This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

1. Preparação de Alvo RNA e Cas9 Constrói e Reparação Dador de Vector <ol><li> Clonagem de gRNAs <ol><li> Projetar uma sequência alvo guia-RNA alvo o gene N1L do vírus vaccinia seguindo o princípio afirmado anteriormente 25. Alinhar a sequência alvo de ARN-guia contra o genoma do vírus de vaccinia (neste caso, Lister estirpe de vírus da vacina) para descartar quaisquer sequências alvo gRNA fora do alvo. </li><li> Sintetizar e clonar os oligos gRNA em um vector de clonagem gRNA como previamente descrito 25. Confirmar a sequência de cada indivíduo gRNA no vector resultante por Sanger de sequenciação 33. Nomeie o gRNA construção resultante como gRNA N2 33. NOTA: O local alvo é gRNA dentro do gene N1L, e é na região entre o braço esquerdo e do braço direito que as tampas vector reparação doador (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Clonar o gene Cas9 falta o sinal de localização nuclear (NLS) navector pST1374 e designar a construção como pST-Cas9 33. Nota: Quaisquer clonagem de expressão vector de mamífero pode ser utilizado para a construção do vector de expressão Cas9. </li><li> Construção de vector de reparação dos doadores para HR <ol><li> Use o gene N1L de VV como região-alvo para a modificação 33. Assegure-se que os comprimentos dos braços esquerdo e direito são cerca de 500-600 pb cada, e que flanqueiam a região alvo. NOTA: O braço / braço direito esquerdo pode ter até 50 sobreposição bp com a região de destino (ver Figura 1). </li><li> Clonar o reparo região doadora vector N1L como descrito anteriormente 33, 34 e designar o vetor doador de reparação como pT-N1L. Nota: Consulte a Figura 1 para o vetor de reparação doador e sua região alvo. Outras regiões da VV pode ser alvejado usando região (gene) especï¿½ico gRNA (s) e vector de reparação dador específico de região. Qualquer vector de clonagem pode ser utilizado para a construção do vector dador de reparação. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Expansão de plasmídeo <ol><li> Transformar o plasmídeo em E. quimicamente competente coli de acordo com as instruções do fabricante. Purifica-se o plasmídeo utilizando um kit de extracção de plasmídeo referindo-se o protocolo fornecido pelo fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Células Sementeira (Dia 1) <ol><li> Manter a células CV-1 (fibroblastos de rim de macaco) em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina, a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> células trypsinize CV-1, que são 80-90% confluentes <ol><li> Remover o meio de cultura de células a partir do balão T-175, contendo células CV-1. Lavar a monocamada com 5 mL de PBS estéril para remover o soro residual e aspirar o PBS. Adicionar 2,5 mL de uma solução 1 × Tripsina-EDTA para cobrir as células e colocar o balão em 37 ° C incubadora durante aproximadamente 5 min para auxiliar a separação celular. </li><li> Adicionar10 ml de meio de cultura celular (ver passo 2.1) para suspender as células por acção da pipeta suave. Conte o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Semeando as células em placas de 6 poços <ol><li> Seed 2 x 10 5 células CV-1 em 2 mL de meio de cultura de células em cada poço de uma placa de 6 poços um dia antes da transfecção. NOTA: Um passo adicional de centrifugação para remover a tripsina não é necessária. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. A transfecção do plasmídeo e Cas9 gRNA plasmídeo (Dia 2) <ol><li> transfectar células CV-1 (preparado no passo 2.2.3.1) com 0,5 ug de plasmídeo pST-Cas9 e 0,5 ug de plasmídeo gRNA N2 usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Incubam-se as células durante 24 h numa incubadora (37 ° C com 5% de CO 2) e, em seguida substituir o meio com 2 mL de meio de cultura celular fresco (descrito no passo 2.1). </li></ol> 4. A infecção de células CV-1 e Shuttle Donor Vector transfecção para HR (dia 3) <ol><li> Dilui-se a espinha dorsal vírus VVL15 com meio de cultura celular DMEM a uma concentração de 2 x 10 5 pfu / mL. 24 h pós-transfecção dos plasmídeos Cas9 e gRNA, adiciona-se 100 ul de vírus diluído em cada poço de células CV-1 transfectadas. </li><li> 2 h pós-infecção do vírus, transfectar 1,0 ug de transporte Dador de Vector em células infectadas para VVL15-RH usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Colocar as células transfectadas de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 h. </li></ol> 5. recolher o vírus recombinante (Dia 4) <ol><li> Após 24 horas de transfecção com o vector de transporte dador para HR na etapa 4.2, separar as células CV-1 transfectadas, utilizando um raspador de células. Recolha a suspensão de células para um frasco de congelação e armazenar a -80 ° C para uso futuro. NOTA: Limpe qualquer derrame de meio de cultura celular com desinfectante imediatamente e, em seguida, limpe novamente com 70% Ethanol. </li></ol> 6. Purificação da VV Modificado (Primeira Rodada) <ol><li> No dia 1, as sementes 15 placas de 6 cavidades com 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço. <ol><li> No dia 2, descongelar a suspensão de células congeladas a partir do passo 5.1 em um banho de água a 37 ° C durante 3 minutos e agitar com vortex os criotubos vigorosamente durante 30 segundos para obter lisado celular sem remover os detritos celulares. </li></ol></li><li> Para a infecção de uma placa de 6 poços de células CV-1, diluir 1 mL de lisado de células com 3 mL de DMEM e adicionar 0,5 ml de ligado celular diluído em cada poço da placa de 6 cavidades, na parte superior dos meios de comunicação já presente. Infect todas as placas de 6 poços, preparado no passo 6.1. NOTA: A remoção de detritos de células não é necessário. </li><li> Após dois dias de infecção (isto é, no dia 4), identificar placas RFP-positiva sob um microscópio de fluorescência utilizando 10X lente objectiva e rotular as placas por baixo da placa utilizando uma caneta marcador circundando a localização da placa. NOTA: Ver <strong&gt; Figura 3 para a placa representante RFP-positivo. <ol><li> Prepare seis cryovials rotulados contendo meio de cultura de células 200 mL sem soro DMEM para pegar seis placas RFP-positivas diferentes. Aspirar o meio de cultura de células a partir da placa bem com rotulada (s) (passo 6.3). Anexar uma ponta de 200 mL de uma pipeta P200, definir o volume em 30 mL e tomar ~ meio de cultura de células 10 mL de uma cryovial. </li><li> Segure o botão pipeta sem liberar a médio e use a ponta a arranhar a área de uma placa rotulada. Solte o botão de pipeta para levantar as células destacadas e transferi-lo para o cryovial contendo 190 mL de DMEM isento de soro. </li><li> Tome um outro 10 ï¿½ de meio do frasco com as células riscados (da última etapa) e repita o procedimento de pegar a mesma placa RFP-positivas três vezes para recolher o máximo de células riscado quanto possível. Transferir todas as células no mesmo frasco e armazenar o frasco a -80 ° C. </ol></li></ol> 7. A purificação do VV Modificado (Segunda Rodada) <ol><li> Seed 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço de seis placas de 6 poços e cultura das células durante 24 h. </li><li> Descongelar as criotubos congeladas (a partir do passo 6.3.3) em 37 ° C banho de água durante 3 min, em seguida, os criotubos vortex vigorosamente durante 30 segundos para obter lisado celular. <ol><li> Adicionar 0,5 mL do lisado celular mista para um poço de uma placa de 6 poços. Infect uma placa de 6 poços para cada placa. Incubar as