Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.

Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas. 1. Rato Manuseio e Recolha de Tecidos <ol><li> Prepara-se uma estação de trabalho estéreis e obter ferramentas estéreis para a recolha de tecido. Essas ferramentas incluem tesouras grandes e pequenas cirúrgicas, fórceps, e pinças de ponta fina. Incluem pequenas placas de Petri marcadas com os nomes apropriados de tecidos, cheio com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) (3-5 ml) equilibrada à temperatura ambiente (20-22 ° C). Também incluem uma grande placa de Petri, não marcado, encheu-se com solução de PBS 1x (10 - 15 mL). </li><li> Eutanásia um ratinho grávida (10,5-19,0 ​​dias pós-coitum (DPC) ou antes da entrega) utilizando dióxido de carbono (CO 2). Para garantir que o rato é sacrificado, use a técnica de deslocamento cervical. Nota: Antes de 10,5 dpc, é difícil separar manualmente os tecidos deciduais dos tecidos uterinos. Se o isolamento de leucócitos deciduais não é necessária, a partir de leucócitos nos tecidos uterinos dos ratos não grávidas ou aqueles de ratinhos a &lt;10,5 dpc pode também ser realizada seguindo este protocolo. </li><li> Utilizando um par de tesouras cirúrgicas esterilizadas, remover completamente a porção abdominal inferior da pele e do tecido muscular. Com uma pinça, afastar todos os outros órgãos até o útero e os ovários são visíveis. Com o útero ainda ligado, utilizar a pinça para se mover para fora da cavidade peritoneal (Figura 1A). </li><li> Localize os ovários distais à junção oviduto e uterotubal de cada corno uterino. Usando as pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na junção uterotubal e separar os cornos uterinos do mesentério contendo os vasos uterinos; então,consumos específicos no colo do útero para separar os cornos uterinos da cavidade peritoneal (Figura 1B). </li><li> Com pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos cornos uterinos. Deixar ligada uma porção do colo do útero durante este processo (Figura 1C) para evitar a abertura do corno uterino. </li><li> Mergulhar os cornos uterinos (incluindo colo do útero) num grande prato de Petri cheio com solução de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar os locais de implantação. </li><li> Enquanto ainda imersos em solução de PBS 1x, aparar qualquer gordura dos cornos uterinos com as pequenas tesouras cirúrgicas. Manter os tecidos imersos em solução de PBS 1x toda a dissecção. </li><li> Segurando os cornos uterinos no lugar com a pinça, retire um dos locais de implantação do útero com um corte transversal através da região inter-implantação, utilizando as pequenas tesouras cirúrgicas (Figura 1D). O local da implantação contém o feto, rodeado pelamembrana corioalantï¿½ca, e uterina, decidual, e os tecidos placentários. </li><li> Usando fórceps, segure o local no lugar e fazer uma pequena incisão na parede uterina adjacente à placenta e tecidos deciduais (Figura 1E). Guarnição em torno do perímetro da placenta / decídua até que estas se separar tanto a parede uterina e da membrana corioalantóica que inclui o feto (Figura 1F). </li><li> Remover a placenta e tecidos deciduais ligados e coloque em solução PBS 1x (3-5 ml; veja o passo 1.12). </li><li> Inserir o feto rodeado pela membrana corioalantóica ligado aos tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). A hidratação destes tecidos vai facilitar a separação da membrana corioalantóica da parede uterina (ver passo 1.14). </li><li> Usando um par de pinças de ponta fina, delicadamente descascar o tecido decidual (camada branca-acinzentada) a partir da superfície placentária. Execute estapasso com cuidado para manter a integridade da placenta e tecidos deciduais (Figura 1G). </li><li> Coloque a placenta e tecidos deciduais em duas placas de Petri marcadas separadamente cheios com uma solução de PBS 1x (3-5 mL de cada). </li><li> Remova cuidadosamente a parede uterina da membrana corioalantï¿½ca com uma pinça de ponta fina. Estes são os tecidos uterinos. </li><li> Colocar os tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). </li><li> Repita os passos 1.8 a 1.15 até que todos os locais de implantação foram processadas. </li><li> Recolha diversos uterino, decidual, e tecidos da placenta para melhorar o rendimento das células durante a digestão enzimática. A quantidade de tecidos depende do tamanho da ninhada; no entanto, o isolamento de leucócitos requer&gt; 2 peças de tecido. Nota: Para informações mais detalhadas sobre a dissecação dos locais de implantação em diferentes dias gestacionais, visualizar as imagens encontradas no capítulo dois do Guia para investigatiem 42 de rato Gravidez. </li></ol> 2. uterina, Decidual, e Placentário dissociação Tissue <ol><li> Rotular vários estéreis 2 ml tubos cónicos com o nome do tecido adequado, e colocar num frasco com 