The authors have nothing to disclose.

Este estudo foi realizado de acordo com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH), aprovado pelo Comitê de Ética do Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão). 1. Os animais, cirurgia e Specimen Preparações NOTA: Prepare o tecido cerebral para análise microscópica confocal 3D. <ol><li> Divida os animais aleatoriamente em dois grupos: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection tratamento com genisteína (n = 8); administrar a genisteína (10 mg / kg, diluída em um veículo tal como óleo de rícino polietoxilado) por gavagem 1 hora antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme anestesia adequada por falta de reflexo de retirada depois de beliscar o dedo do pé. Use pomada nos olhos durante a cirurgia para prevenir o ressecamento. </li><li> Coloque animais no aparelho estereotáxico e cabeça de barbear. Aplicar iodINE solução para limpar o couro cabeludo antes da incisão e manter o local da operação estéril durante a cirurgia para reduzir o risco de infecção. Injectar Ap 1-40 estereotaxicamente (4 ul) no hipocampo a -3,5 mm posterior ao bregma, ± 2 mm lateral à linha média, e -2.8 mm abaixo da dura-máter, de acordo com o atlas de cérebro de rato 8. Para o método estereotáxico por favor veja a publicação anterior 9. </li><li> Fornecer pós-operatório de observação / cuidado até que os animais são totalmente consciente para garantir o conforto dos animais. Mantenha os animais quente durante a recuperação, e não devolvê-los para uma gaiola com outros animais até a recuperação completa. Preste atenção a qualquer sinal de infecção nos animais após a cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais profundamente por cetamina (150 mg / kg) três semanas após a cirurgia. Realizar transcardial fixação por perfusão dos animais com solução salina a 0,9%, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (pH = 7,4), em seguida, remover e corrigir cérebro, tal como descrito em 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% durante 2-3 dias a 4 ° C. </li><li> Incorporar o tecido em blocos de parafina pelo uso de equipamentos de tecido de incorporação, e evitar sub-enchimento ou sobre-enchimento a cassete, pois pode interferir com o alinhamento ou de corte correta. Prestar atenção à orientação do tecido no bloco de parafina. NOTA: O hipocampo de ratos, por exemplo, está perto de parte posterior do hemisfério cerebral. Assim, o tecido deve ser incorporado em uma forma de seccionamento que começa na parte posterior do cérebro. Utilizar o atlas Paxinos 8 como um guia para alcançar a desejada estrutura anatómica. </li><li> Coloque o micrótomo longe de correntes de ar ou portas desde movimentos aéreos fazer a manipulação de partes mais difíceis. </li><li> Use seções com um de espessura ≥20 como com esta profundidade seja necessário para produzir imagens Z-pilha de astrócitos completos. Não use as primeiras seções casal, como eles podem ter espessura indesejada devido a e térmicaXpansion. </li><li> Coloque as seções sobre a superfície da água quente (5 ± 2 C, abaixo da temperatura de fusão para parafina) apenas o tempo suficiente para achatar as seções. NOTA: Ao longo da secção de expansão pode perturbar a morfologia da estrutura. Use pincel pequeno para transferir cuidadosamente seções. Recolha de dois a três seções em cada slide. </li><li> Armazenar as lâminas em um rack na posição vertical e deixe-os secar a 37 C durante várias horas ou O / N. </li></ol> 2. A imuno-histoquímica <ol><li> Desparafinar secções em xileno, 2 x 10 min, e re-hidratados através de gradiente de álcool (99,8%, 95%, e 70%, 10 min cada) e PBS. </li><li> Incubar com anticorpos contra a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) diluído 1: 1500 em PBS contendo 0,25% de albumina de soro bovino (BSA), 0,25% de Triton X-100 e 3,5% de soro normal (O / N a 4 ° C). </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Incubar com fosfato alcalino antibodie secundário conjugados durante 1 h (1: 100, 21 C, diluiu-se em PBS). </li><li> Lavam-se as secções em PBS durante 3 x 5 min. NOTA: É importante lavar as seções corretamente após anticorpos secundários para minimizar a coloração