Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

Agradecemos todo o laboratório Koshy para discussões úteis. Agradecemos Patty Jansma e da Universidade do Arizona Departamento de Neurociência para aconselhamento e ajuda com as imagens. Agradecemos também o laboratório Porreca para o uso de sua Vibratome. Esta pesquisa foi apoiada pela National Institutes os EUA de Saúde (NIH NS065116, AAK).

NOTA: Os ratos foram criados e mantidos em uma sala com temperatura controlada e umidade com 12 hr inverteu ciclos claro / escuro com comida e água disponível ad libitum na Universidade de Arizona. Os experimentos foram conduzidos sob as diretrizes e aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade do Arizona animal Institucional. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Os ratinhos Cre-repórter são em murganhos C57BL / 6 de fundo 11 e estão disponíveis comercialmente. 1. Rato Infection NOTA: O método de infecção com Toxoplasma gondii rato descrito abaixo foi usado em estudos anteriormente publicados 10-12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Crescer estirpes Toxoplasma em fibroblastos de prepúcio humano (HFFS) cultivadas em Dulbecco Modificado Alto Teor de Glucose Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM de L-glutamina (cDMEM) em um balão T-25 no interior de um 5% de CO2 até parasitas formaram grandes vacúolos parasitóforos. </li><li> Parasitas de libertação seringa por raspagem células a partir do fundo do balão e passar a solução resultante através de uma agulha de calibre 25 ligada a uma seringa de 3 ml de 2 vezes no interior do frasco, em seguida, transferir toda a solução a uma seringa de 5 ml caso ligado a uma agulha de calibre 27 que foi colocado de cabeça para baixo dentro de um tubo cônico de 15 ml. Conecte o êmbolo para a seringa e passar a solução parasita dentro do tubo cônico. </li><li> Centrifugar o tubo durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante em seguida, voltar a suspender o sedimento em 4-6 ml estéril de grau USP 1x salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (solução mãe). </li><li> Coloque um hemocitômetro com 10 ml de solução de estoque, aguarde 5-10 min para os parasitas de se contentar em seguida, contar o número de parasitas nos quatro cantos e centro de praças da quadrado do meio grande. </li><li> Diluir Parásites para tamanho do inóculo apropriado de 100K / 200 mL 1x PBS, em seguida, injetar camundongos por via intraperitoneal (ip) com um volume total de 200 mL. NOTA: Para este procedimento, os ratos foram inoculados com 100K Tipo III (CEP) 13 taquizoítos em 200 mL 1x PBS. Ao infectar ratinhos com outras linhagens de Toxoplasma, a concentração do inoculo pode necessitar de ser ajustado para ter em conta nível de virulência. </li></ol> 2. Perfusão e colheita Cérebro NOTA: Este protocolo foi realizado aos 21 dias pós infecção (dpi), pois isso representa o ponto de tempo em que os números de cistos de pico são encontradas no cérebro de rato, mas outros pontos de tempo pode ser utilizado. Tamanho, número, localização e presença ou ausência de cistos depende de muitos fatores, incluindo a estirpe do mouse, tipo cepa do parasita, bem como tamanho do inóculo 7,14 - 17. Os investigadores deverão determinar individualmente o inóculo apropriado para o mouse e Toxoplasma estirpe ele / ela usa. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Configuração todas as ferramentas de coleta cirúrgica (Figura 1). </li><li> Para cada rato, preparar e manter em gelo: seringa de 20 ml cheia com 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) + 10 U / ml Heparina em 1x grau USP estéril PBS (Heparina / Saline); Seringa de 20 ml cheia com 4% de paraformaldeído (PFA); Frasco de cintilação com 15 ml de 4% de PFA. Para vários mouses, prepare um copo cheio com o valor total de cada solução necessária para todos os ratos, em seguida, elaborar uma seringa fresco cheio de solução para cada perfusão. </li><li> Anestesiar o ratinho ip com 200 ul / 25 g de peso corporal de ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml, respectivamente) no