1000 ml de solução enzimática em gelo. </li><li> A partir da placa de Petri com solução de PBS 1x, transferem dois pedaços (100-150 mg) de uterina, decidual, ou tecidos da placenta para um tubo de 2 ml rotulados cónica. </li><li> Adicione 500 ml de solução enzimática frio em cada 2 ml tubo cônico. </li><li> Com uma tesoura fina estéreis, começam a dissociar o tecido imerso na solução enzimática até que seja finamente picados. Ao longo do tempo, a suspensão irá desenvolver uma aparência leitosa. Este passo não deve ser superior a mais de 2 minutos para evitar o excesso de manipulação da amostra. </li><li> Uma vez que o tecido foi dissociado, adicionar um extra de 500 mL de solução enzimática frio para a 2 ml tubo cônico. </li><li> Colocar o tubo cónico de 2 ml em gelo. </li><li> Repita os passos 2.2 a 2.6 com todos os tecidos até que todos os tecidos foram processados. </li><li> Transferir todos os 2 ml de tubos cónicos com tecido homogeneizado (tecido moído + solução enzimática) amostras do gelo em uma incubadora a 37 ° C e realizar uma agitao orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Certifique-se de que a temperatura da incubadora é estabilizado antes do início do tempo de incubação. </li><li> Após a incubação, remove os 2 ml de tubos cónicos com tecidos dissociada da incubadora e colocá-los em gelo para evitar mais digestão. </li><li> Rotular estéreis de 50 ml tubos cônicos de acordo com o tipo de tecido. Retire as tampas e substituí-los com um filtro de células estéril (100 tamanho de poro). </li><li> Pour os tecidos dissociados do 2 ml de tubos cónicos de células através do filtro, utilizando ~ 20 ml de solução de PBS 1x. Os fragmentos de tecido permanece no filtro de células e a suspensão de células passarão através dela. </li><li> Lava-se a ditecidos ssociated no filtro celular de 2 - 3 vezes com 20 ml de solução de 1x PBS utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Lave os vazios 2 ml tubos cônicos com solução PBS 1x (1 ml) e despeje o conteúdo através dos filtros celulares. </li><li> Retire os filtros celulares de 50 ml tubos cônicos e substituir as tampas. Centrifugar os tubos a 1250 xg durante 10 minutos a 4 ºC. </li><li> Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. O sedimento celular contém os leucócitos e células do estroma isoladas. </li><li> Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura RPMI sem soro fetal bovino (FBS). Misture delicadamente. Não use vortex. </li><li> Adicionar 500 uL de SBF puro para um tubo de poliestireno de 5 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 1100 xg, sem o travão à TA para sedimentar as células viáveis ​​quando os restos celulares são retidos na interface PBS / FBS. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem tocar no sedimento celular. O cell pastilha contém principalmente células viáveis. </li><li> Opcionalmente: Para concentrar as células mononucleares, usar uma solução de polissacárido saturada de 20%, como descrito abaixo. <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 uL de meio de cultura RPMI sem FBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de polissacárido saturada de 20% para um tubo de plástico de poliestireno de 5 ml e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo desta solução, de acordo com as instruções do fabricante. Enquanto a disposição em camadas da amostra, evitar a mistura da solução de polissacárido saturada de 20% com a suspensão de células. </li><li> Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min à TA sem travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e perder o gradiente. As células mononucleares podem ser encontrados na interface entre a solução de polissacárido saturada a 20% e a solução de PBS 1x. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante. O sedimento de células contém principalmente células mononucleares. Nãote: Para realizar a coloração de viabilidade e coloração intracelular, consulte a etapa 3. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a etapa 4. Para realizar a coloração de viabilidade e coloração extracelular somente, veja o passo 5. Para executar uma cultura de células de leucócitos isolados, consulte o passo 6. Para executar separação de células magnéticas, consulte a etapa 7. </li></ol></li></ol> 3. a coloração de viabilidade para Células fixável <ol><li> Ressuspender o sedimento de células em 1,100 ml de solução de PBS 1x. Misturar suavemente usando uma micro-pipeta. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células para um tubo de plástico de 5 ml de poliestireno. Adicionar 400 ul da solução 1x PBS para o tubo de polistireno de 5 ml. Este tubo é um controlo de tecido auto-fluorescência. Armazenar a 4 ° C até o passo 3.5. </li><li> Transferir os restantes 1.000 ul da suspensão de células para um novo tubo de 5 ml de poliestireno plástico. Adicionar 1 mL do corante de viabilidade e homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 ºC. </li><li> Após a incubação, adicionar 1000 &amp; #181; l de solução de PBS 1x. Misture delicadamente com a mão. </li><li> Centrifugar ambos os tubos de poliestireno de 5 ml de plástico (as etapas 3.2 e 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: O sedimento de células (passo 3.3) vai ser usado no passo 4. O sedimento de células (passo 3.2) vai servir como um controlo para o tecido auto-fluorescência. </li></ol> 4. A imunofenotipagem <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 50 ul de anti-ratinho de CD16 / CD32 (diluído 1: 100 em tampão de SCAF [BSA a 0,1%, azida de sódio a 0,05%, solução de 1X PBS, pH 7,4]). Misturar suavemente a suspensão de células. Não use o vórtice. </li><li> Incubar a suspensão de células no tubo de polistireno de 5 ml no escuro a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Após a incubação, adicionar 50 ul de cada anticorpo monoclonal anti-leucócito reagir com os marcadores de superfície celular ou extracelular anticorpo de controlo de isotipo coincidente (diluições de anticorpos deve ser validado). Por exemplo, para analisar as sub-populações de leucócitos, usar anti-Moutilizar os anticorpos que reagem com os seguintes marcadores de superfície de células de leucócitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabela 1). </li><li> Uma vez que os anticorpos contra marcadores extracelulares foram adicionados a 5 mL do tubo de poliestireno de plástico, mistura suavemente. Incubar no escuro durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta incubação, preparar e pré-aquecer a solução de tampão de fixação (diluída com água desionizada, 1: 5) a 37 ° C, se necessário. Mantenha o tampão a 37 ºC no escuro até que seu uso é necessário. </li><li> Após 30 min de incubação, adicionar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo plástico de poliestireno e misturar suavemente. Este passo é necessário para lavar as células e remover qualquer excesso de anticorpo não ligado. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: Se a coloração intracelular não é necessário, ver passo 5. Se a coloração intracelular é necessário, efectuar a permeabilização e intracelularcoloração ular aqui, e então prosseguir com a fixação (passo 4.8). </li><li> Adicionar 500 ul da solução tampão de fixação pré-aquecido ao sedimento de células e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ºC. </li><li> Dispensar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo de poliestireno plástico. Misture delicadamente. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de FACS para cada amostra. Estas amostras podem agora ser analisadas por citometria de fluxo. Adquirir as amostras imediatamente para obter melhores resultados. </li></ol> 5. a coloração de viabilidade de células unfixable <ol><li> Depois de imunofenotipagem extracelular, ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de FACS. </li><li> Adicionar 1 ml de 4 &#39;, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 200 ng / ml) imediatamente antes de adquirir a amostra. </li><li> Visualizar as amostras dentro de 1-2 minutos após a adição de DAPI utilizando um citómetro de fluxo. </li></ol><ol><li> Prepare uma estação de trabalho sob uma coifa estéril. Pré-aquecer o meio de cultura RPMI a 37 ° C usando um banho de água. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 ul de tampão de FACS para contagem das células. </li><li> Contar o número de células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou hemocitómetro e solução de azul de tripano a 0,4%, seguindo as instruções do fabricante. Grave a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min para remover o tampão de SCAF. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio de cultura RPMI pré-aquecido por pipetagem suave de 2 a 3 vezes. </li><li> Placa o número desejado de células em um filtro estéril placa de 24 poços e incuba-se a 37 ° C. O tempo de incubação será determinada pela questão de pesquisa. </li></ol> 7. Magnetic Seleção celular <ol><li> Configurar uma estação de trabalho limpo, com os seguintes materiais: Colunas MS, separadores de células magnética, 15tubos cónicos de 30 ml uM filtros de pré-separação, e um multi-suporte. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de MACS (0,5% de BSA, EDTA 2 mM, solução de 1x PBS, pH 7,2). </li><li> Usando um contador de células automático ou hemocitï¿½etro e 0,4% de solução de azul de tripano, contar e registrar a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicionar mais 500 ul de tampão MACS. </li><li> Avance para realizar a separação magnética seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Determinar a pureza por citometria de fluxo ou microscopia. </li></ol>

Os autores revelam que não há conflitos de interesse.

A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez 31,38,39,43-46. No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não especifica quantidades de tecido, e, mais importante ainda, não sempre especificar a viabilidade das células isoladas. O protocolo aqui descrito permite o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal com alta viabilidade, e fornece informações detalhadas sobre os reagentes comerciais, tampão de preparação, as quantidades de tecido, e os tempos de incubação validado nolaboratório. Um dos passos mais críticos do processo de isolamento de leucócitos é a dissociação de tecidos; Esta etapa envolve a homogeneização mecânica e / ou reacções enzimáticas que podem alterar a integridade de proteínas extracelulares utilizados na caracterização fenotípica 47. O protocolo aqui descrito oferece uma nova abordagem que combina a utilização de técnicas de dissociação de tecido mecânicos suaves e enzimáticas para preservar a integridade dos marcadores extracelulares nos leucócitos isolados a partir da placenta e deciduais e os tecidos uterinos dos ratos. Enzimas individuais e combinações de enzimas diferentes têm sido utilizados para isolar leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal 31,32,39,44. Em muitos casos, estas enzimas que estão preparadas para concentrações específicas à mão no laboratório pode estar sujeito a erro humano. Aqui, em vez disso, uma colagenase purificados / prot neutro ready-to-usefacilitar cocktail, Accutase, foi implementado em laboratório; como uma preparação enzimática comercialmente disponível, tem sido mostrado para fornecer resultados fiáveis ​​em cultura de células de 48. Esta solução enzimática é conhecida para separar eficazmente macrófagos de as placas de cultura sem raspagem e, mais importante ainda, sem perder antígenos de superfície 48. Esta enzima também preparado foi usado para processar a digestão de tecidos do sistema nervoso humano e animal, resultando em células isoladas viáveis ​​que permanecem sustentável por longos períodos, que permita a sua subsequente cultura 47. Além disso, esta solução enzimática preserva antigenicidade CD24 em células isoladas a partir de tecidos do sistema nervoso central 47. Quando comparado com Liberase-1, outro coquetel de colagenase e protease neutra, nem Accutase nem Liberase-1 gerar agregados de DNA livres; no entanto, é mais suave do que Accutase Liberase-1 durante a dissociação do tecido 47. A colagenase / protease co neutrocktail utilizado neste protocolo também demonstrou superioridade de tripsina na preservação do CD44, uma haste do cancro da superfície celular marcador 49. Estudos deste laboratório têm consistentemente observou que esta solução enzimática preserva antígenos de superfície do mouse leucócitos. Na verdade, as diferenças informativos foram encontrados na expressão de marcadores extracelulares em macrófagos (CD11b + F4 80 células / +), neutrófilos (células CD11b + Ly6G +), as células NKT (células CD3 + CD49b +), células T (células T CD3 +) e B (células B220 + CD19 + células), incluindo CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, e CTLA4, e na libertação de citoquinas. Portanto, o método aqui descrito é óptima para a imunofenotipagem de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal em ratinhos, como mostram os resultados representativos. Uma vantagem importante do presente método é a determinação simultânea de vários antigénios extracelulares e intracelulares, dentro da porta de viabilidade. O corante utilizado para de maisa viabilidade celular termine é iodeto de propídio (PI); no entanto, a sua utilização é limitada uma vez que só pode ser utilizada em combinação com FITC. Isso ocorre porque PI não pode ser adequadamente distinguidos da maioria dos outros fluorocromos excitados por lasers azuis e vermelhas 50. Uma solução é a utilização de DAPI a 50 ou qualquer outro corante que é excitada por lasers de UV, mas não por laser azul e vermelho comumente utilizados para imunofenotipagem. Este protocolo permite a imunofenotipagem de células viáveis, uma vez que inclui a utilização de células 50 para DAPI unfixable ou a utilização de corante de viabilidade de células fixável. Uma segunda vantagem importante do protocolo aqui descrito é que ele permite o isolamento de leucócitos com um elevado rendimento de células viáveis. Os dados representativo mostra que 70% a 89% das células isoladas são viáveis. Isto é de grande importância como este protocolo permitiu o estudo das propriedades funcionais das