individuais são colocados em pequenos tubos, e as suas respostas rastreados quando odorantes são perfundidos através do tubo 29,30. Mudanças na frente ou para trás, ou mudanças nas velocidades, pode ser utilizado para avaliar se um odorante é geralmente atraente ou repulsivo. Este ensaio, como o ensaio de quatro campos, rastreia automaticamente mosca movements, e assim pode ser usado para medir rapidamente respostas olfativas para uma grande variedade de odores. No entanto, ao contrário do four-campo, dinâmica motoras complexas, como a trajetória voltando ângulos e interações sociais potenciais, talvez perdeu na gravação ensaio Flywalk. Rastreamento automático de moscas andando individuais também foi adaptado para um tipo de teste T-maze 31,32. Neste ensaio, as moscas são colocadas em pequenas câmaras nas quais os odores são perfundidos a partir de cada extremidade da câmara, e sair através de uma porta no meio da câmara. As posições das moscas também são monitorados automaticamente. Isso imita, em uma escala única mosca, um quadro T-labirinto. Em combinação com Optogenetics, este ensaio tem sido particularmente bem adequada para o ensaio de circuitos neuronais medeiam aprendizagem olfactiva e de memória, e também pode ser usado para medir as preferências olfactivos de moscas individuais. Semelhante a Flywalk, ele não pode controlar a dinâmica da atividade complexa que podem ocorrer em áreas espaciais maiores, Tais como os que ocorrem durante a 14 de procura de alimentos, ou comportamentos que ocorrem somente em populações de moscas.

A capacidade de adaptação e respondem ao ambiente externo é crítica para a sobrevivência de todos os animais. Um animal precisa para evitar perigos, procurar comida e encontrar companheiros, e aprender com experiências anteriores. sistemas sensoriais funcionar para receber uma variedade de estímulos visuais, tais como, química e mecanosensorial, e envia esses sinais para o sistema nervoso central a ser interpretada e descodificado. O cérebro, em seguida, direciona comportamentos motores apropriadas com base no ambiente percebido, como a busca de alimento ou escapar de um predador. Entender como sistemas sensoriais detectar o mundo externo, e como o cérebro decodifica e dirige decisões, é um grande desafio em neurobiologia. Drosophila melanogaster é um sistema poderoso modelo para investigar como neural comportamentos circuitos de guia. Além de ser simples e barata de manter, Drosophila apresentam muitos comportamentos diversos e complexos estereotipada, mas fazê-lo com uma compact sistema nervoso de cerca de 100.000 neurônios. Existem técnicas genéticas poderosas para manipular o genoma de Drosophila, e milhares de linhas transgénicas foram geradas que seletivamente e reprodutível rotular os mesmos subconjuntos de neurônios 10-13. Estas linhas transgénicas podem ser usadas para manipular selectivamente a actividade dos neurónios marcados (activar ou inibir), e estas manipulações podem ser utilizados para investigar como neural comportamentos funções de guia. Vários ensaios comportamentais têm sido desenvolvidos para estudar vários comportamentos de Drosophila. Drosophila, como muitos animais, use seu sentido de cheiro para guiar muitas escolhas comportamentais, tais como encontrar comida, encontrar companheiros e evitar perigos. Olfato é, portanto, um bom sistema sensorial para investigar como os estímulos externos são detectados e interpretados pelo sistema nervoso de um animal para orientar as escolhas apropriadas. Como tal, uma série de ensaios foram desenvolvidos para Investigating larval e comportamentos olfativos adultos. Tradicionalmente, os comportamentos olfactivos em Drosophila foram ensaiadas por um paradigma de labirinto em T de dois escolha, que pode ser utilizado para ensaiar inata e comportamentos aprendidos olfactivos 3. Neste ensaio, cerca de 50 moscas são dado uma escolha entre dois tubos: um tubo contém o odor em questão e o outro contém um odorante de controlo (normalmente o solvente odor). As moscas são dadas um determinado período de tempo para fazer uma escolha, e, em seguida, o número de moscas que estão nas diferentes câmaras são contados. Embora o labirinto em T é um ensaio simples para muitas experiências, há várias limitações. Por exemplo, comportamentos olfativos são medidos em apenas um ponto no tempo, e diferentes escolhas feitas antes deste ponto de tempo são descartados. Da mesma forma, os comportamentos individuais das moscas dentro da população são negligenciadas. Além disso, o labirinto em T requer a contagem manual das moscas, que pode introduzir erros. Finalmente, uma vez que existem apenas duas opções de medição, estereduz o poder estatístico muitas vezes necessária para detectar mudanças comportamentais sutis. Uma alternativa para um dois-escolha T-maze é um de quatro quadrantes (quatro campos) olfatômetro 14-18. Neste ensaio, os animais explorar uma arena em que cada um dos quatro cantos da arena é preenchido com uma fonte potencial de ar odorizado. A arena tem uma forma de estrela enrugada para maximizar a formação de quatro quadrantes de odor experimentalmente definidos. Se o odor é fornecido em um dos cantos em seguida, é contida apenas em que um quadrante. Os comportamentos dos animais pode ser rastreado como eles entram e saem do quadrante odor, e facilmente em comparação com o seu comportamento nos três quadrantes de controle. Assim, o ensaio olfatômetro de quatro quadrantes registros de resposta comportamental espacial e temporal aos estímulos odor mais de uma grande arena experimental. O olfatômetro de quatro quadrantes foi desenvolvido pela primeira vez por Pettersson et al. 15 e Vet et al. 17 para investigar o olrespostas comportamentais fábrica de Hymenoptera parasítica indivíduo. Faucher et al. 18 e Semmelhack e Wang 16 adaptada a configuração para monitorar as respostas olfativas de Drosophila individual. O olfactómetro de quatro quadrantes é igualmente sensível às respostas atractivas e repulsivas, permitindo uma vasta gama de condições de ensaio e odorantes. Software de rastreamento fly escrita por encomenda, desenvolvido por Alex Katsov 19 e atualmente mantido por Julian Brown (detalhado em Materiais), apresentou vantagens adicionais para implementações mais recentes do olfatômetro de quatro quadrantes 14,20-23. É agora possível testar até 100 moscas simultaneamente em alta resolução espacial (27,5 pixels / cm) e temporais (30 quadros por segundo) de resolução, que permite extrair vários parâmetros, tais como posição, velocidade e aceleração de moscas em qualquer ponto do tempo. Isso permite que as investigações sobre a dinâmica das respostas comportamentais das moscas aos odores 20 </s-se&gt;. Deve notar-se, no entanto, que a identidade de moscas individuais dentro da população durante todo o período de seguimento não é mantido. Em vez disso, cada faixa mosca é registrado por até duas faixas mosca não se cruzam. Em que ponto, novas faixas são atribuídos após as moscas divergem. Ao incorporar outro software de captura de vídeo (detalhado na Tabela de Materiais), a mesma configuração permite períodos de monitoramento flexível e pode ser usado para controlar moscas por até 24 horas, tomando imagens a uma taxa de quadros mais baixa. Esta opção foi utilizada para estudar os comportamentos que põem ovos de moscas e comparar suas posições corporais com as preferências oviposição 14. O olfactómetro de quatro campos podem também ser utilizados para estudar as respostas para multimodal (por exemplo, olfativas e visuais) estímulos, ou para combinar optogenetic 9 ou 21 termogênico estimulação com apresentações de estímulos sensoriais. Além disso, a resolução temporal alta permite que a extracção de trajectórias for cada mosca individual no conjunto de dados ensemble. Portanto, o método permite investigação sobre comportamentos da população olfativos-guiada e também interações sociais individuais. Os dados gerados por este ensaio são robustos e altamente reprodutível, que permite a utilização do olfactómetro de quatro campos para telas comportamentais. Descrevemos aqui o conjunto de instalação para um olfatômetro de quatro quadrantes. Demonstramos ainda mais a sua utilização no ensaio de atração olfativa em resposta ao vinagre de maçã e repulsão em resposta ao propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, descreve-se e proporcionar o Exemplo de código para a análise dos dados de controlo de mosca gravados.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Air delivery system&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Tubing and connectors&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermoplastic NPT(F) Manifolds</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Hex reducing&amp;nbsp; nipple (1/4MNPT-&gt;1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubing (ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5108K43</td><td>50 Ft</td></tr><tr><td>Tubing (ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>52355K41</td><td>100 Ft</td></tr><tr><td>Barbed tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5117K71</td><td>1 pack</td></tr><tr><td>Push-to-connect tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&gt;1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K439</td><td>1 pack (10)</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&gt;1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K438</td><td>2 pack (10)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&gt;1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K4</td><td>2 pack (10)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&gt;1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>&amp;nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>Hex head plug</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Air pressure regulator, air filter and flowmeters&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Labatory gas drying unit</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA</td><td>Model: L68-NP-303; stock #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames for 150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames for 150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>Valve Cartridge</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Precision Air regulator</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Soleniod valves</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Solenoid valve controller</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Electronic flow meter</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Odor chambers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)</td></tr><tr><td>Glass odor chamber, 0.25 oz</td><td>Sunburst Bottle</td><td>LB4B</td><td>At least 5 are required per experiment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&quot;In&quot; valve for odor chamber</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td></tr><tr><td>&quot;Out&quot; valve for odor chamber</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td></tr><tr><td>O ring</td><td>RT Dygert International, MN, USA</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 pack (100)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Fly arena, camera and behavior boxes&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Behavior and camera box material</td><td>Interstate plastics, CA, USA</td><td>ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 sq inch</td></tr><tr><td>Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8&quot; thick, 12&quot; x 12&quot;</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8545K27&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Glass plates, 1/8&quot; Thick, 9&quot; x 9&quot;</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8476K191&amp;nbsp;</td><td>2</td></tr><tr><td>Dual action thermoelectric controller</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>IR LED array</td><td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 LED arrays and one power supply</td></tr><tr><td>Air conditioner Unit</td><td>Melcor Store</td><td>&amp;nbsp;MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Imaging system&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>PEC21211 KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Interconnect Cable</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 Camera Adapter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SODC700</td><td>1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 IR filter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>IR Videocamera</td><td>Industrial Vision Source, FL, USA</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>USB video converter</td><td>The Imagingsource, NC, USA</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (fly tracking software)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 software</td><td>The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dremel rotary tool</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Diamond-coated drill bits for glass cutting</td><td>Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

olfactory behaviors assayed by computer tracking of drosophila in a four-quadrant olfactometer

Um dos principais desafios em neurobiologia é entender como os circuitos neurais funcionam para orientar comportamentos adequados com animais. Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para tais investigações devido aos seus comportamentos complexos, técnicas genéticas poderosas e sistema nervoso compacto. Ensaios comportamentais laboratoriais têm sido muito utilizados com Drosophila para simular propriedades do ambiente natural e estudar os mecanismos neurais subjacentes aos comportamentos correspondentes (por exemplo fototaxia, quimiotaxia, a aprendizagem sensorial e memória) 1-3. Com a recente disponibilidade de grandes coleções de linhas de Drosophila transgênicas que rotulam subconjuntos neurais específicos, ensaios comportamentais têm assumido um papel de destaque para conectar neurônios com comportamentos 4-11. paradigmas versáteis e reprodutíveis, em conjunto com as rotinas computacionais subjacentes para análise de dados, são indispensáveis ​​para testes rápidos de linhas de voar candidatos com vários genotypes. Particularmente úteis são as configurações que são flexíveis no número de animais testados, a duração das experiências e a natureza dos estímulos apresentados. O ensaio de escolha também deve gerar dados reprodutível, que é fácil de obter e analisar. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um sistema e protocolo para ensaiar respostas comportamentais de Drosophila voa em uma grande arena de quatro campos. A configuração é usado aqui para ensaiar respostas de moscas para um único estímulo olfativo; No entanto, o mesmo arranjo pode ser modificado para testar múltiplos olfactivo, estímulos visuais ou optogenetic, ou uma combinação destes. A configuração olfatômetro registra a atividade de populações de moscas que respondem aos odores e métodos analíticos computacionais são aplicadas para quantificar os comportamentos da mosca. Os dados coletados são analisados ​​para obter uma rápida leitura fora de uma corrida experimental, que é essencial para a coleta de dados eficiente e a otimização das condições experimentais.

Os olfatômetro registros e ensaio quatro quadrantes analisa as atividades de passeio de muitas moscas sobre um grande espaço comportamental. Odorantes pode ser introduzido nas correntes de ar que entra com uma, duas, três, ou todos os quatro quadrantes. Na ausência de odores, as moscas irá mover-se livremente entre todos os quatro quadrantes. Este comportamento é crucial para observar uma vez que indica que polarizações un-intencional não têm sido introduzidos no ensaio. Estes desvios podem incluir luz, flutuações de temperatura, diferenças no fluxo de ar, ou contaminantes do odor. A Figura 3B mostra as respostas comportamentais no olfactómetro de quatro quadrantes de 25 homens e 25 mulheres voa secar ao ar. Uma mosca single-track a partir dos dados coletados também é destacada na Figura 3B, e demonstra que esta mosca estava explorando a arena inteira comportamental. A pontuação do índice atração (AI) para todas as faixas analisadas durante o período de teste de 5 min está próximo de 0, indicating falta de atracção para o quadrante odor. De modo semelhante, o índice percentual de (PI) da experiência é 0,24, indicando que as moscas foram distribuídas bastante uniforme em todos os quatro quadrantes, durante o período de teste de 5 min. A resposta comportamental de quatro campos de um odorante atraente é mostrado na Figura 3C. O vinagre de maçã é introduzido na corrente de ar de &#160; odor quadrante corrente de ar superior esquerda, colocando uma diluição de 6,25% de vinagre de maçã para a câmara de teste de odor. As faixas de ar retida mostrados a cinzento demonstram que a maioria das moscas recolher neste quadrante odor, e já não explorar todos os quatro quadrantes. Uma única pista mosca colorido mostra que uma vez que uma mosca entra no vinagre de maçã odor quadrantes, ele tende a permanecer no quadrante odor atraente. A AI de 0,94 para o experimento está perto de 1 indicando uma forte atração a este odorante. O PI de 0,92 indica que 92% das moscas de remained no quadrante odor durante o período analisado. A resposta comportamental de quatro campos a um odorante repelente é mostrado na Figura 3D. Uma diluição a 10% do propionato de acetato de odorante e colocada numa câmara de odor foi usado como a fonte de odor para o fluxo de ar superior esquerdo. As faixas mosca reunidos para o experimento analisados ​​demonstram a evasão do quadrante odor, sugestiva de repulsão guiada por odor. A única faixa mosca colorida mostra que uma mosca, quando entrou no quadrante odor, rapidamente virou-se para evitar o quadrante odor. A AI de -0.68 é menor que 0, o que indica repulsa, e está perto de -1, indicativo de uma resposta odorante repulsiva forte. O PI de 0,06 para a experiência sugere que apenas 6% (em comparação com ~ 25% nas experiências de odor neutro), com os pontos de dados da mosca rastreadas foram encontrados no quadrante de odor ao longo do curso do experimento. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot;&gt; Um índice de atracção é a métrica mais amplamente utilizado para a análise de dados olfactivos, uma vez que permite pontuações maiores do que 0, para indicar atração (positivo) e pontuação inferior a 0, para indicar repulsão (negativo). Quanto mais próximo o resultado é para +1 ou -1, mais forte a atração ou repulsão ao odor, respectivamente. Como descrito acima, esta métrica não pode indicar claramente a percentagem ou fracção de moscas rastreados para o quadrante de odor ao longo do curso do experimento. Nesse caso, um índice percentual pode ser mais informativo. Figura 3E diagramas a relação entre AI e dezenas PI, e como esses números referem-se a comportamentos atraem ou repelem. O ensaio de quatro campos resulta em comportamentos olfativos robustas e reproduzíveis. Isto permite comparações quantitativas entre o controlo e as condições experimentais tal como mostrado na Figura 3F, e também permite a identificação de olfactor subtilrespostas y que se desviam da neutralidade. Além disso, como os dados são obtidos em elevada resolução espacial e temporal, é possível estudar grande número de elementos de respostas comportamentais, tais como trajectórias de moscas individuais (como mostrado na Figura 3), bem como caracterizar diferentes dinâmica das moscas de actividade em um campo de odor (por exemplo, mudanças de direcção e velocidade 19,20). Muitas vezes pode ser difícil posicionar a arena de quatro campos na mesma localização exacta para cada experiência, especialmente uma vez que é necessária a limpeza frequente da arena. A análise forneceu os scripts compensar estas pequenas variações pela primeira ajustando os dados como se mostra na Figura 4A. Neste caso, a forma da arena de quatro campos é calculado, e os pontos de dados que se encontram no exterior desse espaço são removidos. Estes objetos rastreados muitas vezes representam debris ou reflexões que são erroneamente controladas. Como não se encontram dentro da arena e, assim, representam ruído, é importante que estes pontos de dados são removidos para evitar que analisa os dados errónea. Da mesma forma, é também importante remover pontos dados controlados que possam representar ruído ou moscas não se desloca no interior da arena. Para realizar isto, um roteiro de análise é utilizado (e fornecida aqui) que remove os pontos de dados que, essencialmente, não se movem (como mostrado na Figura 4B). Estes pontos de dados são geralmente em minoria, ainda a sua retenção iria conduzir a erros na análise. Índice de atração e pontuações preferência de índice pode ser calculada depois de um determinado período de tempo (por exemplo, no final de 5 minutos de experiência como demonstrado na Figura 3). Deve notar-se, no entanto, que uma vez que as moscas são rastreados com uma elevada resolução espacial e temporal, as análises semelhantes pode ser realizada ao longo da experiência. Isto émostrado na Figura 4C, em que pontuações do Índice da atração e índice percentual estão calculadas em contínuas caixas de 10 seg durante o período de tempo. Essa análise permite uma melhor apreciação das alterações olfativos que podem ocorrer durante todo o experimento, como a habituação a um odorante. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig1.jpg" /> Figura 1:. Esquemática do olfactómetro de quatro quadrantes (A) A configuração de comportamento é composto de um sistema de entrega de odor, o sistema de controlo da temperatura (não diagramado), sistema de aquisição de imagem (IR luzes e câmara CCD IR ligados a um computador LED), Arena de quatro quadrantes e de comportamento e de arena caixas à prova de luz. Os círculos vermelhos designar os componentes correspondentes mostrados na Figura 2. (B) pormenorizada da construção do sistema de libertação de odores. Os personagens verdes representam os tamanhos ligação / conversão de fittings. Os tubos de 1/16 ID e 1/8 OD são rotulados em amarelo enquanto os de 1/8 e 1/4 ID OD são rotulados na cor rosa. Abreviaturas: IR, infravermelhos; CF, Encaixe de Compressão; BF, Arame Fitting, MNPT, Homem National Pipe Thread. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig2.jpg" /> Figura 2:. Fotos do Setup Olfativo Assay (A) vista do Largo-campo da caixa de câmera e caixa de comportamento. (B) Vista dentro da caixa de comportamento. A sonda de temperatura, os tubos conectores, e matrizes de LED IR são rotulados. (C) Arena de quatro quadrantes. (D) vista do Largo-campo do sistema de entrega odor ligado à caixa de comportamento. A caixa de câmara foi removido para revelar a câmara CCD. (E </strong&gt;) Central de ar é passado primeiramente através de um regulador de pressão e em seguida através de um filtro de carbono. (M) Exemplo de os tubos de odor ligado ao colector. (G) tubos de fluxo de alta resolução regular o fluxo de ar. (H) A tubagem de odor e conectores jusante dos reguladores do tubo de caudal. (I) a válvulas solenóides regular se o ar limpo é passado através de uma câmara de odor ou expulsos para o quarto. Câmaras (J) o odor são conectados a válvulas de sentido único, e conter um recipiente de vidro interior para o odorante. (K) A caixa de comportamento contém acessórios de push-to-connect fora que se conectam ao tubo de entrega odor. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig3.jpg" /> <strong&gt; Figura 3: Exemplo de dados gerados utilizando um Ensaio Olfactory quatro campos (A) Representação esquemática da arena de quatro campos.. (B) respostas neutras são observados quando todos os quatro quadrantes perfusão conter apenas ar seco. Respostas (C) atração para uma diluição de 6,25% de vinagre de maçã perfusão do quadrante superior esquerdo. Comportamentos (D) repulsão desencadeada por propionato de etilo 10%. Na Figura 2B-2D, uma única trajectória a partir dos dados adquiridos é traçada. Um gradiente de cor é usada para significar o curso de tempo de gravação, com as cores azul e vermelho sendo o início eo fim das gravações, respectivamente. (E) Comparação do Índice de atração (AI) e do Índice Percentual (PI). (F) Média AI de 3- 6 experimentos com nenhum odor (controle), vinagre de maçã (ACV) e 10% de propionato de etilo (EP). As barras de erro indicam SEM. diferença estatística foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov test. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig4.jpg" /> Figura 4:. Exemplo dados gerados pelos dados de análise de Passos (A) filtragem espacial dos dados, realizados por MaskSpatialFiltering.m para remover pontos de dados que estão fora da arena. círculos vermelhos mostram posições iniciais dos círculos que são usados ​​para definir as fronteiras da arena. círculos pretos são as posições finais, adquiridas pela montagem do círculo descreve os dados (cinza área sombreada dentro do quatro-campo). Pontos vermelhos e setas pretas indicam pontos de dados que vão ser removidos do conjunto de dados depois deste passo de filtração. (B) a filtragem temporal dos dados, realizada por TemporalFiltering.m. Esta etapa de filtragem remove pontos de dados que se movem muito slowly ou não em todos, como eles são susceptíveis de ser gerados por moscas não se mover ou pela sujeira / reflexões a partir da arena. Um ponto vermelho rodeado por uma caixa vermelha tracejada indica posições de ~ 6.000 pontos de dados com coordenadas idênticas que serão removidos por esta etapa de filtragem. Index (C) Atração (AI) e Índice Percentual (PI), calculado em caixas de 10 seg durante a última 5 min de um experimento por AttractionIndex.m. Perfis temporais destes índices contêm informações sobre a dinâmica das respostas comportamentais e podem ser usadas para uma análise detalhada de comportamentos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

15.6K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Vídeo: Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they yield data relevant to the cognitive processing that occurs under ecologically valid conditions. These two goals often are at odds, since well controlled stimuli often are too repetitive to sustain subjects' motivation. Studies employing electroencephalography (EEG) are often especially sensitive to this dilemma between ecological validity and experimental control: attaining sufficient signal-to-noise in physiological averages demands large numbers of repeated trials within lengthy recording sessions, limiting the subject pool to individuals with the ability and patience to perform a set task over and over again. This constraint severely limits researchers' ability to investigate younger populations as well as clinical populations associated with heightened anxiety or attentional abnormalities. Even adult, non-clinical subjects may not be able to achieve their typical levels of performance or cognitive engagement: an unmotivated subject for whom an experimental task is little more than a chore is not the same, behaviourally, cognitively, or neurally, as a subject who is intrinsically motivated and engaged with the task. A growing body of literature demonstrates that embedding experiments within video games may provide a way between the horns of this dilemma between experimental control and ecological validity. The narrative of a game provides a more realistic context in which tasks occur, enhancing their ecological validity (Chaytor &amp; Schmitter-Edgecombe, 2003). Moreover, this context provides motivation to complete tasks. In our game, subjects perform various missions to collect resources, fend off pirates, intercept communications or facilitate diplomatic relations. In so doing, they also perform an array of cognitive tasks, including a Posner attention-shifting paradigm (Posner, 1980), a go/no-go test of motor inhibition, a psychophysical motion coherence threshold task, the Embedded Figures Test (Witkin, 1950, 1954) and a theory-of-mind (Wimmer &amp; Perner, 1983) task. The game software automatically registers game stimuli and subjects' actions and responses in a log file, and sends event codes to synchronise with physiological data recorders. Thus the game can be combined with physiological measures such as EEG or fMRI, and with moment-to-moment tracking of gaze. Gaze tracking can verify subjects' compliance with behavioural tasks (e.g. fixation) and overt attention to experimental stimuli, and also physiological arousal as reflected in pupil dilation (Bradley et al., 2008). At great enough sampling frequencies, gaze tracking may also help assess covert attention as reflected in microsaccades - eye movements that are too small to foveate a new object, but are as rapid in onset and have the same relationship between angular distance and peak velocity as do saccades that traverse greater distances. The distribution of directions of microsaccades correlates with the (otherwise) covert direction of attention (Hafed &amp; Clark, 2002).

Procedures for recording high-density EEG and gaze data during computer game-based cognitive tasks are described. Using a video game to present cognitive tasks enhances ecological validity without sacrificing experimental control.

Jogo computador baseado combinando experimentos comportamentais com alta densidade de rastreamento Gaze EEG e Infravermelho

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Neurociência

Assessment of Social Interaction Behaviors

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and stability of the networks and relationships that define societies. For animals, such as mice, recognition of conspecifics may be important for maintaining social hierarchy and for mate choice 1.
A variety of neuropsychiatric disorders are characterized by disruptions in social behavior and social recognition, including depression, autism spectrum disorders, bipolar disorders, obsessive-compulsive disorders, and schizophrenia. Studies of humans as well as animal models (e.g., Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus) have identified genes involved in the regulation of social behavior 2. To assess sociability in animal models, several behavioral tests have been developed (reviewed in 3). Integrative research using animal models and appropriate tests for social behavior may lead to the development of improved treatments for social psychopathologies.
The three-chamber paradigm test known as Crawley's sociability and preference for social novelty protocol has been successfully employed to study social affiliation and social memory in several inbred and mutant mouse lines (e.g. 4-7). The main principle of this test is based on the free choice by a subject mouse to spend time in any of three box's compartments during two experimental sessions, including indirect contact with one or two mice with which it is unfamiliar. To quantitate social tendencies of the experimental mouse, the main tasks are to measure a) the time spent with a novel conspecific and b) preference for a novel vs. a familiar conspecific. Thus, the experimental design of this test allows evaluation of two critical but distinguishable aspects of social behavior, such as social affiliation/motivation, as well as social memory and novelty. "Sociability" in this case is defined as propensity to spend time with another mouse, as compared to time spent alone in an identical but empty chamber 7. "Preference for social novelty" is defined as propensity to spend time with a previously unencountered mouse rather than with a familiar mouse 7. This test provides robust results, which then must be carefully analyzed, interpreted and supported/confirmed by alternative sociability tests. In addition to specific applications, Crawley's sociability test can be included as an important component of general behavioral screen of mutant mice.

Here we describe a detailed protocol for examination of sociability in mice by using Crawley's sociability and preference for social novelty test. We describe the advantages and possible applications for this procedure, including critical details important for correct interpretation of the results.

Avaliação de comportamentos de interação social

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, mechanoreception, hearing, and chemoperception through taste, via direct contact or through olfaction, which represents the response to a volatile molecule acting at longer range. Volatile chemical molecules are very important signals for most animals in the detection of danger, a source of food, or to communicate between individuals. Drosophila melanogaster is one of the most common biological models for scientists to explore the cellular and molecular basis of olfaction. In order to highlight olfactory abilities of this small insect, we describe a modified choice protocol based on the Y-maze test classically used with mice. Data obtained with Y-mazes give valuable information to better understand how animals deal with their perpetually changing environment. We introduce a step-by-step protocol to study the impact of odorants on fly exploratory response using this Y-maze assay.

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

We present a choice test to reveal the influence of odorants on Drosophila behavior using a Y-maze assay.

Prova<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfaction com um Ensaio Y-maze

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Four-Way Olfactometer Assay: A Method to Assess Odorant-Cued Responses in Drosophila

Source: Lin, C.C., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54346/" target="_blank">Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer</a>. J. Vis. Exp. (2016).
Fruit flies have a complex olfactory system, can discriminate hundreds of odorants, and use their sense of smell to direct behavioral decisions. This video describes the four-way olfactometer assay, a method to study olfactory behavioral responses in flies. The featured protocol clip shows how to handle test flies and what are critical steps while performing the assay.

Ensaio de olfatômetro de quatro vias: um método para avaliar as respostas de odorantes em Drosophila

Source: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (2016).
Fruit flies ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (mosca da fruta)

Adulto

Drosophila Y-maze Assay: A Method to Assess Olfactory Responses in Flies

Source: Simonnet, M. M., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/51241/" target="_blank">Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay</a>. J. Vis. Exp. (2014).
This video describes a method to test olfactory exploratory behavior in the fruit fly, called the Y-maze. The featured protocol clip demonstrates how to set up and conduct the assay.

drosófila Ensaio de labirinto em Y: um método para avaliar as respostas olfativas em moscas

Source: Simonnet, M. M., et al. Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay. J. Vis. Exp. (2014).
This video describes a method to test olfactory ...

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de

Resumo

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