dia de interesse. Monitorar o mouse para o nível de anestesia, verificando toe pitada reflexo. Continue com o protocolo apenas uma vez o mouse mostra nenhuma resposta a uma pitada dedo do pé firme. NOTA: Outros métodos de anestesia pode ser usado, desde que o nível adequado de anestesia for atingido antesprosseguir com o protocolo. </li><li> Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre a plataforma de espuma coberta. Pin todos os quatro membros para fora aos pés, em seguida, pulverizar o tórax e abdome, com 70% de etanol (EtOH) (Figura 2A). A adição de várias toalhas de papel estéreis sob o rato pode ser utilizado para ajudar a absorver o excesso de fluidos de perfusão. </li><li> Levante a pele logo abaixo do esterno com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para fazer uma incisão. Puxe a pele de volta para expor o tórax (Figura 2B). </li><li> Elevador processo xifóide e fazer uma incisão abdominal logo abaixo do diafragma, expor o fígado, que está francamente dissecada para longe do diafragma. Adicione duas incisões, uma do lado esquerdo e uma do lado direito através do diafragma e a parte inferior das costelas. Estender as incisões direita e esquerda a cerca de 1 / 2-2 / 3 forma-se a caixa torácica, o qual é então reflectida para trás para abrir a cavidade torácica (Figura 2C). NOTA: Tenha cuidado para não cortar quaisquer órgãos ou vasos sanguíneos principais dutocar esse procedimento pois isso irá comprometer a qualidade da perfusão. </li><li> Perfundir transcardíaca com 10-20 ml de heparina / solução salina seguido por 10-20 ml PFA a 4%. NOTA: Se a perfusão for feito corretamente, o fígado vai mudar de vermelho para bronzear (Figura 2D). Se não for feito corretamente, os vasos sanguíneos será visível (Figura 2E). </li><li> Vire o mouse sobre seu abdômen, pés re-pin em seguida, pulverizar cabeça e pescoço com etanol 70%. Elevador de pele a partir da base do pescoço e fazer uma incisão. Remova a pele para expor o crânio (Figura 2F). Decapitar cabeça ao nível dos ombros. Remover o crânio, remover suavemente o cérebro, e colocá-lo dentro de um frasco de cintilação preenchido com PFA a 4% (Figura 2G-H). NOTA: Se bem perfundidos, o cérebro vai aparecer branco, sem vasos sanguíneos visíveis (Figura 2?). Se o cérebro não está bem perfundido, vasos sanguíneos será visível (Figura 2J). </li><li> Coloque a centelhação frasco com cérebro em PFA a 4% a 4 ° C durante a noite, coberto de luz. Lavar o cérebro em USP não grau 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação de novo preenchido com refrigeradas 1x PBS. Armazenar o cérebro em 1x PBS a 4 ° C, cobertas de luz. NOTA: clearing de sucesso e de imagem foi realizado com seções armazenados em 1x PBS por até um mês, mas o melhor é a seção do cérebro dentro de alguns dias como o armazenamento prolongado em PBS irá inverter a fixação PFA e poderia levar a menos do que as imagens mais favoráveis . A autofluorescência e aumentou borrão foram observados em algumas secções fotografadas após armazenamento em 1x PBS, durante um mês ou mais. </li></ol> 3. Cérebro Seccionamento <ol style="margin-left: 40px;"><li> Remover o cérebro de 1x PBS e colocá-lo numa matriz cerebral (Figura 3A) para permitir mais preciso e uniforme corta através do cérebro. Aparar o cerebelo e olfativos lâmpadas, se presente, e depois cortar o cérebro coronally em 2 ou 3 seções. <br /&gt; NOTA: aparar e de corte do cérebro pode ser feita sem o auxílio de uma matriz cerebral. Número de secções cortadas coronalmente dependerá da distância do corte do Vibratome sendo usado. O cérebro pode ser seccionado em qualquer orientação, embora secções coronais e sagitais são mais comumente utilizado para a identificação neuroanatômico. </li><li> Cole cada seção do cérebro em um bloco de montagem espécime com cianoacrilato. Apor um pequeno bloco de gel de agarose a 5% por trás da secção de cérebro de apoio (Figura 3B). Nota: Os outros mecanismos de apoio podem ser utilizados, mas sem apoio, o Vibratome pode empurrar o cérebro causando corte irregular. </li><li> Corte o tecido em 160 mm (distância de