placas de 6 poços VV infectadas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 dias (Segunda purificação de placa redonda). Em seguida, repita a secção 6.3. NOTA: Mais de seis placas de RFP-positivos podem ser apanhados; duas ou mais placas de 6 poços pode ser usado para a purificação de cada placa. </li></ol></li></ol> 8. novas rodadas de Plaque Purificação <ol><li> Continue mais três a cinco ciclos de purificação de acordo com o mesmo protocolo descrito no passo 7 até que todas as placas formadas a partir de uma placa positiva pareceu ser RFP-positiva sob um microscópio. NOTA: Esta placa, em seguida, é considerado puro. </li><li> Uma vez que a placa é pura (Figura 4, todas as células infectadas que expressam RFP), colher uma placa positiva em um cryovial e armazenar a -80 ° C, tal como descrito na secção 6.3. Verifique a placa seguindo o protocolo descrito no passo 9 e 10. </li></ol> 9. Expanda a placa (s) Purificada <ol><li> Seed 3 x 10 5 células CV-1 em cada poço de uma placa de 6 poços um dia antes da infecção pelo vírus. </li><li> Descongelar o criotubo gelado de 8,2 num banho de água a 37 ° C durante 3 minutos para se obter lisado celular. Adicionar todo o lisado (sem necessidade de remover os detritos celulares) para um poço de uma placa de 6 poços de células CV-1 (semeadas no passo 9.1). Incubar as células CV-1 infectadas a 37 ° C com 5% De CO 2 durante 3 dias. <ol><li> Expandir todas as placas purificadas (pelo menos três placas). NOTA: O tempo de infecção varia de 1-3 dias, dependendo da quantidade de vírus no lisado. </li></ol></li><li> Colher as células VV infectadas utilizando um raspador de células, quando mais de 50% das células mostram efeito citopático observado sob um microscópio (as células são arredondados, facilmente separado e RFP positivo). Recolher as células destacadas em conjunto com o meio de cultura de células para um tubo de 15 mL. <ol><li> Agregar as células por centrifugação a 300 g durante 3 min. Remover o sobrenadante e manter a pelete de células a -80 ° C até à sua utilização ou usar o sedimento celular imediatamente para o passo 10. </li></ol></li></ol> 10. Verificação da Modificação do Mutant VV Usando PCR <ol><li> Extracto de ADN VV a partir do sedimento de células, preparado no passo 9.3.1, utilizando um kit de extracção de ADN seguindo o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN com 200 uL de água duplamente destilada. NOTA: Use da metade do volume do pelete para extrair o ADN e manter o resto para a produção virai se o clone é verificado como contendo a correcta modificação / inserção. </li><li> Verificação da deleção do gene de N1L e da inserção do gene para a região de RFP N1L. <ol><li> Amplificar um fragmento de DNA abrangendo o gene N1L (L025) e o gene L026 utilizando iniciadores concebidos contra o gene N1L. Amplificar o gene RFP utilizando iniciadores especï¿½icos RFP. Amplificar um fragmento de ADN de controlo que mede A52R por PCR utilizando iniciadores específicos de A52R. NOTA: Veja a lista de materiais para primers específicos. <ol><li> Realizar a PCR usando um kit mestre de mistura de PCR. Defina-se 25 ul de reacção de PCR, utilizando 2 mL de modelo de DNA, desnaturar a reacção de PCR a 94 ° C durante 2 min, e, em seguida, executar 30 ciclos de PCR seguintes etapas: desnaturar o ADN, a 94 ° C durante 15 s, em seguida, recozer os iniciadores para os moldes de ADN a 52 ° C durante 15 s prolongar a reacção de PCR a 72 ° C durante 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Resolver os produtos de PCR utilizando um gel de agarose a 1% 33. Capturar a imagem do gel usando um doc gel UV. Se o N1L de PCR for negativo e A52R e RFP PCRs são positivos, então a placa está correctamente modificado na região do N1L. </li></ol>