células isoladas a partir de tecidos murinos na interface materno-fetal. Fou exemplo, as culturas de macrófagos deciduais e uterinas e o estudo da libertação de citocina sob estimulação ter sido realizada utilizando este método. Para alcançar bons resultados, a aplicação do protocolo descrito é importante quando se considera os seguintes factores: 1) recolha de tecidos devem ser realizadas dentro de 5 a 10 min após a abertura da cavidade peritoneal, e esses tecidos devem ser colocadas em gelo para manter a viabilidade de as células isoladas; 2) homogeneização do tecido mecânica deve ser feita com tesoura de ponta fina e não pode ser superior a 2 minutos desde períodos mais longos têm demonstrado reduzir o rendimento de células viáveis; 3) A duração da incubação com a solução enzimática pode ser inferior a 1 hora uma vez que a sua actividade diminui depois de este período de tempo; 4) a temperatura de incubação com a solução enzimática deve ser mantida a 37 ° C para se obter a actividade óptima deste cocktail de enzimas; 5) Manipulação sedimento celularmento devem ser feito suavemente com micropipetas porque o uso do vórtice pode danificar a integridade das células (células isoladas são manipulação diferenciada e abrupta pode facilmente reduzir a sua viabilidade); 6) de tampão e temperaturas de centrifugação deve ser mantida à mesma temperatura como a suspensão de células; 7) As células isoladas deve ser processado para imunofenotipagem ou usado imediatamente como a sua viabilidade reduz rapidamente; e 8) ao realizar a imunofenotipagem, as amostras devem ser adquiridos usando um citômetro de fluxo imediatamente para obter melhores resultados. Uma limitação deste protocolo é o custo da solução enzimática, que é mais caro do que outras enzimas com funções semelhantes, por exemplo, tripsina, dispase II, e colagenase. No entanto, as vantagens que esta solução enzimática exibe, acima das enzimas descritas são superiores. Além de imunofenotipagem e cultura de células e triagem, as futuras aplicações deste protocolo são numerous e variada. Por exemplo, é agora possível para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro dos leucócitos (p.ex., fagocitose, citotoxicidade, proliferação de células T e ensaios de plasticidade, etc), e produção de espécies reactivas de oxigénio nos leucócitos isolados a partir de tecidos murinos na interface materno-fetal. Na verdade, a descrição de novos leucócitos e raros nos tecidos murinos na interface materno-fetal pode também ser realizada.

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) 2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna 3; Contudo, o feto não seja rejeitada 4,5. Este enigma não é totalmente compreendido. A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação 6,7 e mantido para manter uma gravidez completa 8-10. A repartição deste tolerância materno-fetal é considerado um mecanismo de doença durante os estágios precoces e tardios da gravidez 10-16. Tolerância materno-fetal envolve a participação de várias sub-populações de leucócitos, incluindo células T (células T reguladoras, células Th1, as células Th2 e células Th17), macrophages, neutrófilos, células mastro, células NK e células NKT, células dendríticas e células B, que a mudança em densidade e localização ao longo da gravidez 15,17-19. Tolerância materno-fetal é enriquecido na interface materno-fetal 20 - o local anatómico em que o sistema imune da mãe interage com os antigénios fetais 20,21. A interface materno-fetal é criado durante a placentação quando as células dos trofoblastos fetais extravilosas invadir a mucosa uterina 22-24. No lado fetal desta interface, as membranas que envolvem o feto criar uma superfície epitelial especializado dentro da placenta, e as células de trofoblasto controlar a troca de nutrientes através do seu contacto directo com o sangue materno 22. No lado materno da interface, a decídua recruta uma piscina heterogénea de leucócitos nos ratinhos que respondem por 30% a 50% de todas as células deciduais. Além de sua participação na Materntolerância imunológica al, estas células são principais contribuintes para diferentes processos durante a gravidez, por exemplo., a proteção do trato reprodutivo de infecções, fecundação, implantação do embrião 7,25, angiogênese decidual 26, remodelação vascular 24,27, a invasão do trofoblasto 28, placentária desenvolvimento 24,25, e, em última análise, o trabalho de parto 15,17. Por conseguinte, o estudo dos leucócitos envolvidas na tolerância materno-fetal é essencial para a elucidação da patogénese de complicações relacionadas com a gravidez. Embora a utilização de imuno-histoquímica e imunofluorescência gerou dados para a visualização directa e localização de uterina, decidual, ou leucócitos da placenta 29,30, análise de citometria de fluxo revelou mais subconjuntos específicos de leucócitos em cada um destes tecidos 31,32. Além disso, citometria de fluxo foi utilizada para determinar a densidade e a proporção de maternal-fetal interface de leucócitos 33 e expressão níveis de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análise citométrica de fluxo de leucócitos na interface materno-fetal requer uma suspensão de célula única. A fim de isolar leucócitos infiltrantes do decidual, útero, placenta e tecidos, dois métodos de dissociação de tecidos têm sido usados: mecânica e enzimática. Os dois métodos permitem a separação de leucócitos infiltrados a partir da matriz extracelular (ECM) desses tecidos. Dissociação enzimática tecido é superior à dissociação mecânica do tecido, uma vez que permite uma maior produção de leucócitos associada com danos-cisalhamento-força inferior a 35. Consequentemente, a dissociação do tecido mecânico exige a agregação tecidos 36, que podem aumentar a variabilidade ea heterogeneidade das amostras. No entanto, a dissociação mecânica pode ser a escolha quando o antigénio de interesse pode ser alterada por dissociação enzimática ou quando a funcionalidade da célulaS de interesse devem ser preservados (por exemplo., a citotoxicidade de células NK) 35. O uso da proteólise com enzimas específicas para degradar a ECM elimina os rendimentos baixos observados com dissociação mecânica. Vários estudos têm relatado o uso de tripsina 32, colagenase 37, DNase 31, Dispase 38, e cocktails comerciais de várias enzimas 32,39. No entanto, a natureza e concentração de enzimas diferentes e a duração da digestão deve ser cuidadosamente definida e validada, a fim de garantir a manutenção da integridade dos epitopos antigénicos de superfície celular necessárias para a imunofenotipagem. As várias estruturas de superfície são diferencialmente sensíveis à destruição por enzimas diferentes, com algumas enzimas, como a tripsina, sendo notório para a decapagem de epitopos de superfície de leucócitos reconhecidos por muitos anticorpos monoclonais. Aqui introduzido é um método que utiliza um proteolytic e coquetel enzimático colagenolítica, chamado Accutase. Esta solução enzimática é suficientemente suave enquanto ainda eficaz na distinção entre tecidos murinos na interface materno-fetal, e não requer a adição de outros reagentes ou soro de dissociação para terminar a reacção de dissociação. Além disso, ela está pronta para uso imediato e, embora o tempo de dissociação deve ser validado, é mais robusta do que as enzimas acima mencionadas 40,41. A utilização de uma combinação de ambos os tipos de desagregação do tecido melhora a qualidade e quantidade de células obtidas; assim, vários estudos têm implementado o uso combinado de dissociação mecânica e enzimática com resultados satisfatórios 31,32,37. O protocolo aqui descrito foi estabelecido e validado no nosso laboratório; utiliza uma combinação de uma dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta. Este protocolo permite o estudo de isolamento e mais deos leucócitos que se infiltram nos tecidos murinos na interface materno-fetal (útero, decidua, e placenta). O protocolo seguinte também mantém a integridade dos marcadores da superfície das células e rendimentos de células viáveis ​​suficientes para aplicações a jusante, como demonstrado por análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo mantém a consistência da preparação de células para análise e comparação dos diferentes tecidos de murino que compõem a interface materno-fetal.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Magentic Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase enzymatic solution</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse extracellular antibodies</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer solution</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td></td><td></td><td>laboratory constructed</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optical and fluorescence microscopes</td><td>Zeiss and Olympus</td><td>Zeiss LSM780 and Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis ​​(&gt; 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados ​​por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.

A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfologia dos macrófagos isolados (F4 / 80 +) recolhidas a partir dos tecidos uterinos e deciduais em 16,5 dpc utilizando separação de células magnético. Isolado macrófagos manter a capacidade de libertação de citocinas (dados não mostrados). O rendimento de células viáveis ​​isolados do decidua, útero e placenta é mostrado na Figura 3, e a viabilidade das células é superior a 70% em todos os tecidos. A Figura 4 mostra a estratégia para a análise de gating polymorphonucle<html> leucócitos AR e mononucleares dentro dos singuletos e portas de viabilidade, incluindo células T (CD45 + CD3 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), células dendríticas (CD45 + CD11c +) e células NK (CD45 + CD49b +) em 16,5 dpc. Uma elevada percentagem de macrófagos CD11c co-expresso. A Figura 5 mostra os neutrófilos, os macrófagos e células T no decidual, útero e tecidos da placenta em 16,5 dpc. A Figura 6 mostra a estratégia para a análise de linfócitos de propagação dentro dos singuletos portas e viabilidade, incluindo células T (CD3 + CD45 +) e células B (CD45 + B220 +) a 16,5 dpc. As células T incluem células T CD4 + e CD8 +. Tecidos murinos na interface materno-fetal também incluem CD3 + CD4-CD8- (células T gama-delta) em proporções elevadas. A Figura 7 mostra as células T e as células B no decidual, uterino, e tecidos da placenta em 16,5 dpc. &quot;width =&quot; 700 jpg &quot;/&gt; Figura 1. Tissue dissecção. Chifres (A) uterinos em 16,5 dpc em um rato B6. As trompas uterinas são ligados ao mesentério e vasos de drenagem. Chifres (B) uterinos dissecado do mesentério e ainda ligado ao colo do útero. chifres (C) uterinos, incluindo os locais de implantação e colo do útero. (D) Dissecção de um local de implantação. (E) A dissecção dos tecidos uterinos do local de implantação. (F) Separação da placenta e decídua do local de implantação. (G) Destacamento da decídua (camada branca-acinzentada) a partir da placenta. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" width="500" /><html> Figura 2. Os macrófagos isolados a partir de tecidos uterinos e deciduais. Os macrófagos (F4 / 80 + células) isoladas a partir dos tecidos uterinos e deciduais em 16,5 dpc utilizando separação de células magnético. Ampliação 20X. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Viabilidade de células isoladas. As células viáveis ​​(células DAPI- representadas com setas) isoladas de decidual, do útero, da placenta e tecidos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> &quot;/&gt; Figura 4. estratégia Gating para polimorfonucleares e mononucleares leucócitos. A população total de leucócitos foi fechado dentro dos interiores e portões de viabilidade. Células de células T (CD45 + CD3 +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), neutrófilos (CD45 + Ly6G +), células dendríticas (CD45 + CD11c +) e NK (CD45 + CD49b +) foram fechado dentro do porta-total de leucócitos ( CD45 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg" width="600" /> As células Figura 5. Os neutrófilos, macrófagos, e células T em tecidos murinos na interface materno-fetal. Os neutrófilos (CD45 + Ly6G +), macrófagos (CD45 + F4 / 80 +), e T (CD45 + CD3 +) foram fechado dentro da viabilidade e portões em decidual isolado, uterina, e células da placenta total de leucócitos-(CD45 +).TPS: &quot;target =&quot; _ blank //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. estratégia gating para linfócitos. Mononucleares foram fechado dentro dos singuletos e portas de viabilidade. Células T (CD3 +) e células B (B220 +) foi fechado dentro do portão viabilidade. As células T CD4 + e CD8 + T foram fechado dentro do portão de células T (CD3 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7. sub-populações de linfócitos em tecidos de murino na interface materno-fetal. Células T (CD3 +)e células B (B220 +) foi fechado dentro do portão viabilidade em decidual isolado, uterino, e células placentárias. As células T CD4 + e CD8 + T foram fechado dentro do portão de células T (CD3 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Marcador celular </td><td> Fluorochrome </td><td> Clone </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> AO VIVO / MORTO </td><td> DAPI </td><td> - </td><td> Life Technologies </td><td> L23105 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> V450 </td><td> 30-F11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560501 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> FITC </td><td> 145-2C11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553062 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> APC </td><td> RM4-5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553051 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> PE-CF594 </td><td> 53-6,7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 562283 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> APC-Cy7 </td><td> RA3-6B2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 552094 </td></tr><tr><td> F4 / 80 </td><td> PE </td><td> BM8 </td><td> eBiosciences </td><td> 12-4801-82 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> APC-Cy7 </td><td> 1A8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560600 </td></tr><tr><td> CD49b </td><td> APC </td><td> DX5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560628 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> PE-Cy7 </td><td> HL3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 558079 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de anticorpos utilizado para leucócitos subconjunto imunofenotipagem

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Medicina

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento de células imunes e não imunes de pulmões de camundongos para citometria de fluxo

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Resumo

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Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

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Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo