Name: a surgical procedure for resecting the mouse rib: a model for large-scale long bone repair
Uploaded: 2015-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair at JoVE.com

We thank members of the Mariani lab for critical reading of the manuscript. Our funding sources were: the Baxter Medical Scholar Research Fellowship (to M.K.S.), USC undergraduate fellowships and the Provost, Dean Joan M. Schaeffer, and Rose Hills Fellowships, (to M.K.S.). We also acknowledge a CIRM BRIDGES fellowship through Pasadena City College (to T.T.T). and the James H. Zumberge Research and Innovation Fund, the USC Regenerative Medicine Initiative, and the NIAMS NIH under Award Number R21AR064462 (to F.V.M).

NOTA: Todos os procedimentos estão em conformidade com um protocolo de animais aprovado pelo cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. 1. Preparação para a cirurgia <ol><li> Separe as ferramentas e suprimentos cirúrgicos necessários (esterilizado, itens 1-18 na lista de materiais) e organizar um microscópio de dissecação e uma fibra óptica trans-iluminador em uma capa ou em uma mesa de corrente descendente. </li><li> Coloque um rato sexualmente maduros (20-30 g, 1-3 meses de idade) em uma câmara de indução com 4% de isoflurano para induzir a anestesia. </li><li> Confirme a anestesia com uma pata e / ou teste de cauda pitada. </li><li> Aplicar pomada para os olhos do rato para evitar o ressecamento do olho durante a cirurgia. </li><li> Mova o rato para o estágio do microscópio. Posicione o mouse para dentro do cone do nariz da mangueira de manutenção e posicionar lateralmente. Proporcionar uma bolsa de aquecimento adjacente ao animal para ajudar a manter a temperatura corporal. NÃOE:. Posição do rato é dependente de preferência pessoal e / ou destreza manual do cirurgião, do lado esquerdo ou direito está bem. </li><li> Ajuste isoflurano a 2 - 3% para manutenção, e assistir a freqüência respiratória. </li><li> Injectar buprenorfina (0,05 mg / kg) subcutaneamente (flanco lateral da perna) para a dor pós-operatória com uma agulha 25 G. A perna pode contorcer-se que é uma resposta normal. </li></ol> Incision 2. Abertura <ol><li> Detectar a costela desejado por palpação, e limpar a área de cabelo com uma máquina de barbear. NOTA: Reforços 8-10 são recomendados desde costelas 1-7 estão mais próximos dos pulmões e 11-13 são consideravelmente mais curto. Contando as costelas deve começar com a costela mais rostral como número 1. </li><li> Preparar a área alternando com povidona-iodo e de isopropanol (70%) raspagem (3x é frequentemente recomendada pelos protocolos de utilização de animais). </li><li> Corte de 2 cm da incisão através da pele, directamente por cima e paralela à nervura desejado com uma tesoura de microcirurgia e média dimensão. IncÉe através das camadas musculares e adiposas subjacentes. </li><li> Coloque todos os três camadas (pele, músculo, gordura) em um retractor para expor o local cirúrgico, minimizando o tamanho da incisão. </li></ol> 3. excisão do Rib <ol><li> Corte através dos músculos intercostais que recobrem a seção desejada da costela com um bisturi 5,0 milímetros. Posição esta incisão de cerca de 5 mm proximal à articulação do condrocostais como este é onde a costela não é tão altamente curvado. Separe cuidadosamente o músculo do osso com uma pinça de ponta fina. </li><li> Para criar uma ressecção, mantendo o periósteo no animal, por meio de corte do periósteo, ao longo do comprimento da nervura com um bisturi 5,0 milímetros. Separe cuidadosamente o periósteo do osso subjacente lateralmente com uma pinça de ponta fina. Proceda com cuidado, como o periósteo é muito delicada e tem uma consistência gelatinosa. </li><li> Em seguida, faça um corte transversal através do osso numa extremidade com micro-tesouras finas. Se necessário, medir a ressecção comum retículo no microscópio ou um medidor tipo régua. Em seguida, levantar cuidadosamente o osso para fora do periósteo e cortar na outra extremidade. NOTA: Proceda com cuidado. Esta é a etapa mais delicada, como puxar para cima sem excisão do costela abaixo vai rasgar a membrana pleural e resultar em um pneumotórax. Se a membrana pleural é rasgada este será facilmente evidente como o interior da cavidade torácica, tornam-se visíveis. </li><li> Se o sangramento ocorre como um resultado de corte do osso, aplicar pressão na extremidade de corte com um cotonete para 4-5 segundos para parar a hemorragia. NOTA: Nas raras ocasiões em que o sangramento continua, pode ser necessário parar e sacrificar o animal a perda de sangue tão significativa comprometerá recuperação (sem reposição de líquidos, o volume máximo de sangue que pode ser seguramente ser perdido é de 10% do volume total de sangue ou 7.7 -. 8 mL / g para 25 g um rato, isso é equivalente a cerca de 180-200 mL 9). </li><li> Colocar imediatamente a nervura removido emPFA 4% para análise futura. NOTA: Se a ressecção de ambos os ossos e do periósteo é para ser realizada, omitir o periósteo incisão e separação (passo 3.2). Desde o periósteo é muito bem ligado à membrana pleural proceder com cautela, provocando a costela longe da membrana pleural com uma pinça para evitar rasgos. </li></ol> 4. fechar a incisão <ol><li> Suturar os músculos intercostais ao longo do topo da manga periosteal remanescente com 9-0 suturas (2 suturas são geralmente suficiente). Coloque as suturas diretamente acima das extremidades cortadas do costela, para atuar como indicadores para o local da cirurgia. </li><li> Remover o afastador. Suturar o músculo e gordura sobreposta com 9-0 suturas (3-4 suturas são normalmente suficientes). Em ratinhos com camadas particularmente espessas de músculo e / ou a gordura, suturar cada camada em separado (por exemplo, uma camada de fios de sutura para a camada muscular e uma camada de suturas para a camada de gordura). </li><li> Feche opele com 7-0 (4-5 suturas são normalmente suficientes). </li><li> Fixe a incisão com cola de sutura, apertando as bordas junto com grandes fórceps. </li><li> Lentamente desmamar o mouse para fora isoflurano ajustando primeiro a 1% por alguns minutos e, em seguida, desligue. </li><li> Posicione o mouse sob uma lâmpada de fogo e deixe até que a consciência é recuperada, 5 - 10 min. Depois de consciência é recuperada e durante todo o período de cicatrização, o rato deve mover-se e deambular normalmente e não mostram sinais de angústia. </li></ol> 5. Recuperação e Análise <ol><li> Fornecer o manejo da dor pós-operatória, incluindo a administração de buprenorfina de forma oral de gelatina a 0,5 mg / kg a cada 12 horas para 48 horas. A administração oral não necessita de prender o animal que pode causar dor na região torácica. </li><li> Manter o rato em uma gaiola com livre acesso a comida e água durante o período de cicatrização. Após a incisão é seca, as fêmeas podem ser co-macho alojados enquantos deve permanecer isolada para evitar lutas. </li><li> Após o período de cicatrização, siga o procedimento aprovado para a eutanásia. Retire a caixa torácica para fixação e análise. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Quando aprendendo este protocolo, determinando onde localizar a incisão inicial pode ser um desafio. No entanto, a prática em ratos sacrificados ajuda o cirurgião saber onde colocar a incisão inicial e expor a costela desejado a ser ressecado. Trabalhando em cadáveres também melhora as habilidades motoras fine-necessárias para remover a porção de costela com ou sem o periósteo. Além disso, alguém novo para este procedimento pode encontrar manipular as ferramentas finas e suturas finas para ser difícil. Enquanto amarração, o excesso de puxar a sutura pode rasgar os tecidos. Assim, de alguma prática de sutura também em cadáveres poderia ser útil. Finalmente, se o cirurgião é novo para procedimentos cirúrgicos com roedores, pode ser útil ter uma outra pessoa contribuir para a monitorização e ajuste da anestesia durante as primeiras cirurgias. A etapa mais importante deste protocolo é extirpar o osso sem induzir um pneumotórax (um acúmulo anormal de ar no spa pleuralce), que é difícil de tratar no rato uma vez que a membrana pleural é demasiado fina para fechar cirurgicamente. A camada de músculo e pleura parietal inferior ao da nervura é muito fina e delicada; Assim, movimentos precisos são necessários para evitar uma punção na membrana pleural, que se situa abaixo da área de ressecção. Isso ocorre mais comumente nos passos 3.1 e 3.3. No passo 3.1 (separando o osso dos músculos intercostais circundantes), o bisturi afiado e fórceps facilmente perfurar a camada pleural se o ponto não é mantido superficial. No passo 3.3 (excisão do osso com micro-tesouras finas), a colocação da tesoura sob o osso pode superar a resistência à tracção da membrana pleural, ou a acção de quebrar o osso pode causar a extremidade do fragmento de osso para perfurar a membrana pleural. Nós descobrimos que a utilização de micro-tesouras finas que têm uma ponta curvada é benéfico. Além disso, como acima, pode também ser útil para a prática do protocolo primeiro em ratinhos submetidos a eutanásia. Ultidamente, no entanto, descobrimos que este problema pode ser facilmente superados com paciência e prática. Embora a nervura é um osso endocondral, pode haver algumas diferenças potencialmente importantes entre o esqueleto de reforço e os ossos longos do esqueleto apendicular. Do ponto de vista embriológico, o esqueleto nervura é derivado a partir de um compartimento diferente mesodérmica (somitos) do que o esqueleto apendicular (lateral mesoderme) 12. Assim, é possível que existam propriedades que são exclusivas para as costelas do esqueleto progenitores que refletem essa diferença na história do desenvolvimento. Por isso, no longo prazo, pode ser necessário para determinar o que estas propriedades únicas são e, em seguida, usar essas informações para incentivar os progenitores no esqueleto do membro para mediar o reparo com a mesma facilidade como visto na costela. Outro aspecto que entra em jogo diz respeito à localização das nervuras em relação ao sistema respiratório. Alembora as costelas de acompanhamento proporcionar estabilidade suficiente à volta da ressecção tal que nenhum fixador externo é necessário, a zona de reparação está em constante movimento e tensão de pulmão inflação / deflação. Tem sido reconhecido que, durante a reparação óssea, muito movimento pode ser inibitória para a cura, enquanto algum movimento parece ser importante para a geração de um intermediário de cartilagem 13,14. Neste momento, não é claro, no entanto, é possível que a formação de um intermediário de cartilagem pode ser um passo-chave para a reparação eficaz em grande escala. Assim, o movimento das nervuras durante a respiração pode facilitar a reparação (quando o periósteo é deixado para trás no animal). Uma vez que o movimento pode ser particularmente importante no presente contexto, o desenvolvimento de um método para colocar um fixador pode ser útil para estudar as influências biomecânicas em reparação no futuro. Através da realização de um teste de reparação costela no rato, pode-se tirar proveito de poderosas ferramentas genéticas que foram desenvolvido. Por exemplo, usando marcas transgénicos, a origem das células de reparação pode ser avaliada. Repórteres transgénicos para a formação de osso (novas ferramentas interessantes no desenvolvimento de Gazit et ai. 15,16), o processo endocondral, e a leitura dos importantes vias de transdução de sinal pode ser utilizada 12,17. Além disso, os ratinhos portadores de alelos de perda de função pode ser usada para determinar as vias de sinalização necessárias. Actualmente, nenhum outro modelo de organismo vertebrado permite uma grande variedade de técnicas genéticas, para sondar a biologia subjacente básico deste processo. Além disso, enquanto outros modelos excelentes para a reparação óssea foram desenvolvidos e estão em uso há algum tempo, um outro contexto para testar andaimes, compostos, e as terapias celulares, considerando as características de reparação costela pode ser benéfica. O estabelecimento de um modelo de reparação costela padrão complementa modelos existentes como as costelas não são obrigados a suportar o corpo e reparaçãoocorre sem estabilização. Além disso, a contribuição do periósteo a reparação pode ser facilmente avaliada. Futhermore, porque a nervura tem tanto cartilagem e segmentos ósseos, as comparações entre a cura destes tipos de tecidos diferentes, mas relacionadas, podem identificar uma característica comum de reparação eficaz 18.