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Authors have no competing financial interests.

Há dois objetivos principais relativamente à modificação da VV para fins terapêuticos. Uma consiste em eliminar um gene particular, tal como o gene da timidina quinase (TK) para atenuar o vírus para o anti-tumoral uso terapêutico. A outra é o braço VV com um gene terapêutico desejado (por exemplo, GM-CSF) ou um gene marcador (por exemplo, gene da luciferase). Atingir qualquer um destes envolve a eliminação de uma região alvo / gene. Um método de ligação directa de ADN 35 e um método de empacotamento in vitro 36 Foram utilizados anteriormente para gerar vírus vaccinia mutantes com alterações do gene TK. No entanto, estes métodos têm aplicação limitada em relação a mutação de outras regiões do genoma, devido à falta de locais de enzimas de restrição exclusivos, em todo o genoma. A actual abordagem para a criação de VV mutante envolve a transfecção de um vector de transporte (dador) com um marcador de selecção (RFP ou GFP) em células CV-1 de duas horas após a infecção com VV para induzir uma incorpor recombinação homólogang do marcador de selecção para a região alvo. Colecção de placas de marcadores positivos é seguida por sua h pós-transfecção de purificação 24. O processo de purificação de placa pode levar até 10 rodadas, últimas 3-4 semanas e, muitas vezes leva a vírus recombinantes com marcadores de selecção indesejáveis ​​inseridas em regiões fora do alvo. ADN quebras de cadeia dupla pode efectivamente induzir a recombinação homóloga em células de mamíferos 37, e do aproveitamento deste mecanismo, a eficiência de geração de VV mutante pode ser bastante melhorada. O sistema Cas9 gRNA-guiada tem sido empregada com sucesso na edição do genoma e aumenta a eficiência de recombinação homóloga em organismos eucarióticos 22, 25. Recentemente, em células hospedeiras os genomas de adenovírus e tipo I vírus herpes simplex foram editadas pelo Cas9 gRNA-guiada sistema de 24. Foi demonstrado recentemente que o sistema CRISPR Cas9 é uma ferramenta poderosa para a edição de forma eficiente no genoma VV e construção de um vector para a expressão de um VVgene particular. Ambos N1L gRNA-guiada ao método tradicional recombinação homóloga (HR) Cas9 e resultou em eventos bem sucedidas de RH no mesmo local alvo de N1L. É interessante notar, no entanto gRNA-guiado Cas9 AR induzida em níveis muito mais elevados de eficiência do que o método tradicional de RH. Assim, a utilização de Cas9 gRNA-guiado elimina a necessidade de purificar o maior número de placas para obter mutantes VV. Neste trabalho, nós melhorou significativamente a eficiência e prazo para geração de VV mutante usando o sistema Cas9 gRNA-guiada 33. De nota, um passo crítico para a obtenção de uma elevada eficiência da recombinação homóloga é para transfectar células CV-1 com os plasmídeos que expressam Cas9 e o gRNA durante 24 h antes de realizar a recombinação homóloga convencional. O intervalo de 24 h permite Cas9 e gRNA a ser expressa em um nível razoável. Além disso, a sequência de direccionamento gRNA de um determinado gene pode ter de ser optimizada, uma vez que descobrimos que os diferentes sequências t gRNAgene argeting N1L variar na sua eficácia 33, 34. A limitação para a CRISPR / Cas9 na edição VV é a baixa taxa de placas RFP positivo na primeira rodada de recombinação. Para se obter um número suficiente de placas RFP-positivo contendo vírus recombinante, geralmente, pelo menos, dez placas de 6 poços são necessárias, o que torna primeira ronda de rastreio tedioso. Assim, ainda existe uma necessidade para optimizar o protocolo de ultrapassar esta limitação. O pequeno tamanho de placas RFP-positivo é um outro problema potencial, o que é devido a um elevado volume de lisado utilizado para infectar uma placa de 6 poços. Para superar isto, um menor volume de lisado deve ser utilizado para infectar uma placa de 6 poços para se obter placas de tamanho maior RFP-positiva. Usando um pequeno volume de lisado permitirá também para uma melhor separação das placas RFP-positivo de os RFP-negativo. Consequentemente menos rondas de purificação de placas são necessários para obter placas RFP-positivos puros. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-alvo efeitos são sempre um problema indesejado na edição gene. CRISPR-Cas9 tem mostrado efeitos fora do alvo. No entanto, com design cuidadoso de gRNA, longe do alvo efeitos podem ser evitados durante a edição do VV genomas 33, 34. Este é o benefício particular de usar o sistema Cas9 gRNA-guiada para editar o genoma de VV. Dadas as promessas de VV, usando o sistema CRISPR / Cas9 irá acelerar o desenvolvimento de VV mutantes para a investigação biomédica e em medicina translacional. Além disso, um sistema deste tipo também iria acelerar descobertas em biologia celular, tais como a dissecção das vias de sinalização utilizadas por VV para a sua motilidade à base de actina.

