Name: generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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Este trabalho foi supportedby Sociedade Americana de Câncer Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) eo Prêmio Biologia CIRM Básico (RB4-05779).

O protocolo de pele humana foi realizada em conformidade com as diretrizes da Universidade da Califórnia, o Comitê de Ética em Pesquisa do San Diego. A pele humana pode ser obtido a partir de amostras cirúrgicas descartados ou comprados a partir de bancos de pele (pele banco está listado na Tabela de Materiais / Equipamentos). A localização, onde a pele é derivado a partir de ou a idade do dador não é crítica para a experiência, enquanto as proteínas da membrana basal (zona de colagénio / laminina) na derme não são degradados. 1. Preparação de desvitalizados derme humana <ol><li> Ao receber a pele humana, colocar o tecido no capuz de cultura de tecidos de descongelar (~ 3-5 min). Dependendo do tamanho da pele, colocar o tecido descongelado num descartável tubo de 50 ml estéril ou frasco de 125 ml. O tamanho típico da pele a partir do banco de pele é de 0,75 pés quadrados. </li><li> Encha o depósito de 75% completo com penicilina e estreptomicina 4x (pen / strep) em 1x PBS. Agite vigorosamente durante5 min e descarte do líquido. Repita este passo mais 3 vezes. </li><li> Após a última lavagem, transferir o tecido para um novo tubo / frasco e adicionar 4x fresco Pen / Strep / PBS para encher 75% do recipiente. Incubar esta mistura numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante 2 semanas para permitir a separação da derme da epiderme. </li><li> Sob condições estéreis, utilizar uma pinça para descascar a epiderme da derme. A derme é completamente branco enquanto a epiderme terá coloração, dependendo da raça do doador (Figura 1A). Descarte a epiderme acordo com o protocolo da instituição para lidar com o tecido humano. </li><li> Coloque a derme em um tubo ou garrafa e lavá-lo em 4x pen / strep diluído em 1x PBS com agitação forte (5 mínimo de lavagens por 4 vezes). Após a última lavagem, transferir a derme para um novo tubo / frasco em 4x pen / strep diluído em 1x PBS e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso. Derme pode ser armazenado a 4 ° C durante até um ano. </li></ol&gt; 2. modificar geneticamente Primária queratinócitos humanos NOTA: Use pilhas phoenix anfotrï¿½icas cultivadas em meio DMEM completo [DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS) + pen / strep] para produzir o vírus para infectar queratinócitos humanos primários. Genes de empacotamento virais que codificam proteínas tais como gag-pol e do envelope são integrados de forma estável no genoma da célula Phoenix que permite a produção de vírus quando transfectada com um vector retroviral. Phoenix células podem ser transfectadas com alta eficiência, permitindo a produção em alta título viral. Vírus produzido a partir desta linha de embalagem também pode infectar uma grande variedade de células de mamíferos incluindo o ser humano. <ol><li> Dia 1: No dia antes da transfecção, as células Phoenix semente em uma placa de 6 poços a uma densidade de 800.000 células por poço em meio DMEM completo. </li><li> Dia 2: O dia da transfecção, 3 ug de utilizar vectores retrovirais por poço. Aliquota de 3 ug de vector retroviral para um tubo de 1,5 ml. Use uma mistura de 100 μ; l DMEM mais 6 ul de reagente de transfecção para cada 3 ug de vector. Misturar 6 ul de reagente de transfecção com 100 ul de DMEM em um tubo de 1,5 ml. (Os vectores retrovirais que são usados ​​estão indicados na tabela do equipamento / materiais). <ol><li> Incubar durante 5 min e adicionar 106 uL da mistura para dentro do tubo de pré-alíquota contendo a 3 ug de vector retroviral. Misturar e incubar à TA durante 30 min. Adicionar gota a gota toda esta mistura a cada poço das células Phoenix. </li></ol></li><li> Dia 3: O dia após a transfecção, remova a mídia a partir das células phoenix e adicionar 2 ml de meio DMEM completo fresco. No mesmo dia, semear queratinócitos humanos primários em placas de 6 poços a uma densidade de 75.000 células por poço. Manter os queratinócitos em um meio de soro livre de queratinócitos (KCSFM) com antibióticos (pen / strep). NOTA: queratinócitos humanos primários foram comprados. As células podem ser adquiridos a partir de uma variedade de fornecedores (listada na tabela de material / Equipamento). </li><li> Dia 4: Harcolete a mídia a partir das células transfectadas phoenix, que agora contém partículas virais. Passe a mídia através de um filtro de 0,45 um, utilizando uma seringa (para remover quaisquer