Debilitante lesão esquelética, artrose crônica, e os graves problemas associados com a cirurgia reconstrutiva impactar a produtividade econômica, o bem-estar da família e qualidade de vida. Enquanto pequenas pausas e lesões podem curar razoavelmente bem, os seres humanos não são capazes de reparar defeitos grandes e, portanto, deve contar com procedimentos reconstrutivos para restaurar a estrutura e função. Reconstrução pode envolver transplante alogênico ou heterogeneic, osso morcellized, andaimes implantados, ou distração osteogênica. Infelizmente, não só existem fatores de morbidade persistentes associados a esses tratamentos, mas a força original do osso reparado é raramente alcançada. Assim, são necessárias novas abordagens clínicas. One-way para desenvolver métodos inovadores para o tratamento de defeitos segmentares é estudar as situações em que o reparo em grande escala ocorre naturalmente. Anfíbios famosa pode regenerar elementos esqueléticos, enquanto os mamíferos são considerados limitados em thé a capacidade. No entanto, desde o início do século 20, alguns relatos de regeneração na costela humana foram publicados sugerindo que os humanos não podem ser tão limitado 1-4. Atualmente este fenômeno é mais conhecido por cirurgiões plásticos que utilizam material de costela para queixo, rosto e orelha de reconstrução, mas não é mais amplamente apreciada 5. Para estudar este reparo em mais detalhes, nós desenvolvemos um modelo cirúrgico usando o mouse. Usando este protocolo, os pesquisadores podem identificar os fatores inatos envolvidos e usar essa informação para facilitar a cicatrização óssea em outras localidades. Há muitas vantagens em usar as costelas como um modelo para o estudo de reparação óssea. Em primeiro lugar, as nervuras circundantes proporcionar um fixador naturais (como comparado a ressecção do fémur 6,7). Isso diminui o risco de morbidade de fixadores internos e externos e simplifica o procedimento cirúrgico. Em segundo lugar, as camadas musculares finas dos wa peitovai fornecer para fácil acesso e excelente visibilidade que fazer o ensaio comparável à conveniência de ressecções calota craniana 8. Em terceiro lugar, em contraste com a calvárias que formam por ossificação intramembranosa, a forma de nervuras ossificação endocondral e crescer em comprimento por meio de extensão em placas de crescimento localizadas em cada extremidade de uma diáfise central. Portanto, a reparação das costelas pode ser mais comparável ao reparo dos ossos longos do esqueleto apendicular. Além disso, verificou-se que em comparação com o fémur, no periósteo da nervura é mais espessa e pode ser mais facilmente manipulado. Assim, os investigadores que desejam para ensaiar a reparação óssea com a finalidade de estudar o periósteo ou testar terapias celulares, agentes farmacológicos, e / ou suportes de tecido podem encontrar este modelo cirúrgico útil. Em resumo, este modelo de ressecção de costela fornece um contexto no qual a estudar reparação óssea em grande escala natural em mamíferos como existe tal modelo em uso geral existe atualmente.