vírus vaccinia (VV) é um vírus DNA envelopado, pertencente à família poxvírus e tem desempenhado um papel crucial em uma das maiores conquistas da medicina da erradicação da varíola. Na era pós-erradicação da varíola, VV foi desenvolvido como um vetor para a entrega de genes para as vacinas contra o HIV e outras doenças infecciosas 1-7 através da inserção de genes de vários patógenos em vectores VV. VV também tem sido amplamente utilizado como um vector para a imunoterapia do cancro 8-14 especialmente para o desenvolvimento de vírus de vaccinia oncolítico replicar-alvo do tumor. A fim de criar um vector de vacina eficiente com uma selectividade melhorada para as células cancerígenas, são necessárias modificações dentro do genoma viral, incluindo deleções de genes ou introdução de genes terapêuticos. Com o desenvolvimento da tecnologia de ADN e uma melhor compreensão da biologia molecular e virologia, a inserção de ADN estranho em VV foi originalmente atingird usando recombinação homóloga (HR) em 1980 15. Este método ainda é amplamente utilizado para a construção de vectores VV. Introdução da modificação genética, é conseguido através de um vector de transporte para a AR, que se recombina com o genoma de VV em células pré-infectados. No entanto, este método tem provado ser altamente ineficiente (inferior a 1% de eficiência de recombinação homóloga 16) e muitas vezes resulta na inserção aleatória do marcador de selecção em regiões e / ou perda do marcador sobre a expansão do vírus não-alvo. A eficiência de ADN de recombinação homóloga para introduzir ADN exógeno em loci genómico pode ser dramaticamente aumentada na presença de quebras de cadeias duplas (DSB) 17. Portanto, a tecnologia que pode induzir LAP em loci alvo tem um grande potencial para a engenharia de genoma de VV. O sistema CRISPR-Cas9 recentemente desenvolvido mostra a promessa para o desencadeamento de LAP em qualquer região do gene VV. CRISPR-Cas9 é uma RNA-nuclease guiada envolvidos na imunidade adaptativa contra invasores fagos e outros materiais genéticos estranhos 18-20. Existem três sistemas CRISPR-cas em uma variedade de espécies microbianas 21. O sistema CRISPR-cas tipo II é amplamente utilizado para a edição do genoma de células eucarióticas e vírus de grandes dimensões. Consiste na Cas9 endonuclease guiada por ARN (de Streptococcus pyogenes), um ARN de guia (sgRNA) e o crRNA trans-activação (tracrRNA) 22-24. O complexo Cas9 / sgRNA reconhece a sequência genómica de 20 nucleótidos complementares anterior uma sequência 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer motivo adjacente (PAM) em células de mamífero 22, 23. Ela tem sido usada com sucesso para a geração eficaz de células, vírus geneticamente modificados e modelos animais 22-32. O sistema CRISPR-Cas9 tem provado ser uma ferramenta eficiente para a segmentação genoma em combinação com recombinação homóloga no citoplasma de VV infectadas células CV-1s para gerar vírus vaccinia mutantes 33, 34. A fim de alargar o potencial de aplicação deste método, apresentamos informações detalhadas sobre metodologia deste sistema. O protocolo descrito pode ser usado para criar um mutante de VV com uma deleção do gene particular e / ou armar o vírus mutante com um transgene terapêutico.