células phoenix contaminantes) e coloque 2 ml para os queratinócitos (banhados em 75.000 células / poço no dia anterior: ver passo 2.3). Adiciona-se brometo de hexadimetrina (5 ug / ml) para os meios para ajudar a mediar o processo de infecção. Títulos virais são de 1 x 10 ~ 7 TU / mL. <ol><li> Rodar as placas de 6 poços numa centrífuga a 200 xg durante 1 h à TA. Após a rotação, remova a mídia que contém vírus e lavar as células uma vez com 1x PBS antes de adicionar KCSFM. </li></ol></li><li> Dia 5: infectar o mesmo lote de queratinócitos de novo como no passo 2.4. NOTA: Escolha os queratinócitos usando um fármaco se houver um marcador seleccionável no vector retroviral e expandir para uso em análise ou aplicações, tais como as culturas organotípicas de jusante. </li></ol> 3. Configurando culturas de pele organotï¿½icas <ol><li> Construir ocassete organotípico a partir de materiais comuns encontrados no laboratório ou as cassetes podem ser feitos através de uma oficina de fabricação de metal (Figura 2A - F). Para fazer com que essas cassetes de 3,5 cm de uma placa de cultura de tecido, utilizar um cautério para remover um 1,0 cm x 1,0 cm quadrados do centro da tampa de uma 3,5 cm de prato (Figura 2A-B). Faça isso em condições estéreis. <ol><li> Anexar pinos quadrados para a parte inferior da cassete (tampa de 3,5 cm de placa) utilizando claro unha polonês (Figura 2C). Permitir 5 min para a unha polonês para secar e virar a cassete de forma que ele está descansando sobre os pinos quadrados (Figura 2D). Coloque a cassete em um disco de 6 cm. NOTA: Praça estacas podem ser comprados a partir de uma variedade de lojas de artesanato. </li></ol></li><li> Preparar o meio de crescimento de queratinócitos (KGM) composta de 66% de DMEM, 22% de F12 de Ham, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 10% de FBS, 2,67 ug / ml de adenina, 40 Ng / ml de hidrocortisona, 10 ng de toxina da cólera ml /, 4,94 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 1,36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml de EGF, e 10 ug / ml de cloridrato de ciprofloxacina. Filtra-se a meios de comunicação através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C até estar pronto para usar. </li><li> Aqui a derme para fora da 4x Pen / Strep + solução de PBS e lavar 2 vezes em KGM e em seguida incuba-se a 37 KGM ° C durante dois dias antes da utilização. </li><li> Corte a derme utilizando um bisturi para 1,5 cm x 1,5 cm pedaços de tamanho e, em seguida, coloque-a cassete organotípico. Coloque a derme com a parte superior da derme virados para cima. A parte superior da derme será o lado que entra em contacto com os queratinócitos (Figura 1B). </li><li> Coloque a derme pré-cortadas para o furo quadrado da cassete organotípicas com o lado superior da derme voltadas para cima (Figura 3A). </li><li> Virar toda a cassete organotípico contendo a derme mais usando uma pinça (Figura 3B). Descongelar a solução de matriz extracelular em gelo. Use uma agulha e seringa para tirar 100 ml de solução de matriz extracelular por cassete. Adicione 5 gotas para o fundo da derme (lado brilhante) e agitar ligeiramente para assegurar uma distribuição uniforme da derme (Figura 3B). </li><li> Permitir 5 min para a solução comercial de matriz extra-celular para solidificar completamente (Figura 3C). Após a solidificação, utilize uma pinça para rodar a fita para trás sobre. Adicionar 4 ml de KGM com o disco de 6 cm. </li><li> Coloque 0,5-1 milhões de queratinócitos geneticamente modificados para as cassetes organotï¿½icas contendo a derme (Figura 3D). <ol><li> Tripsinizar queratinócitos por colocar 4 ml de tripsina a 0,05% em placas de 10 cm durante 5 minutos e diluiu-se com 4 ml de meio DMEM completo. </li><li> Contagem dos queratinócitos utilizando um hemocitómetro e, em seguida girar a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células 0,5-1 milhões (dependendo do número de células disponíveis) em 90 μl de KGM e colocar todas as células para a derme. NOTA: É importante colocar o mesmo número de células na derme dentro da mesma experiência para assegurar que quaisquer diferenças observadas na espessura da epiderme regenerada não é devido a diferenças no número de células de partida. Colocando menos de 0,5 milhões de células em derme pode levar a uma má estratificação e diferenciação. </li></ol></li><li> Mudar meios KGM sobre as culturas organotípicas de todos os outros dias. Tecido colheita 1-14 dias após a colocação dos queratinócitos na derme. Estratificação completa e diferenciação da epiderme geralmente ocorre após o dia 5. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