trabalho do objectivo usado para imagens) de espessura com a Vibratome definido para uma velocidade de 4 e amplitude de 9. NOTA: As definições para velocidade e amplitude pode ser ajustada dependendo da máquina específica a ser utilizada, a fim de obter mesmo, as secções lisas. Se as configurações estiveremnão estiver correto, o resultado pode ser seções irregulares, esgarçamento do tecido ou vibração marcas. </li><li> Recolha cortes de tecido em um frasco de cintilação preenchido com frescas, refrigeradas 1x PBS se eles estão indo para ser apagada dentro de uma semana. Se seções não vão ser apuradas dentro de uma semana, as seções lugar em 1,5 ml microtubos cheios de solução de criopreservação e armazenamento a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensação óptico de tecido cerebral Secções NOTA: Este protocolo foi modificado de um método previamente publicado 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol de glicerol em 1x PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Remover secções de 1x PBS ou, se em crioconservante, enxaguar em 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação contendo 10 ml de 25% Gl / PBST. Coloque o frasco num agitador a 4 ° C, cobertas pela exposição à luz, durante 12 h. </li><li> Confirme se todas as seções ter afundado ao bottom do frasco. Aspirar a 25% Gl / PBST, deixando apenas o suficiente para cobrir as seções, em seguida, encher o frasco com 10 ml 50% Gl / PBST e coloque em um shaker a 4 ° C, coberto de exposição à luz, durante 12 horas. Repita esse processo para os 75% Gl / PBST então a 90% Gl / PBST. Deixar seções no 90% Gl / PBST, durante 24 horas para chegar a compensação máxima. Ao longo do processo de limpeza, observar compensação óptica progressiva (Figura 4). NOTA: Este processo pode ser acelerado se as soluções forem alterados imediatamente após secções ter afundado até o fundo do frasco. Em 75% e 90% de soluções, secções não irá afundar todo o caminho para o fundo do frasco, mas irá flutuar no meio. </li></ol> 5. Montagem tecido cerebral Secções <ol style="margin-left: 40px;"><li> Corte um No. 1.5 lamela em 5 peças para criar um espaçador. Use um lápis régua e com ponta de diamante para marcar e quebrar a lamela ao longo das linhas tracejadas mostrado na Figura 5A. Descartar tele o centro peça, organizar as 4 peças exteriores sobre uma lâmina de vidro simples para criar uma janela, e em seguida, escove claro unha polonês sobre as costuras para aderir as peças do espaçador para o slide na configuração correta (Figura 5B). NOTA: O espaçador será utilizado para criar o espaço necessário entre a lâmina e a lamela de montagem para as secções compensados. A lamela pode ser cortada em diferentes formas de criar qualquer janela tamanho necessário. Espaçadores de espuma pré-cortadas estão também disponíveis comercialmente. Para permitir que unha polonês para secar completamente, o melhor é fazer slides com espaçadores de pelo menos um dia antes de seções de montagem. </li><li> Seções de transferência para um slide usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada. Certifique-se de preencher arredores com 90% de Gl / PBST. Cuidadosamente abaixe uma lamela sobre as seções tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas. O excesso de Gl / PBST pode ser mau para longe com um livre de fiapos wipe. </li><li> GFP Imagem + neurônios que contêm RFP + <em&gt; Cistos Toxoplasma gondii com um microscópio confocal imediatamente (Figura 7A-B), em seguida, armazenar lâminas planas e coberto de luz, a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, selo desliza completamente em torno de todas as bordas para armazenar e fotografada em um momento posterior. Uso de unha polonês claro para selar slide é opcional e pode torná-lo mais difícil de remover lamela se fosse para remover seções do slide em uma data posterior para posterior processamento. </li></ol> 6. Criação de Imagens Nota: Qualquer microscópio pode ser usado que tem a capacidade de obtenção de alta resolução z-stacks. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Depois de inicialmente encontrar o plano focal em 10X, mudar para um objetivo 20X e digitalizar através da seção para identificar um cisto localizado dentro de um GFP + celular. Centralize a região de interesse (ROI) no campo de visão. </li><li> Mude para uma objetiva de 40X. Concentre cima e para baixo ao longo de todo o ROI para certificar-se que a célula inteira e cyr são visíveis. Nota: As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal com um Oil DIC M27 objetiva de 40X / 1.30. </li><li> Usando o software de imagem instalado, obter uma pilha de z, que inclui toda a célula com cisto. Média de configurações utilizadas para obter imagens são mostradas na Figura 6. NOTA: As definições podem ter de ser ajustada dependendo de cada cortes de tecido investigadores e capacidades de microscópio. </li><li> Obter uma imagem máxima projeção do z-stack, definindo o número de projeções para 1. Obtenha uma visão de rotação completa, definindo o número de projeções para 64. NOTA: Outros pacotes de software estão disponíveis e podem ser usadas para obter máxima projecção, de rotação, bem como outros pontos de vista de imagens z da pilha. </li><li> Analisar a imagem com software de análise de imagem. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Tendo em conta que as alterações celulares em células hospedeiras infectadas têm sido associados a resultados da doença em infecções com outros organismos intracelulares, tais como HIV, raiva, e Chlamydia 18,19, desenvolvemos uma técnica que nos permite estudar as interações íntimas que ocorrem entre o CNS célula hospedeira e Toxoplasma. O método descrito aqui realiza este objetivo, permitindo imaging eficiente de neurônios cronicamente infectadas. Antes do desenvolvimento deste método, tal imagem era demorado, dispendioso, ou não é possível. Podemos agora usar esta técnica para responder a questões básicas sobre a interação do Toxoplasma -neuron, como são áreas neuronais específicas orientadas pelo parasita? Será que isso difere entre cepas de Toxoplasma? Fazer as áreas celulares, nos quais o cisto reside diferem do resto da célula (isto é, não infectadas e não infectadas dendrites do neurónio mesma têm o mesmo número de espinhas)? Quais são as características celulares compartilhados pelos neurônios infectadas? A capacidade de responder a essas perguntas é essencial para a compreensão de como a infecção por Toxoplasma altera o sistema nervoso central, incluindo a nível de comportamento. Para obter as melhores imagens possíveis, é muito importante certificar-se o tecido é cortado em seções iguais. Se as seções são desiguais, a lamela não sentar-se corretamente na seção levando ao contato desigual com o objetivo resultando em imagens sub-óptima. Durante a otimização deste protocolo, várias modificações foram feitas. O processo de compensação original foi feito com frutose, numa tentativa de reproduzir os resultados mostrados em uma técnica conhecida como SeeDB 20. Este método era incompatível com este modelo, uma vez que apagaram a RFP (especificamente mCherry). Outro passo fundamental e provavelmente o mais importante de tudo é que permite compensação máxima de cortes de tecido. Se não for esvaziada, fundo a difração de luz será maior eimagens tornam-se barulhento. Nós descobrimos que a adição de Tween-20 para o glicerol deu uma imagem ligeiramente mais clara do que o glicerol por si só. A tecnologia atual nos permite obter imagens de z-stack através de cortes de tecido cerebral 160μm de espessura, mas no futuro, nós estamos olhando para aumentar essa espessura de 500 mm ou mais para permitir ainda mais análise em profundidade. É só por olhar para toda a célula e suas conexões que podemos começar a desenvolver uma idéia mecanicista de como o cérebro é globalmente afectada por Toxoplasma. Este novo protocolo oferece uma oportunidade de estudar a interação do Toxoplasma -neuron no nível da célula única e fazê-lo de uma forma rápida e econômica. Ainda temos que explorar todos os usos potenciais para este protocolo e como ele pode traduzir para outros sistemas, mas prevemos que terá múltiplas aplicações.

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
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Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

O objetivo geral deste método é a obtenção de alta resolução, imagens tridimensionais de neurônios individuais que são infectadas pelo parasita intracelular obrigatório Toxoplasma gondii. Toxoplasma é muitas vezes considerada um dos parasitas mais bem sucedidas porque a sua gama de hospedeiro intermediário grande, que inclui os seres humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, após a infecção aguda por meio da ingestão de alimentos ou água contaminados, Toxoplasma é capaz de causar uma infecção persistente do SNC através da conversão a partir da sua forma de replicação rápido (a taquizoíto) para a sua replicantes lento e encistamento forma (o bradyzoite ). Em indivíduos imunocompetentes, esta infecção latente CNS é pensado para ser relativamente assintomática, mas em indivíduos imunocomprometidos, tais como pacientes com Aids ou transplantados, recrudescência do parasita pode levar a toxoplasmose cerebral fatal 1,2. Além disso, estudos recentes have demonstrado que a infecção com Toxoplasma latente pode conduzir a alterações comportamentais em roedores 3,4, embora o mecanismo permanece desconhecido. Surpreendentemente, apesar destes dados que destacam a importância da interação CNS- Toxoplasma, relativamente pouco se sabe sobre esta relação, especialmente no nível celular e molecular. A capacidade de estudar os aspectos, mesmo simples da interação cérebro-parasita tem sido prejudicado em parte por limitações tecnológicas. Por exemplo, a maior parte do trabalho que mostra que os neurónios são as células em que os cistos persistem tem sido feito com microscopia electrónica (EM) de 5,6. Embora EM dá alta resolução, é demorado, trabalhoso e caro. Imunofluorescência (IF) ensaios foram recentemente utilizados em conjunto com microscopia confocal para confirmar o trabalho feito por EM 7. Se os ensaios são tecnicamente fácil de executar e relativamente baratos, mas utilizando estas técnicas para understand a relação espacial entre o cisto eo neurônio infectados requer reconstrução de série, que é demorado, tecnicamente difícil, e pode levar à perda de informações valiosas. Assim, temos desenvolvido um método que pode ser usado com o modelo de ratinho de toxoplasmose cerebral e nos permite imagem da totalidade de neurónios infectados sem EM ou imuno-histoquímica (IHQ). Ao desenvolver essa técnica, podemos começar a explorar a relação entre celular da célula infectada e do cisto de uma forma relativamente rápida e barata. O método foi desenvolvido combina técnicas mais recentes para compensação óptica e seções do cérebro de imagem grossas por microscopia confocal 8 com um sistema que marca em células in vivo que foram injectados com proteínas do parasita 9,10. Neste sistema, que infectar ratinhos Cre-repórter que expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) apenas após 11 recombinação mediada por Cre com Toxoplasma </em&gt; Estirpes que expressam uma proteína fluorescente vermelha (RFP) e injectam recombinase Cre em células hospedeiras 9. Esta combinação nos permite colher o cérebro de camundongo infectado após a infecção do SNC é estabelecida, cortar seções do cérebro de espessura, e rapidamente identificar áreas pertinentes para a imagem, encontrando o RFP + cistos. É importante notar que, como expressão numa célula hospedeira de GFP depende unicamente da injecção de Cre por parasitas, e não sobre a infecção, um número de células GFP + não contêm parasitas 10. Como o objetivo deste protocolo é o de ser capaz de neurônios infectados imagem inteira, o foco é apenas na GFP + neurônios que contêm também uma RFP + cisto, mas o protocolo também pode ser usado para a imagem da GFP + / RFP - neurônios. Uma vez que o cérebro infectado é colhida e seccionados, as seções são tornadas transparentes por clearing glicerol. Regiões apropriadas de seções são então fotografada com microscopia confocal, almugido visualização inédita de células hospedeiras infectadas e os parasitas encistadas na sua totalidade. Aqui nós fornecemos um protocolo completo para a identificação, limpeza opticamente, e de imagem infectado neurônios.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii é um parasita obrigatório, intracelular com uma ampla gama de hospedeiros, incluindo humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, Toxoplasma estabelece uma infecção persistente ao longo da vida no cérebro. Enquanto esta infecção cerebral é assintomática na maioria das pessoas imunocompetentes, no desenvolvimento do feto ou indivíduos imunocomprometidos, como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) pacientes, essa predileção por e persistência no cérebro pode levar a doença neurológica devastadora. Assim, é claro que a interacção Toxoplasma cerebral é crítico para a doença sintomática produzido pelo Toxoplasma, ainda que têm pouca compreensão da interacção celular ou molecular entre as células do sistema nervoso central (SNC) e do parasita. No modelo do rato do CNS toxoplasmose tem sido conhecida há mais de 30 anos, que os neurônios são as células em que o parasita persiste, mas há pouca informação disponível sobre o qualparte do neurônio é geralmente infectados (soma, dendritos, axônio) e se esta relação celular muda entre as linhagens. Em parte, esta falta é secundária à dificuldade de imagem e visualização de neurônios infectados inteiros a partir de um animal. Tais imagens tipicamente exigiria cortes seriados e costura de tecido fotografada por microscopia eletrônica, microscopia confocal após immunostaining. Através da combinação de várias técnicas, o método aqui descrito permite a utilização de secções espessas (160 um) para identificar e imagem inteira de células que contêm cistos, permitindo a visualização e análise de neurónios individuais, cronicamente infectadas tridimensional sem a necessidade de imunomarcação, microscopia electrónica ou cortes seriados e costura. Usando esta técnica, podemos começar a compreender a relação celular entre o parasita eo neurônio infectado.

A Figura 7 inclui imagens representativas de dois neurónios GFP + 160 a partir de dois mm de espessura diferentes, bem como uma medida representativa da distância de cisto-a-célula no corpo para a Figura 7B. Figuras contendo cisto 7 A e B mostram que esta nova protocolo permite a visualização do neurónio infectada na sua totalidade. A Figura 7C mostra que com esta técnica de imagiologia, é agora possível para quantificar a distância entre o cisto e o corpo da célula (Imaris 7,7). A Figura 7D é uma vista de rotação completa da Figura 7B. A visualização da pilha-z desta maneira permite a verificação da captura completa da célula e cisto. A figura 7E é um filme 3D rotacional que mostra como a imagem de 7D pode ser analisada pelo software Imaris 7,7 para medir a distância do cisto o corpo celular ou de meio-a-meio or edge-to-edge. Embora a medição constante foi realizada utilizando uma linha recta entre o cisto e o corpo da célula, uma sequência de medição real da GFP + processo para o corpo da célula podem também ser gerados (dados não mostrados). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: Equipamento cirúrgico para a remoção do cérebro do rato. (A) almofada absorvente. (B) bloco de espuma. (C) Agulhas de fixar para baixo pés. (D) 25 G conjunto de coleta de sangue. (E) torneira de 3 vias. (F) seringa de 20 ml para a heparina / Saline. ( G) 20 ml para 4% PFA. (H) pinça polegar. (I) tesoura Belas, em ângulo para o outro, sharp-afiada. (J) Tesoura afiada-sharp. (hemostats K) Kelly. (L) tesoura de Mayo. (H) </strong&gt; Micro espátula. frasco (N) Scintillation para 4% PFA. Scale bar = 8 cm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig2highres.jpg" /> Figura 2: Colheita do mouse cérebro. (A) do rato encurralado e no peito pulverizada com etanol 70%. (B) peito exposto. Cavidade (C) Peito aberto. (D) do fígado, após a perfusão adequada. (E) do fígado, após a perfusão inadequada. (F) crânio exposto. ( G) Cérebro com metade do crânio removido. (H) cérebro colhido no frasco cheio com 4% PFA (I), após a perfusão cerebral adequada.. (J), após a perfusão cerebral inadequada. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig3highres.jpg" /> Figura 3: Seccionamento cérebro do rato. (A) Rato cérebro Matri<html> x. (B) mouse cérebro e gel de agarose afixada bloco de montagem com cianoacrilato no interior da câmara Vibratome preenchido com refrigerados 1x PBS. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: processo de compensação Imagens representativas de uma seção do mouse cérebro durante cada etapa do processo de compensação.. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig5highres.jpg" /> Figura 5: Corte e fixação espaçador a deslizar. A No. 1.5 lamela. Com marcas representativas para corte lamela em 5 pedaços. B. Lâmina de vidro liso com cada peça de corte lamela pregado no lugar com unhas polonês claro para criar uma janela. <html> 2237 / 52237fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Captura de tela de parâmetros gerais utilizados para aquisição de imagem. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Cistos Toxoplasma gondii pode residir em processos neuronais distantes (AB) imagens projeção máxima de GFP + neurônios que contêm RFP + cistos (setas brancas). Escala da barra = 20 m. (CE) proporcionar visualização adicional e análise da relação cisto-neurónio mostrado em B. (C) medição linha directa Imaris-gerado de distância do bordo do cisto da borda do corpo celular (149μm ). (D) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figure 7D.avi" target="_blank">3-D filme de rotação</a> . (E) Imaris geradowww-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figure &quot;target =&quot; _ blank 7E.avi &quot;&gt; filme em 3-D mostrando medição cisto-a-corpo celular de ambos meio-a-meio (163 mm) e edge-to-edge (149 mm).

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado.

Imagem 3-D e Análise de Neurônios Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Com<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K visualizações.  University of Arizona.  Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado. 

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Imunologia e Infecção

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Rastreamento de patógenos de órgãos inteiros por meio de quantificação fluorescente de repórter

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor em destaque: Desvendando as respostas bacterianas aos antibióticos e ao sistema imunológico nos tecidos

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

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