de fundo. </li><li> Incubar seções na escuridão com líquido Cromógena Red Permanente (15-20 min). Nota: Preparar a solução não mais do que 30 minutos antes do uso. </li><li> Lavar as secções em PBS durante 3 x 5 min. </li><li> Finalmente, os núcleos coram com 4-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 500, diluído em PBS) antes da cobertura deslizante. Armazenar os slides na geladeira 24-48 h antes de microscopia. </li></ol> 3. Microscopia Confocal NOTA: Para a avaliação quantitativa (ver abaixo), seleccionar um dos astrócitos com um núcleo com manchas de DAPI claramente visível com um mínimo de sobreposição ramos para reduzir o risco de erros. Produzindo imagens Z-Stack é demorado. Seja paciente e não parar durante o processamento. Confocal na vertical a laser microscópio de varredura é used para criar imagens 3D a partir de astrócitos. <ol><li> Coloque o slide no palco microscópio, e selecione o objetivo 63X. </li><li> Abra o software de imagem e clique em sistema Start. Clique na aba Localize. Ir para Atribuir e selecione GFP para ajustar a luz adequada. </li><li> Abra o obturador para refletir a luz. Encontre o refletor Revolver no lado direito do Obturador e escolher a cor que deve ser reflectido pelos astrócitos (verde, vermelho ou violeta); cor vermelha (FSet20 WF) foi utilizado aqui. NOTA: Não se esqueça de focar a imagem diretamente na ocular do microscópio. </li><li> Para encontrar o melhor foco, clique em todas fechadas, colocar o pino microscópio no modo de tela, e clique na guia Acquisition. </li><li> Clique na configuração inteligente sob a guia de Aquisição; uma janela se abre. Selecione o fluoróforo adequado (ou seja, DAPI e Alexa Fluor 555, no projeto atual) da lista. A cor é selecionado automaticamente. </li><li> Clique na melhor sinal, e aplicar, em seguida, clique em Definir Exposição; o computador irá então automaticamente os parâmetros de exposição. </li><li> Para otimizar a imagem, vá para a janela Channels. Desmar Track2, realce Track1 e clique em Live. Foque a imagem, se necessário. </li><li> Na janela Canais ajustar as seguintes chaves; clique no 1AU para otimizar automaticamente o pinhole. É muito importante fazer esta etapa caso contrário, as imagens confocal será não-ideal. Ajuste de Ganho de ter a melhor intensidade (manter essa configuração abaixo de 800 para reduzir o ruído adicional). Finalmente, defina o Ganho Digital entre 2 e 3. </li><li> Desmar Track1, clique em Track2 e repita o Passo 3.8 para Track2. Então pare Live. </li><li> Vá para a janela no modo de aquisição. Melhorar a imagem, otimizando Frame Size e Média. Para mudar tamanho do quadro ir para X * Y e selecione 1024 x 1024. Escolha uma velocidade lenta para criar uma imagem melhor. </li><li> Ir para a Média e selecione um número ≥4. Este valor indica o número de média de exames que serão em média de producè A imagem adquirida. Agora clique no botão Snap, e salvar a imagem em 2D capturado. </li><li> Para geração de imagens 3D, marcar o item Z-Stack em Configuração inteligente fazendo com que a janela Z-Stack para abrir. </li><li> Definir as primeiras e últimas posições para o Z-pilha, isto é, a profundidade da célula. Primeiro, clique em Live. Em seguida, use a unidade de foco do microscópio para se concentrar em sua posição mais elevada de astrócitos no tecido, onde o Z-Stack é começar. Clique em Set First. Em seguida, concentrar até a posição mais baixa do astrócito no tecido, onde Z-Pilha de varrimento deve ser interrompido. Clique em Set Último. Então pare Live. </li><li> Escolha o intervalo; 1,01 uM é utilizado no presente estudo; intervalo de escolha pode ser feito clicando no Optimal para definir o número de fatias. </li><li> Clique em Iniciar Experiment. Salve as imagens uma vez que a verificação for concluída. Esta imagem será utilizada para a medição dos parâmetros seguintes: área superficial e volume de território dos astrócitos, o astrócitos inteiro, incluindo branches, corpo da célula, e núcleo. </li><li> Adquirir uma imagem 2D usando uma objetiva de 10X ou 20X conforme descrito nos Passos 3.6-3.11. Esta imagem pode ser utilizada para a medição da intensidade de fluorescência a imunorreactividade de anticorpos, e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). </li></ol> 4. Astrocyte Densidade e GFAP + Intensidade de Fluorescência <ol><li> Abra a imagem 20X 2D. Clique na Histo (Hisogram) no lado esquerdo da janela da imagem. </li><li> Para calcular a densidade de astrócitos, selecione três campos visuais consecutivos no âmbito do objectivo 20X. Contar o número de astrócitos que exibem uma soma claro com mínima, a sobreposição de ramos nos campos. </li><li> Para quantificar a intensidade de fluorescência, selecione uma ferramenta adequada (retângulo ou círculo) no rodapé da janela de imagem e escolher uma área para a medição. Observe o valor médio eo desvio padrão aparecer automaticamente sob a imagem. No estudo atual, 0,7 mm2 área retangular entre strfoi utilizado iatum e lâmina medial do giro denteado. </li></ol> 5. Ramos astrócitos <ol><li> Para quantificar o comprimento eo número total de sucursais, usar imagens 3D (adquiridos com 20X) no software analisando a imagem. Desenhar uma linha manualmente ao longo do comprimento de cada ramo da astrocyte selecionado. Em seguida, selecione a ferramenta de medição que é especializada para medir a linha de comprimento. Para quantificar o número de agências, selecione a ferramenta de contagem para contar o número de itens selecionados. </li></ol> 6. Volume e Área de Superfície NOTA: A marcação de uma estrutura manualmente em 3D software de análise de imagem requer foco e treinamento. Pratique várias vezes antes de iniciar um experimento. <ol><li> Para quantificar o volume ea área de superfície do núcleo astrócitos, soma, corpo celular e território, transfira as imagens 3D (adquiridos nos Passos 3.1-3.16) para um software de análise de imagens 3D, como Volocity 6.1. </li><li> Abra o software e criar um novobiblioteca. Arraste todas as imagens para a coluna cinza à esquerda na nova biblioteca. Em seguida, selecione uma imagem 3D. À direita, há diferentes canais com cores diferentes. Ligue um canal de interesses; por exemplo, o canal de azul para DAPI quando se mede o núcleo. Alterar o brilho manualmente para obter um contraste ideal. </li><li> Selecione o menu Ferramentas, GO para fazer volume e produzir uma única imagem 3D a partir de imagens Z-stack. Clique em Propriedades no menu Editar e ter certeza de que X, Y e Z propriedades são apresentados; caso contrário, é impossível realizar uma análise 3D. </li><li> Clique no ícone da ferramenta Freehand RIO na barra de ferramentas. Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos núcleo a desenhar uma linha ao redor do núcleo marcado com DAPI. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície do corpo celular astrocyte a desenhar uma linha ao redor da soma excluindo ramos. </li><li> Para medir o volume ea área de superfície de astrócitos inteiro (corpo celular, incluindo filiais) a desenhar uma linha ao redor da soma após asuperfície de todos os ramos. </li><li> Para avaliar o volume ea área de superfície do território astrocyte a desenhar uma linha entre pontas dos ramos. NOTA: Pressione a tecla Delete no teclado para apagar desenhos indesejados. </li><li> Clique no menu Medições na parte superior da janela de imagem para criar um protocolo de medição; uma janela contendo diferentes ferramentas abre. </li><li> Arraste Encontre objetos para parte superior da janela (painel). Dê um nome descritivo à População 1, selecione a cor associada, e clique em Medida. Outra janela se abre. </li><li> Escolha um parâmetro ou seja, o volume ou a superfície. Clique em OK. Os dados serão exibidos em uma tabela. </li><li> Para salvar os dados clica no menu de medição e selecione Criar item de medição. </li><li> Selecionar um novo item de medida chamada a partir da janela aberta. Em seguida, dê um nome para os dados e clique em OK. </li><li> Finalmente, exportar os dados para software estatísticas, como Graph pad ou excel programa. Use t-teste para analisar os dados, em seguida, traçar 2D grAPHS. </li></ol>

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Este trabalho foi financiado por subvenções do Conselho do Condado de Östergötland, (Suécia) e da Celular e Molecular Research Center no Irã Universidade de Ciências Médicas (Teerão, Irão).

No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap 1-40 - foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos. As alterações no ambiente intracelular e extra do tecido do cérebro pode alterar o volume e / ou o tamanho de células / tecido. Essas alterações são consideradas características patológicas de várias lesões cerebrais 3,11. Para quantificar estas alterações, um número de técnicas são usadas. A maioria das investigações são baseadas no uso de imagens de baixa resolução em 2D capturadas por microscopia claras ou eletrônica (ME) que dão informações apenas sobre uma pequena fração do cell. Para superar essa limitação, confocal morfometria 3D em imagens de alta resolução foi desenvolvido 11. Outra vantagem de microscopia confocal que é a arquitectura de uma célula pode ser estudada desde várias imagens 2D consecutivos são obtidos enquanto a imagem Z-pilha é realizada. Além disso, a microscopia confocal 3D levanta a possibilidade de melhorar a qualidade das imagens, filtrando o ruído de fundo 11. O método aqui apresentado é demorada; a tomada de imagens Z-stack com um microscópio confocal demora vários minutos para cada célula única. Além disso, a marcação manualmente uma estrutura em software requer um pouco de prática, eo pesquisador pode precisar refazer as desenho várias vezes para ter certeza de que a estrutura está marcado corretamente. Refira-se que a guia &#39;Magic&#39; em 3D software de análise de imagem, tais como Volocity, pode ser usado para marcar automaticamente todos os núcleos manchado de DAPI em uma única imagem. Esta opção pode ser utilizada quandoastrócitos são cultivadas. As seções do cérebro, no entanto, conter não só os astrócitos, mas também muitas outras células, como microglia e neurônios. Isto significa que muitos dos núcleos corados-DAPI não pertencem a astrócitos. Os núcleos associados com astrócitos devem ser marcados manualmente usando imagens que têm ambos os núcleos DAPI-rotulados e astrócitos GFAP-imunorreactivas. Neste protocolo, os anticorpos contra GFAP foram usadas para visualizar os astrócitos em parafina. Os astrócitos podem também ser visualizados por utilização de outros antigénios 12,13, ou ratinhos transgénicos. Os investigadores devem estar conscientes das limitações dos métodos, e usar o melhor projeto experimental possível com base em seus objetivos. A limitação de utilizar anticorpos contra GFAP, por exemplo, é que apenas 10-15% do citoesqueleto podem ser detectados. Esta limitação, no entanto, pode se tornar uma vantagem quando se estuda astrogliosis; o aumento do número de astrócitos e uma densa rede de ramos em astrócitos como &#39;trogliosis pode tornar difícil a identificação de uma única célula, se uma área maior da célula é detectada. Embora este protocolo descrever a quantificação de 12 parâmetros diferentes, mas o investigador pode escolher os que melhor atendem a sua finalidade. De acordo com nossa experiência, as medições de todos os parâmetros podem dar informações valiosas sobre os parâmetros que são significativamente afetados em uma determinada condição ou por um tratamento. O método de quantificação realizado em imagens 3D capturadas em microscópio confocal também pode ser realizada em secções congeladas. A questão é tratar as amostras (de fixação, a desidratação, a incorporação de seccionamento e) de uma maneira semelhante uma vez que estes passos podem levar ao encolhimento ou inchaço do tecido. Em conclusão, imagem confocal 3D, em combinação com o software morfométrica, faz com que seja possível quantificar vários parâmetros associados com a morfologia de uma célula. O protocolo que apresentamos aqui pode ser usado para avaliação morfológica de chanGES que aparecem em uma célula, em diferentes condições patológicas, ou como o efeito de uma estratégia de intervenção.

Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase 1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos 4,5. Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o resultado clínico de intervenções terapêuticas. Por conseguinte, os astrócitos têm recebido atenção de neuroscientist durante as últimas décadas, como alvos potenciais para intervenção terapêutica para uma variedade de doenças que afectam o SNC. Os astrócitos têm normalmente uma forma estrelada com o bem-defined ramos que se espalham ao redor da soma 6. Em uma condição de doença no cérebro, ramos de astrócitos tornar complicado e mostram extremidades inchadas 7, por exemplo na presença de beta-amilóide (Ap). Este artigo apresenta um protocolo para a análise de imagens em 3D de astrócitos adquiridos por meio de microscopia confocal. Doze parâmetros quantitativos diferentes para cada astrócitos foram medidas: as áreas de superfície e volumes do território astrócitos (o tecido coberto por uma astrócitos), célula inteira (incluindo filiais), corpo celular e núcleo; o comprimento total e número de agências; a intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos; e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este fim, utilizou-se secções do cérebro de ratos expostos a injecção intra-hipocampal de Ap 1-40, com ou sem tratamento genisteína como uma substância anti-inflamatória. O protocolo descrito pode ser usado para uma morfométricaANÁLISE de diferentes tipos de células, in vitro ou in vivo em diferentes condições.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide 1-40 </sub&gt; (Ap 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.

Esta secção apresenta alguns exemplos das observações qualitativas e quantitativas produzidos por análise morfométrica 3D. Para os resultados completos de todos os 12 parâmetros mencionados anteriormente, consulte nossa publicação anterior 10. Observações qualitativos Os astrócitos exibiram ramos finos ou grossos que eram geralmente muito tempo em Aâ 1-40 ratos injectados (Figura 1). Algumas pequenas astrócitos em forma de estreladas com ramos curtos foram observados no córtex cerebral, e uma rede compacta de astrócitos ocorreu no corpo caloso. Os astrócitos nos tecidos cerebrais de animais com Ap 1-40 -injection seguido por tratamento genisteína exibiu uma forma estrelada com ramificações curtas e finas (Figura 2) 10. Há alguns astrócitos mostrou uma aparência atrófica. Densidade e astrócitos GFAP +Intensidade de Fluorescência A média do número de astrócitos / 1.000 mM 2 foi significativamente maior em ratos com Ap 1-40 -injection em comparação com os animais em Ap 1-40 -injection grupo de tratamento e genisteína (P &lt;0,0001). Além disso, a intensidade de fluorescência GFAP + foi significativamente menor na secção de cérebro com o tratamento de genisteína em comparação com não-tratada Ap 1-40 animais injectados (Figura 3). Morphometric Análise de Volume Os astrócitos O volume do território astrócitos núcleo, do corpo celular, todo astrócitos e astrócitos diminuiu significativamente no grupo de tratamento comparado com genisteína animais não tratados. Este resultado sugere que a genisteína melhorada a astrogliose causada pela presença de amilóide (Figura 4A - D). Figura 1. Imagem confocal de um astrócitos. Um astrocyte indivíduo com ramos grossos e longos (seta) e núcleo marcado com DAPI (seta) em um cérebro de rato submetido a injeção do hipocampo de Ap 1-40. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53113/53113fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem confocal de um astrócitos. Um astrócitos com ramos curtos (seta). Em um cérebro de rato submetido a hipocampal Ap 1-40 -injection, e pré-tratamento genisteína administrada por sonda. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig2large.jpg" target="_blank">P</a><html> locação clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53113/53113fig3.jpg" /> Figura 3. GFAP + intensidade de fluorescência significativamente diminuída em animais com β 1-40 -. De injecção que receberam pré-tratamento genisteína Os valores são média ± SEM. Foram avaliadas cinqüenta astrócitos por animal. P &lt;0,05 foi considerado significativo, e foi utilizado o teste t para comparar os dados entre os grupos com ou sem tratamento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> g &quot;/&gt; Figura 4. O volume médio do núcleo (A), do corpo celular (B), astrócitos (incluindo ramos; (C), e território (D) em amostras de cérebro tomadas a partir de ratos submetidos a Ap 1-40 -injection, com ou sem genisteína pré-tratamento. A genisteína melhorou significativamente o alargamento do núcleo, do corpo celular, toda a astrócito, e território astrócitos (ver ref 10). Os valores são média ± SEM. Cinquenta astrócitos por animal foram avaliadas. P &lt;0,05 foi considerado como significativo, e foi utilizado o teste t para comparar os dados entre os grupos antes e após o tratamento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53113/53113fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K visualizações.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Vídeo: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Neurociência

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biologia

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Um método para reconstrução 3D e análise de realidade virtual de células gliais e neuronais

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
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