A manipulação genética na pele humana culturas organotípicas oferecem muitas vantagens para comumente estudada 2D células cultivadas, bem como modelos de mouse. Culturas 2D faltam os três célula-célula e célula-matriz extracelular interacções dimensionais encontradas em tecidos e órgãos intactos. Estudos recentes também têm encontrado enormes diferenças entre as células de câncer de pele cultivadas em 2D e 3D com as células cultivadas em 3D que mostram muito mais semelhanças de expressão do gene para a pele humana tumores primários 16. Culturas organotípicas de pele humana também têm várias vantagens sobre os modelos de ratos. Modelos de mouse são demorados e caros de gerar, bem como várias diferenças notáveis ​​entre humano e pele do rato. Estes incluem as taxas de turnover tecidos diferentes, bem como a espessura da epiderme entre murino e epiderme humana 8. Com as novas tecnologias emergentes, tais como CRISPR-CAS, genes específicos pode ser modificado / mutado para modelar doenças de pele humanas utilizando cultur pele organotípicoes 23. Além disso, os genes podem ser entregues ou derrubado nestas células através de uma ampla variedade de métodos para além da transferência de genes retroviral aqui descrito. Enquanto há entrega robusta através de transdução de elevada eficiência ou selecção de droga, o método pode ser empregue. Estes métodos de entrega incluem nucleofection de siRNAs, lentiviral, vírus adenoassociados, e vírus adeno 11,12,24-26. As culturas organotípicas de pele pode ser modificado através da adição de diferentes tipos de células ao sistema. Por exemplo, os fibroblastos humanos normais ou geneticamente modificadas podem ser adicionados à derme desvitalizados para estudar mesenquimal e epitelial diafonia. As células imunológicas podem também ser adicionados à derme para estudar a resposta inflamatória a perturbações na pele. Uma limitação deste sistema é que o processo de descamação que ocorre in vivo não ocorre em culturas organotípicas. Isto evita o uso destas culturas a longo prazo e para a maioria das análisesé feita entre 1-14 dias após a sementeira das células epidérmicas. Para os ensaios de longo prazo, as culturas organotípicas pode ser enxertadas nas costas de ratos imunes comprometidos 17,27. A cultura organotípica pele aqui apresentado é único na medida em que utiliza intactas derme humana desvitalizados, que é o substrato natural da epiderme in vivo, ao passo que a maioria dos outros sistemas usam colagénio ou Matrigel como o substrato 28. Configuração de culturas organotípicas de pele utilizando substratos tais como resultados de Matrigel em estratificação mais fino e menos robusto da epiderme em nossa experiência. A derme contém proteínas zona da membrana basal, incluindo laminina e colágeno, que permite que as células epidérmicas para anexar, proliferar, diferenciar, e estratificar 29. Uso de derme permite a geração de epiderme que imita o seu homólogo in vivo. Assim, as culturas organotípicas de pele pode ser extremamente valioso na s toxicológicos e farmacológicostudies nos casos em que os estudos em animais não são permitidos (indústria de cosméticos) 30. Usando derme desvitalizados também vem com seus próprios inconvenientes desde a espessura da derme entre diferentes doadores ou mesmo dentro de um mesmo doador pode variar. Células epidérmicas cultivadas em derme grossas tendem a não proliferar e gerar o grosso da epiderme como células cultivadas em derme mais finas. Assim, é importante escolher a espessura da derme semelhantes ao configurar as experiências comparando amostras múltiplas. Um outro parâmetro crítico é para semear o mesmo número de células epidérmicas, quando comparando diferentes grupos, de modo que quaisquer diferenças observadas não é devido a diferenças de número inicial de células semeadas. Em conclusão, a pele cultura organotípica pode servir como um avançado e eficiente modelo in vitro para validar as vias moleculares num contexto mais fisiológico, que em última instância irá acelerar a compreensão do gene regulador mechanismos que são importantes no crescimento e diferenciação epidérmica.

A epiderme humana é um epitélio estratificado que se conecta à derme subjacente através de uma matriz extracelular conhecida como a epiderme zone.The membrana basal não somente serve como uma barreira impermeável para impedir a perda de humidade, mas também como uma primeira linha de defesa para proteger o corpo de substâncias estranhas e tóxicas 1. A camada basal, que é a camada mais profunda da epiderme, contém as células estaminais e progenitoras da epiderme que dão origem a progenia diferenciada para que formam o resto da epiderme 2. Como as células progenitoras diferenciam epidérmicas que migram para cima para formar a primeira camada de células diferenciadas conhecidos como a camada espinhosa 3. Na camada espinhosa, as células ligar a expressão de queratinas 1 e 10, que, em seguida, fornecer a força necessária para suportar o esforço físico para as camadas diferenciadas da epiderme. À medida que as células da camada espinhosa diferenciar ainda mais, que se movem para cima na epiderme para am a camada granular, que é caracterizada pela formação de querato-hialina e grânulos lamelares, bem como proteínas estruturais que são montados por baixo da membrana de plasma. Como as células em prosseguir o processo de diferenciação, as proteínas abaixo da membrana plasmática estão transversal ligados uns aos outros, enquanto os grânulos lamelares são extrudadas a partir das células de modo a formar uma barreira de lípidos ricos chamada estrato córneo 4. As doenças que envolvem alterações no crescimento epidérmico e impacto diferenciação ~ 20% da população 5. Assim, o entendimento dos mecanismos deste processo é de grande importância. Desde manifestação de muitas destas doenças é contingente após a célula-célula ou célula-matriz de contacto, as culturas organotípicas de onde a epiderme humana é reconstituída num ambiente 3D foram criadas 6-10. Estes métodos envolvem tipicamente a utilização de queratinócitos primários ou transformadas semeadas em matriz extracelular, tais como humano desvitalizadoderme, Matrigel, ou colagénio. Para compreender os mecanismos regulatórios dos genes que são importantes no crescimento e na diferenciação da epiderme, os queratinócitos podem ser geneticamente manipulados através de vectores retrovirais para knockdown ou sobre-expressar genes em cultura e em seguida reconstituída 2D em 3D. Estes métodos têm sido amplamente utilizados para caracterizar genes envolvidos na haste epidérmica de células progenitoras e de auto-renovação e diferenciação, bem como a progressão para neoplasia 11-21. Aqui, um protocolo em profundidade sobre como alterar a expressão genética em culturas organotípicas epidérmicas através da utilização de retrovírus é fornecido.

<table><tbody><tr><td>Human skin</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&quot;&gt;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotropic phoenix cell lines</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautery</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antibody</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>square pegs</td><td>Arts and crafts stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vector</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

Culturas organotípicas permitir a reconstituição de um ambiente 3D crítica para interacções de contacto célula-célula e célula-matriz que imita a fisiologia e função dos seus homólogos de tecido in vivo. Isto é exemplificado por culturas de pele organotï¿½icas que recapitula fielmente a diferenciação epidérmica e programa de estratificação. Queratinócitos epidérmicos humanos primários são geneticamente manipuláveis ​​através de retrovírus onde os genes podem ser facilmente sobre-expressos ou derrubado. Estes queratinócitos geneticamente modificados podem então ser usadas para regenerar epiderme humana em culturas organotípicas de pele proporcionando um poderoso modelo para estudar vias genéticas crescimento epidérmico de impacto, a diferenciação e a progressão da doença. Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para preparar derme humana desvitalizados, bem como manipular geneticamente queratinócitos humanos primários, a fim de gerar culturas organotípicas de pele. Pele humana regenerado pode ser usado em downstream aplicações, tais como perfil de expressão gênica, immunostaining, e imunoprecipitações cromatina seguido de seqüenciamento de alta taxa de transferência. Assim, a geração destas culturas organotípicas de pele geneticamente modificados permite a determinação dos genes que são essenciais para a manutenção da homeostase da pele.