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA cloning vector</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 cloning vector</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cell culture serum</td></tr><tr><td>penicillin, streptomycin</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotics</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfection</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&amp;nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>collect virus</td></tr><tr><td>fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus BX51 Fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>find RFP-positive plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Z707759</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>scrap cells</td></tr><tr><td>1x Trypsin-EDTA solution</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>trypsinize cells</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectant</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5&amp;rsquo;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverse&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#039;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R forward 5&amp;rsquo;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverse 5&amp;rsquo;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP forward 5&amp;rsquo;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverse 5&amp;rsquo;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR product</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Para a construção de um novo vector VV, o ponto de partida chave é projetar e construir um vetor de transporte de doadores que podem alvejar uma região específica do genoma. Neste estudo, o gene de VV N1L foi usado como um exemplo de destino. A cassete do vector de transporte dador para a recombinação e a região alvo no VV são mostrados na Figura 1. A fim de aumentar a eficiência da recombinação homóloga, os plasmídeos que expressam Cas9 e um gRNA específicos de N1L foram co-transfectados na CV -1 células 48 h antes de se realizar a recombinação homóloga 33. Um dia (24 h) após a transfecção, RFP foi expresso em células CV-1 (Figura 2). Após a infecção de células CV-1 com todo o lisado proveniente da recombinação homóloga (passo 5), as placas negativas RFP-positivas e foram observados tanto em células CV-1 (Figura 3). Seguindo o protocolo de purificação descrito, uma placa de co puro<html> uld ser obtido depois de 3-5 ciclos de purificação. Como mostrado na Figura 4, todos os placas após a infecção com lisado de células derivadas a partir de uma placa pura com o vírus vaccinia mutantes apresentaram um sinal RFP. Para verificar se o mutante pura VV tinha a modificação genética correcta, PCR foi utilizado para confirmar a ausência do gene N1L alvo, como se mostra na Figura 5. Por PCR do vírus modificado mostrou um sinal positivo para RFP e um sinal de ausente para N1L ( Figura 5 pista AG), enquanto que os resultados de PCR de N1L para o vírus de controlo (CTR) com uma região intacta N1L é positivo. Os fragmentos de ADN de controlo de A52R foram positivos para todos os vírus recombinantes do vírus e Ctr. A eficiência de RH em placas RFP-positivo é de 100% (6/6) nesta experiência (foi até 94% no trabalho anterior 34). O método aqui descrito melhorou a eficiência de recombinação em mais de 100 vezes em comparação com os protocolos convencionais 33, 34. conteúdo &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Figura 1:. A cassete do vector de transporte dador para a recombinação homóloga, e a região alvo no genoma VV A purificação RFP gene marcador é dirigido pelo promotor de H5. O vector de reparação dos doadores destinados à região resultados N1L no gene RFP serem incorporadas a região N1L após recombinação homóloga. &#39;X&#39; indica a sequência homóloga no vector dador de reparação que irá substituir a mesma sequência no genoma do vírus vaccinia. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Figura 2:. Imagiologia das células CV-1 um dia após a recombinação homóloga Um dia afteR recombinação homóloga, as células infectadas com VV e transfectadas pelo vector dador de reparação são RFP-positiva A:. imagem de contraste de fase (original 100X). B: A microscopia de fluorescência imagem (original 100X). Barra de escala = 50 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Figura 3:. Uma placa RFP-positivo na primeira purificação rodada de vírus mutante Na purificação na primeira rodada do vírus mutante, a placa RFP-positivo (circulado com linha vermelha) com a eliminação região alvo está rodeado por placas formadas pela imagem de contraste de fase (original 100X) B:: Um vírus de tipo selvagem (circulado com linha amarela).. micr fluorescênciaimagem oscopy (original 100X). Barra de escala = 50 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Figura 4:. O mutante pura VV Após 3-5 ciclos de purificação, placas puras foram obtidos como todas as placas eram RFP-positiva A:. Imagem de contraste de fase (original 100X). B: A microscopia de fluorescência imagem (original 100X) . Barra de escala = 50 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Figura 5: VerificatioN pura do mutante VV. O DNA foi extraído a partir de células infectadas com VV CV-1. A deleção da região alvo N1L foi verificada por PCR, utilizando iniciadores N1L, a inserção de SDP na região N1L foi confirmada por PCR utilizando os iniciadores RFP. Lanes AF correspondem a seis placas purificadas, pista G é uma placa de controle com N1L exclusão verificado em trabalhos anteriores 33, pista Ctr (controle) é o vírus vaccinia tipo selvagem (com a região N1L intacta). A52R gene foi amplificado como o gene de controle para todas as amostras. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

vírus vaccinia (VV) tem sido amplamente utilizada na investigação biomédica e da melhoria da saúde humana. Este artigo descreve um método simples, altamente eficiente para editar o genoma VV utilizando um sistema CRISPR-Cas9.

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K visualizações.  Queen Mary University of London.  vírus vaccinia (VV) tem sido amplamente utilizada na investigação biomédica e da melhoria da saúde humana. Este artigo descreve um método simples, altamente eficiente para editar o genoma VV utilizando um sistema CRISPR-Cas9. 

Vídeo: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Imunologia e Infecção

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Pesquisa do câncer

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neurociência

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Geração de vetores recombinantes Herpesvirus aviária com CRISPR/Cas9 Gene edição

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...