<table><tbody><tr><td>Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-T&amp;uuml;bingen Spring Scissors 5 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td>curved tip is beneficial</td></tr><tr><td>Micro-scalpel 5.0 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td>other fine scalpels can be substituted</td></tr><tr><td>Dumont 55 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Retractor&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>17004-05</td><td>adjustability is convenient</td></tr><tr><td>Micro-needle holders</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best</td><td>Ethicon</td><td>2819G or similar</td><td>taper point best but reverse cutting is also good</td></tr><tr><td>7.0 prolene sutures (Prolene)</td><td>Ethicon</td><td>8700H or similar</td><td>6-0 can be used too, needle point can vary</td></tr><tr><td>Large forceps (Adson Forceps)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td>other brands are fine</td></tr><tr><td>Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)</td><td>Abbot</td><td>32046-01</td><td>has excellent working time</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Wahl</td><td>9918-6171 or similar</td><td></td></tr><tr><td>Clamp lamp</td><td>Zoo Med</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Infrared Bulb, 75W</td><td>Zoo Med</td><td>RS-75</td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rodent Anesthesia System</td><td>VetEquip&amp;nbsp;</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbot</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick</td><td>67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Flavored Gelatin, raspberry</td><td>Jell-O</td><td>B000E1FYL0</td><td>made up firm, to the consistency of &#039;jigglers&#039;</td></tr></tbody></table>

a surgical procedure for resecting the mouse rib: a model for large-scale long bone repair

Este protocolo introduz investigadores para um novo modelo de grande escala reparação óssea utilizando a costela mouse. O procedimento detalha o seguinte: preparação do animal para a cirurgia, a abertura da parede torácica corpo, expondo a costela desejado a partir dos músculos intercostais circundantes, extirpando a seção desejada da costela sem induzir um pneumotórax, e fechar as incisões. Em comparação com os ossos do esqueleto apendicular, as nervuras são altamente acessível. Além disso, não fixador interno ou externo é necessário uma vez que as nervuras adjacentes proporcionam uma fixação natural. A cirurgia utiliza comercialmente fornecimentos disponíveis, é fácil de aprender, e bem tolerado pelo animal. O procedimento pode ser realizado com ou sem a remoção do periósteo circundante, e, por conseguinte, a contribuição do periósteo ao reparo pode ser avaliada. Os resultados indicam que, se o periósteo é retida, reparação robusta ocorre em 1-2 meses. Esperamos que o uso deste protocoloestimular a pesquisa em reparação de costela e que os resultados irão facilitar o desenvolvimento de novas formas de estimular a reparação óssea em outras localidades ao redor do corpo.

Animais tipicamente recuperar rapidamente a partir deste procedimento, a incisão cura bem, e os animais exibem comportamento normal. O procedimento utiliza fontes comercialmente disponíveis e após a prática, pode ser concluído em menos de 1 hora. Antes de usar este procedimento para gerar os dados experimentais, é importante analisar a ressecção no dia 0 ponto de tempo para determinar se os fragmentos de ossos grandes pode permanecer na zona de ressecção. Uma forma de avaliar o procedimento adequado é avaliar os animais por raios-X ou imagem microCT no pós-operatório, embora isso tipicamente requer autorizações especiais de segurança radiológica. Em vez disso, outra avaliação simples pode ser concluído através da realização de uma preparação coloração esquelético, como ilustrado na Figura 1A. Isso envolve a coleta de caixa torácica, fixando-a em EtOH, e coloração com vermelho de alizarina usando um protocolo padrão de 11. Pode ser útil para omitir o hidróxido de potássio (utilizado para digerir longe dos tecidos moles), de modo that ainda a amostra pode ser utilizada depois para análise histológica, se assim for desejado. A amostra ainda pode ser visualizado sem os passos de hidróxido de potássio, limpando em glicerol a 80% porque a camada muscular da parede do corpo sobrejacente é fina. Ou, alternativamente, estes músculos pode ser removido manualmente antes da fixação / coloração como é mostrado (Figura 1A). A porção de osso removido também podem ser analisados. Se o objectivo era manter o periósteo no animal, a porção de osso deve ter uma superfície lisa como visualizado por microscopia óptica e análise histológica (Figura 1B, B &#39;). Uma porção de osso removido com o periósteo deve ter uma superfície irregular e distintamente mediante exame histológico tem uma camada de periósteo sobrejacente intacto, que tem as características de um tecido conjuntivo irregular denso (Figura 1C, C &#39;). Dependendo do objectivo do ensaio, a cura pode seravaliada em diferentes pontos de tempo. As observações indicam que 3 mm em que as ressecções do periósteo é retida no animal tipicamente curar completamente dentro de 1 - 2 meses. Reparação ocorre através da formação de um calo mole e duro, e de remodelação. Um exemplo de reparação completa em 2 meses é mostrado na Figura 2A, A &#39;; reparação pode ser avaliada pela preparação do esqueleto (Figura 2A) e análise histológica (Figura 2A). Se o periósteo também é removido, a abertura ressecção nunca é preenchida. A Figura 2B mostra um exemplo em que alguma reparação ocorreu em uma extremidade, no entanto, é mais típico observar extremidades cegas. Após a análise histológica, a zona de ressecção é preenchido com adiposo, tecido de granulação, e músculo (Figura 2B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52375/52375fig1highres.jpg" width="600" /> <strong&gt; Imagens Figura 1. Exemplo de ressecções no dia 0. (A) Ilustração de uma ressecção de costela (4.5 mm) recolhidos imediatamente após a cirurgia. Não há fragmentos de ossos são deixados para trás. A amostra foi corada com vermelho de alizarina (utilizando um protocolo padrão, mas omitindo quaisquer passos com hidróxido de potássio para preservar a amostra para futura análise histológica) e aclarado em 80% de glicerol. As setas indicam a localização das extremidades cortadas. (B) porção de costela Removido da caixa torácica representado na (A) sem o periósteo anexado. (B &#39;) Corte histológico mostrando periósteo mínimo fixados ao osso (setas amarelas, à esquerda) e sem periósteo para a direita (seção transversal, coradas com HE). O asterisco indica o amarelo cavidade da medula óssea. Rato costelas não tem extensa trabeculae. (C) porção de costela Removido mostrando o periósteo ainda ligado. (C &#39;) histológica seção shoasa do periósteo intacto que recobre o osso indicado por uma faixa amarela (seção longitudinal, corado com HE). Um asterisco amarelo indica a cavidade da medula óssea. Barras de escala: A, B, C = 1 mm; B &#39;, C&#39; = 100 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52375/52375fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52375/52375fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. reparação Rib pós-cura em ressecções com e sem o periósteo. (A) a preparação do esqueleto seguinte ~ 2 meses de cicatrização após a ressecção, mantendo intacto o periósteo no interior do rato (preparado tal como na Figura 1A). Correção total da região podem ser observadas. Corte histológico de B mostrando uma restauração das paredes e do osso lamelar (A &#39;)cavidade da medula óssea (hematoxilina e eosina). (B) a preparação Skeletal (alizarin vermelhos) após ~ 3 meses de cicatrização após a remoção de ambos uma porção de costela e do periósteo circundante. Houve apenas reparação mínima na extremidade de corte mostrado no lado esquerdo do painel. A ponta de seta amarela aponta para a articulação condrocostais. (B &#39;) Corte histológico de B mostrando tecido de granulação, adiposo e células musculares de enchimento no local da ressecção (HE). Barras de escala: A, B = 1 mm; B &#39;= 500 mm; C &#39;= 200 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52375/52375fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Um procedimento cirúrgico para ressecção do mouse Rib: Um Modelo de Grande Escala Repair longo osso

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

a-surgical-procedure-for-resecting-mouse-rib-model-for-large-scale

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K visualizações.  Keck School of Medicine, University of Southern California. The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Vídeo: A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the following three phases: the latency phase after osteotomy and placement of the external distractor; the distraction phase, wherein the separated bone ends are gradually and continuously distracted; and the consolidation phase. This custom-made distractor used for DO is comprised of two incomplete acrylic resin rings and an expansion screw. The process was initiated by making a mold with silicone impression material and then creating the custom-made distractor. Dental resin was poured into the formwork made of silicone impression material, and it was allowed to polymerize to create the incomplete resin rings required for the custom-made distractor. These rings were fixed with an expansion screw using transparent resin. The custom-made distractor created via this approach was attached to the tibia of mice. The tibia was fixed to the device using one pair of 25 G needles proximally, one pair of 27 G needles distally, and acrylic resin. After a latency period of 5 days, distraction was initiated at a rate of 0.2 mm/12 h. The lengthening was continued for 8 days, resulting in a total gap of 3.2 mm. The mice were sacrificed 4 weeks after distraction. Bone formation in the distraction gap was confirmed using both radiography and histology.

We present a mouse tibial distraction osteogenesis model developed using a custom-made distractor. The use of a mouse as an analysis target is advantageous for advancing research.

Um modelo de osteogênese de distração do rato

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

Biologia do Desenvolvimento

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Medicina

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and significantly diminish the outcome. Indeed, after routine orthopedic surgery to repair a fracture, as many as 50% of elderly patients suffer from neurologic complications like delirium. Also, the capacity to heal and regenerate tissue after surgery decreases with age, and can impact the quality of fracture repair and even osseous integration of implants. Thus, a better understanding of mechanisms that drive these age-dependent changes could provide strategic targets to minimize risk for such complications and optimize outcomes. Here, we introduce a clinically relevant mouse model of tibial fracture. The postoperative changes in these mice mimic some of the cognitive impairments commonly observed after routine orthopedic surgery in humans. Briefly, an incision is performed in the right hind limb under strictly aseptic conditions. Muscles are disassociated, and a 0.38-mm stainless steel pin is inserted into the upper crest of the tibia, inside the intramedullary canal. Osteotomy is then performed, and the wound is stapled. We have used this model to investigate the effects of surgical trauma on postoperative neuroinflammation and behavioral changes. By applying this fracture model in combination with parabiosis, a surgical model in which 2 mice are anastomosed, we have studied cells and secreted factors that systemically rejuvenate organ function and tissue regeneration after injury. By following our step-by-step protocol, these models can be reproduced with high fidelity, and can be adapted to interrogate many biologic pathways that are altered by surgical trauma.

This protocol describes a mouse model of orthopedic surgery that has been used to study mechanisms of postoperative neuroinflammation and behavioral changes, and when combined with parabiosis, to study tissue regeneration during aging.

Um modelo do rato de cirurgia ortopédica para estudar a disfunção cognitiva pós-operatória e regeneração de tecidos

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Transverse Fracture of the Mouse Femur with Stabilizing Pin

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test whether a gene, gene product or drug influences bone repair because murine bones recapitulate the stages observed during human fracture healing. When a mouse or human breaks a bone, an inflammatory response is initiated, and the periosteum, a stem cell niche surrounding the bone itself, is activated and expands. Cells residing in the periosteum then differentiate to form a vascularized soft callus. The transition from the soft callus to a hard callus occurs as the recruited skeletal progenitor cells differentiate into mineralizing cells, and the bridging of the fractured ends results in the bone union. The mineralized callus then undergoes remodeling to restore the original shape and structure of the healed bone. Fracture healing has been studied in mice using various injury models. Still, the best way to recapitulate this entire biological process is to break through the cross-section of a long bone that encompasses both cortices. This protocol describes how a stabilized, transverse femur fracture can be safely performed to assess healing in adult mice. A surgical protocol including detailed harvesting and imaging techniques to characterize the different stages of fracture healing is also provided.

This protocol describes a method to perform fractures on adult mice and monitor the healing process.

Fratura transversa do fêmur do rato com pino estabilizador

Fracture repair is an essential function of the skeleton that cannot be reliably modeled in vitro. A mouse injury model is an efficient approach to test ...

Biologia

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

Estabelecimento de um Modelo de Fratura Diafisária do Fêmur em Camundongos

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...

Visualização 3D da Remodelação Óssea Sob Carga de Tração em Camundongos Expansores de Sutura

A 3-D Visualization Technique for Bone Remodeling in a Suture Expansion Mouse Model

Craniofacial sutures play a crucial role beyond being fibrous joints connecting craniofacial bones; they also serve as the primary niche for calvarial and facial bone growth, housing mesenchymal stem cells and osteoprogenitors. As most craniofacial bones develop through intramembranous ossification, the sutures' marginal regions act as initiation points. Due to this significance, these sutures have become intriguing targets in orthopedic therapies like spring-assisted cranial vault expansion, rapid maxillary expansion, and maxillary protraction. Under orthopedic tracing force, suture stem cells are rapidly activated, becoming a dynamic source for bone remodeling during expansion. Despite their importance, the physiological changes during bone remodeling periods remain poorly understood. Traditional sectioning methods, primarily in the sagittal direction, do not capture the comprehensive changes occurring throughout the entire suture. This study established a standard mouse model for sagittal suture expansion. To fully visualize bone remodeling changes post-suture expansion, the PEGASOS tissue clearing method was combined with whole-mount EdU staining and calcium chelating double labeling. This allowed the visualization of highly proliferating cells and new bone formation across the entire calvarial bones following expansion. This protocol offers a standardized suture expansion mouse model and a 3-D visualization method, shedding light on the mechanobiological changes in sutures and bone remodeling under tensile force loading.

Autor em destaque: Técnica de limpeza de tecidos PEGASOS para visualizar a remodelação óssea 

This protocol presents a standardized suture expansion mouse model and a 3-D visualization method to study the mechanobiological changes of the suture and bone remodeling under tensile force loading.

Técnica de visualização 3D para remodelação óssea em modelo de sutura em camundongo expansor

Craniofacial sutures play a crucial role beyond being fibrous joints connecting craniofacial bones; they also serve as the primary niche for calvarial and ...