O primeiro passo na geração de pele humana organotípica é remover a epiderme da derme. A incubação de duas semana da pele a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS deve permitir a separação da derme da epiderme (Figura 1A). Se a separação da epiderme e da derme, em seguida, é difícil colocar o tecido a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS durante uma semana e, em seguida, tente novamente casca utilizando fórceps. Uma das chaves para a regeneração da epiderme humana na derme desvitalizados é para garantir que os queratinócitos são colocados sobre o lado correcto da derme. A derme tem uma parte superior e uma parte inferior. A parte superior da derme é o lado que entra em contacto com os queratinócitos in vivo, bem como em culturas organotípicas. A parte superior da derme podem ser diferenciados a partir da parte inferior da derme, devido ao brilho do fundo (Figura 1B). Se os queratinócitos são colocados directamente sobre a parte inferiorlado (brilhante) da derme, a epiderme não vai diferenciar ou estratificar corretamente. Assim, é essencial ter a parte superior da derme (não-lustroso) virado para cima na cassete organotípicas. A derme pode ser colocado directamente sobre uma cassete organotípica (Figura 2A - F). Cassetes feitos a partir de placas de cultura de tecidos deve ser esterilizado UV enquanto cassetes metálicos, pode ser autoclavada antes da derme a ser colocado. Os queratinócitos geneticamente modificados podem então ser colocada sobre a derme. Os queratinócitos são inicialmente submersa no líquido, uma vez que foram colocados sobre a derme ressuspensas em KGM. Após 24 h a KGM terá difundido através da derme, que permite que os queratinócitos para ser exposta à interface ar-líquido, o qual provoca a estratificação e diferenciação em epiderme 7 (Figura 3). ARN, proteínas, ADN / cromatina, assim como secções de tecido podem ser colhidas a partir das s organotípicasculturas de parentesco que podem ser utilizados para uma variedade de aplicações a jusante. ARN pode ser usado para determinar as diferenças entre o controlo da expressão de gene e knockdown / tecido sobre-expressão por meio de RT-QPCR, micromatrizes, ou RNA-Seq. DNA / cromatina pode ser usado para aplicações de DNA ou chip-Seq. A pele regenerada pode ser montado em OCT e secções congeladas podem ser utilizados para imuno-coloração ou hematoxilina e eosina para avaliar a morfologia do tecido, a expressão de proteína / localização em grupos de controlo e experimentais. Um exemplo disto é mostrado na Figura 4 com a coloração com hematoxilina e eosina de uma cultura típica de pele organotípicas. Note-se que todas as quatro camadas distintas da epiderme são formados com expressão específica camada de proteínas de diferenciação relacionada (Figura 4) 11,12,14,15. Este sistema pode ser usado para determinar os impactos da sobre-expressão ou knockdown de diferentes genes na epiderme. Figura 5<html> mostra tecido epidérmico regenerada que expressa o controle, LACZ, bem como sobre-expresso para tecido SNAI2. A sobre-expressão de SNAI2 conduziu a uma inibição da diferenciação epidérmica como observado pela falta de queratina 1 (K1) de coloração, bem como perda de expressão de genes de diferenciação induzida estruturais tais como TGM1 e SPRR1A (Figura 5A) C - 13,22. A espessura da epiderme mostrado na Figura 4 e Figura 5, pode variar dentro de uma mesma amostra devido a mais células acumuladas no meio da derme contra a periferia, quando as células foram inicialmente colocados na derme. Assim, as secções do meio tendem a ter epiderme mais espessa enquanto que a periferia tende a ter mais fino. Para efeito de comparação direta entre amostras diferentes das mesmas regiões de uma seção devem ser comparados. No entanto, a coloração para os marcadores devem permanecer coerente. <img alt="&lt;/ html">&quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Preparação da derme da pele humana. (A) Após incubação da pele humana a 37 ° C durante 2 semanas, a derme pode ser separado da epiderme. Fórceps são usadas para descascar a epiderme (de cor castanha) de distância a partir da derme (branco). (B) A parte superior da derme pode ser distinguida a partir da parte inferior do brilho do tecido. A parte superior da derme (do lado que vai naturalmente encarar in vivo a epiderme ou onde os queratinócitos serão semeadas) é não-lustrosa. A parte inferior da derme é brilhante. O tecido é rosa devido à incubação em KGM. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53280/53280fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53280/53280fig2.jpg" /> Figura 2. Geração de cassetes organotípicas. (A) Use um cautério para remover um 1,0 cm x 1,0 cm praça do centro da tampa de um 3,5 cm prato. (B) Retire a praça do centro da 3,5 centímetros prato. (C) Use clara unha polonês para aderir pinos quadrados. Permitir 5 min para a unha polonês para secar. (D) Vire a tampa de forma que ele está descansando sobre os pinos quadrados. A cassete está agora pronto para ser usado. (E) Imagem de um metal fabricado cassete organotípico com suas dimensões. (F) A imagem de uma cassete fabricados de metal virada de cabeça para baixo para mostrar as estacas de apoio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53280/53280fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53280/53280fig3.jpg" /> Figura 3. Geração de organotculturas de pele ypic. (A) Coloque a derme com a parte superior da derme (lado não-brilhante) voltado para cima sobre a cassete organotípico. (B) Virar a cassete mais e adicionar Matrigel para o lado brilhante da derme. (C) Permitir 5 min para o Matrigel para solidificar e, em seguida, virar a cassete para trás sobre. (D) Add queratinócitos geneticamente modificados para a derme (0,5-1 milhões de células são ressuspensas em 90 ul de KGM). Colher o tecido 1-14 dias após a semeadura dos queratinócitos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53280/53280fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53280/53280fig4.jpg" /> Figura 4. Hematoxilina e eosina de culturas organotípicas de pele. Regenerada pele humana contém tanto a epiderme e derme. A epidermeé é totalmente diferenciada e estratificada com 4 camadas distintas. Essas camadas incluem a camada basal indiferenciado e as 3 camadas diferenciadas incluindo camada espinhosa, granulosa e córnea. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53280/53280fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53280/53280fig5.jpg" /> Figura 5. imunofluorescência e análise de epiderme humana geneticamente modificados a expressão do gene. (A) A sobre-expressão de SNAI2 inibe a diferenciação epidérmica. A coloração para proteína queratina diferenciação 1 (K1) é mostrada em verde e núcleos é marcada em azul (Hoechst). (B) Análise de RT-QPCR sobre os níveis de mRNA de SNAI2 em controlo de LACZ e tecido superexpressando SNAI2. As barras de erro = SD, n = 3 (C) Análise de RT-QPCR no ARNmníveis de transcrições de diferenciação KRT1, TGM1, e SPRR1A no controle LACZ e tecido overexpressing SNAI2. As barras de erro = SD, n = 3. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53280/53280fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K visualizações.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

Vídeo: Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Pesquisa do câncer

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioengenharia

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Uma revisão abrangente dos protocolos de cultura de explante de pele embrionária aviária

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autor em destaque: Insight sobre as atuais metodologias experimentais de explante de pele aviária

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Resumo

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Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

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Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado