Name: quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. Cultura celular <ol><li> Use telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) nas células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas (hTERT-RPE1; referido aqui como RPE1). NOTA: células RPE1 são células humanas quase diplóides, não transformadas que são comumente usados ​​para estudar a montagem centríolo e ciliogênese. Estas células seguem um ciclo de duplicação centríolo normais coordenado com um ciclo celular regulamentado. </li><li> Uma passagem quase confluentes 100 milímetros prato de cultura de células de células RPE1 a 1: 5 de diluição da cultura original para uma nova placa de 100 mm contendo 10 ml de meio DME / F-12 (1: 1) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (meio completo é referido como DME / meio F-12). Crescer as células a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. <ol><li> Incubar 12 milímetros lamelas de vidro redondas com 50 ml de HCl 1 N num copo de vidro coberto, S / N, sem agitação, a 60 ° C em um banho-maria ou incubadora. </li><li> After descartando a solução de ácido, lavar as lamelas três vezes em 100 ml de água destilada, por incubação durante 15 minutos com agitação ocasional. Repetir a lavagem de modo semelhante em 70% de etanol e 95% de etanol. </li><li> Secam-se as lamelas de cobertura, espalhando-os individualmente para fora em um papel mata-borrão em laboratório uma cabine de segurança biológica, seguido por esterilização por radiação UV durante 60 min. </li></ol></li><li> Coloque 2-4 lamelas secas em um 35 milímetros de cultura de células prato. Dilui-se a solução de fibronectina ou fibronectina como polímero de engenharia (concentração estoque de 1 mg / ml) para uma concentração de 25 ug / ml em cultura de células de PBS. <ol><li> Coloque 80-100 ul da solução diluída em cada lamela e incubar durante 60 min a revestir o lado superior da lamela. Lave as lamelas três vezes usando PBS antes de adicionar meio completo. </li></ol></li></ol> 2. Células crescendo e tratamento de células com inibidores de proteassoma <ol><li> Passagem 2 x 10 5 assincronamente crescercélulas ing RPE1 em cada 35 milímetros prato contendo lamelas e crescer as células em 2 ml de meio completo. Substituir o meio de cultura a cada 24 horas com meio completo fresco pré-aquecido. <ol><li> Para analisar o efeito de inibição do proteassoma no nível centrosomal da proteína de teste (aqui VDAC3 ou γ-tubulina), crescem as células em dois pratos de 35 mm para 44 hr. Substituir o meio de cultura com meio completo e adicione ou MG115 ou DMSO como controlo do solvente a uma concentração final de 5 uM ou 0,05%, respectivamente. Ao mesmo tempo, adicionar BrdU para as células a uma concentração final de 40 uM e incubar as células durante 4 horas. </li><li> Transferência de cada lamela em uma placa de 24 poços. Adicionar 500 mL de metanol arrefecido a cada poço e incubar a placa à temperatura de -20 ° C durante 10 minutos para fixar as células sobre as lamelas. Lavar imediatamente as lamelas três vezes com 500 ul de tampão de lavagem (1x PBS contendo 0,5 mM MgCl2 e 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Colha o residualas células a partir da placa de 35 mm e centrifugação das células a 1000 xg durante 5 min. Usar o sedimento celular para avaliar a proteína total por Western blotting (passo 6). </li></ol> 3. BrdU de pulso e Chase Ensaio para analisar os níveis de proteínas em diferentes fases do ciclo celular <ol><li> Para analisar a variação do nível de uma proteína (aqui VDAC3, SAS6 ou Cep135) em centrossomas em diferentes fases do ciclo celular, as células crescer em dois pratos de 35 mm contendo lamelas de 44 horas. Substituir o meio de cultura com meio completo contendo 40 uM de BrdU e incubar as células durante 4 horas na incubadora de cultura de células. </li><li> A partir de um prato, transferir as lamelas a uma placa de 24 poços para fixar as células utilizando metanol arrefecido tal como descrito no passo 2.1.2. </li><li> Após o pulso de BrdU 4 h, remover o meio contendo BrdU, lave as células uma vez com PBS e uma vez com meio completo, adicionar meio fresco, e depois crescer as células na ausência de BrdU durante vários tempos (geralmente mais 4 hpara células RPE1) antes de fixar as células tal como descrito no passo 2.1.2. NOTA: Para as células RPE1, a maioria das células positivas para BrdU são em S tardia ou fase G2 após uma perseguição de 4 h. Isso deve ser determinada de forma independente para cada tipo de célula. </li></ol> 4. Immunostaining <ol><li> Incubar as células fixadas em lamelas em 200 ul de tampão de bloqueio (2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x), durante 30 min. <ol><li> Incubar as células com uma mistura de anticorpos primários (tipicamente uma produzidos em coelho e outra levantada em rato) diluído em tampão de bloqueio O / N a 4 ° C numa câmara humidificada. </li><li> Para fazer uma câmara úmida, colocar uma toalha de papel molhado na metade inferior de uma caixa de ponta da pipeta vazio 1.000 l. Coloque uma tira de Parafilm na superfície da cremalheira, e detectar uma gota (15-20 ul) da solução de anticorpo para o Parafilm para cada lamela para ser incubados. Inverter uma lamela para uma gota de solução de anticorpo (de modo que as células estão imersos) e pertoa tampa da caixa de ponta. </li><li> Inverta lamelas novamente e devolvê-los de volta para o 24 bem prato. Lavar as lamelas e, em seguida, incuba-los na mistura de 150 ul de anticorpo secundário (aqui corante conjugado anti-coelho verde-fluorescente e o corante vermelho fluorescente conjugado anti-rato diluído em tampão de bloqueio) durante 1 h à TA. Lavam-se as lamelas três vezes. NOTA: Os anticorpos secundários fluoróforos são sensíveis à luz. Proteja as amostras da luz durante os passos 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Preparar para a coloração anti-BrdU por fixação das células coradas RPE1 novamente com 500 mL de metanol arrefecido a -20 ° C durante 10 min, tal como descrito no passo 2.1.2. Lavam-se as lamelas três vezes. NOTA: Este fixação prende a marcação com anticorpos primários e secundários da proteína (s) de interesse durante o processo de hidrólise ácida no passo seguinte. <ol><li> Incubar as células em 200 ul de HCI 2 N durante 30 min à TA. Neutraliza-se com 300 ul de 1 M de Tris-Cl, pH 8, umad lavar as células por três vezes com tampão de lavagem. </li><li> Bloquear as células novamente usando 200 ul de tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as células com anticorpo de rato anti-BrdU (diluído em tampão de bloqueio) durante 45 min a 37 ° C numa câmara humidificada. Devolver as lamelas de volta para o prato de 24 poços, lavá-los e depois incubar com o corante azul-anticorpo conjugado fluorescente anti-rato secundária (diluído em 150 ul de tampão de 24 poços prato de bloqueio durante 1 h à TA. </li></ol></li><li> Lavam-se as lamelas três vezes. Detectar uma gota (aproximadamente 3-6 L) de uma solução de montagem antifade contendo reagente sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Inverter uma lamela, com o lado da célula a virada para baixo, para a solução de montagem. Limpe o excesso de líquido, pressionando suavemente a lamela contra o slide usando tecido de limpeza suave. Aplicar transparente unha polonês ao longo da borda da lamela para selá-lo para a lâmina de microscópio. </li></ol> 5. Imunofluorescência Imagem acquisition e Análise <ol><li> Utilize uma objectiva de imersão em óleo de 100X Plano Apo (com uma abertura numérica de 1,4) para adquirir as imagens de células positivas para BrdU RPE1 à temperatura ambiente. <ol><li> Coloque uma lâmina no microscópio (veja equipamentos) ligados com uma câmera capaz de imagem digital. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição apropriado (tipicamente entre 300-1,000 mseg) através do exame manualmente todas as amostras de uma experiência. Antes da aquisição de imagens de uma célula, determinar manualmente o topo do apropriado e plano focal inferior ao longo do eixo Z (tipicamente de 0,2 um tamanho de passo). Aquisição de imagens de diferentes amostras que estão em lamelas separadas, usando o tempo de exposição idênticos para diferentes fluoróforos ao longo do eixo Z, usando um pacote de software de imagem digital microscopia. </li></ol></li><li> Execute deconvolution (nesses casos, não usando nenhum algoritmo do vizinho) de todas as pilhas de imagens adquiridas ao longo do eixo Z. <ol><li> Obter a projeção total de intensidade de cada pilha de imagens ao longoo eixo Z. </li></ol></li><li> Nas células onde centrosomes estão próximos (distância entre dois centrossomas é inferior a 2 mm), desenhe um pequeno quadrado (tipicamente 20-30 pixels de cada lado) em torno de ambos os centrossomas e marcar a área selecionada. <ol><li> Desenhe um quadrado maior (tipicamente 24-35 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada da grande praça. </li><li> Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa (S indica a pequena caixa e L indica a caixa grande). </li><li> Analisar o fundo corrigida intensidade de fluorescência de cada fluoróforo utilizando a fórmula descrita por Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)]. </li><li> Obter a intensidade de fluorescência normalizada da proteína de interesse (aqui VDAC3 ou SAS6) através do cálculo da razão entre a intensidade de fluorescência corrigida dos seus fl-fundouorophore ao do fluoróforo utilizado para o padrão interno escolhido (aqui γ-tubulina, ou SAS6 Cep135). </li></ol></li><li> No caso de análise de células, onde os centrossomas estão bem separadas (distância entre dois centrossomas é superior a 2 mm), analisar cada centrossoma separadamente por desenho dois conjuntos separados de caixas. Desenha um pequeno quadrado (tipicamente 15-25 pixels de cada lado) em torno de cada centrosome e marcar a área selecionada. Desenhe um quadrado maior (20-30 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada. <ol><li> Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa, e calcular as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada fluoróforo, separadamente para cada centrossoma, conforme descrito no passo 5.3.3. </li><li> Combina-se as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada uma das proteínas a partir das duas centrossomas para obter o nível centrosomal total de proteína em que essa célula. </li><li> Obter aintensidade normalizada para a proteína de interesse por cálculo da razão da sua intensidade centrosomal total e intensidade centrosomal total do padrão interno. </li></ol></li><li> Analise pelo menos 15-25 células para cada condição experimental e traçar o gráfico em uma planilha. </li></ol> 6. Analisando proteína total Usando Western Blotting <ol><li> Ressuspender as células em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo 50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS) e incubar durante 10 min em gelo para lisar as células. <ol><li> Centrifuga-se a mistura a 10.000 xg durante 10 min, separar o lisado a partir da fracção sedimento e medir a concentração de proteína total de cada lisado usando um ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensaio. </li></ol></li><li> Misturar 40 ug de lisado 4x com tampão de carga de SDS-PAGE (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul). <ol><li> Ferver as amostras durante 10 min e executar as amostras sobre um 12,5% de desnaturação de SDS-PAGE a uma voltagem constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transferem-se as proteínas separadas em SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose usando a técnica de transferência de western (a uma voltagem constante de 90 V durante 1 hora em frio). <ol><li> Bloquear a membrana com 3% de leite desnatado em PBS 1x, e então incubar a membrana com soluções de anticorpos primários diluídos (neste caso de coelho anti-VDAC3, de coelho anti-γ-tubulina e de ratinho anti-α-tubulina) durante 1 h à TA. </li><li> Depois de lavar a membrana três vezes (5 min cada incubação sob agitação), utilizando tampão PBS-T (PBS 1x e 0,2% de Tween-20), incubar a membrana numa mistura de infravermelho próximo, (IV) corante fluorescente conjugada com anti-coelho e corante fluorescente de IV anticorpos secundários anti-murganho conjugados (diluídos em PBS-T) durante 1 hora. </li><li> Lava-se a membrana três vezes e, em seguida, analisar a membrana para analisar as bandas utilizando um f infravermelhosistema de imagem luorescence adequado para a detecção de immunoblot. </li></ol></li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Microscopia quantitativa em biologia celular é comumente associado com ensaios de imagem em células vivas, como a fluorescência de Ressonância Energia Transferência (FRET), Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP), etc. No entanto, há exemplos de crescimento de biólogos celulares em desenvolvimento diferentes ensaios de microscopia quantitativos para fixo células nos últimos anos 27,34-36. É importante ressaltar que o progresso na compreensão da biologia centrosome muitas vezes requer compreensão da função específica do centrossoma de proteínas cuja piscinas centrosomal podem ser regulados de forma diferente do que outras piscinas. Assim, foi desenvolvido um ensaio quantitativo IIF para analisar especificamente o nível centrosomal relativa de uma proteína de duas amostras tratadas de maneira diferente. Uma vez que esta requer que as células são fixadas e processadas em lamelas separadas, que, por conseguinte, introduzido um padrão interno, para a finalidade de normalização, a um melhor controlo de possíveis artefactos devidos à necessidade de manusear a dois experimecélula ntal populações separadamente, e aumentar a precisão do ensaio. Há apenas alguns estudos anteriores 37 que usaram um padrão tão interno para medir a intensidade de fluorescência relativa de uma proteína teste. Embora a escolha de um padrão interno é fundamental para a precisão do nosso ensaio, é, sem dúvida, o aspecto mais desafiador. Idealmente, os duplicados par Centríolo durante a fase S, e as centrioles duplicados acumulam então componentes adicionais, incluindo PCM γ-tubulina durante G2, de modo que os dois centrossomas maduras podem tornar-se os pólos do fuso mitótico. Portanto, vamos supor que o nível centrosomal de γ-tubulina não mudaria significativamente em células que são estritamente em fase S. Este parece ser o caso em células RPE1 em que as células em fase S são assinalados por uma breve rotulagem BrdU. No entanto, a validade de um padrão interno deve ser testada para cada tipo de célula e condições experimentais. Por exemplo, enquanto o fundo-corresponCTED VDAC3 fluorescência aumentou mais do que duas vezes em resposta à inibição do proteassoma em afidicolina tratada (fase S preso) células U2OS, houve também um (0,001 &lt;P &lt;0,05) aumento pequeno, mas estatisticamente significativo no centrosomal γ-tubulina (complementar Figura). Assim, γ-tubulina nem sempre é um controlo interno adequado, mesmo para células que estão presas no ciclo celular. Semelhante a todos os outros ensaio de microscopia de IFI, uma das desvantagens deste ensaio é que os anticorpos contra a proteína de teste e o padrão interno deve ser criado em diferentes espécies hospedeiras. Enquanto os nossos dados sugerem que Cep135 é um padrão interno melhor que SAS6, não poderíamos normalizar os níveis de VDAC3 contra Cep135 como os anticorpos disponíveis contra estas proteínas foram ambos criados em coelho. Assim, em vez normalizado contra SAS6, o que causou uma superestimação da diminuição dos níveis de VDAC3 entre o final da fase S e G2. Numa situação em que o intepadrão rnal varia modestamente, pode-se introduzir um outro fator de normalização para dar conta de que a variação. Por exemplo, para corrigir a variação em SAS6, multiplicou-se a intensidade VDAC3 SAS6 normalizada pela intensidade SAS6 Cep135-normalizada. Nos casos em que a escolha de um padrão interno adequado é difícil, corante fluorescente microesferas revestidos (0,02-0,04 mm de diâmetro) pode fornecer uma estratégia alternativa. O sinal de fluorescência de uma microesfera presentes no mesmo campo que a célula de interesse pode ser usada para normalizar o sinal de fluorescência correspondente à proteína de interesse. Por outro lado, se as células de teste e de controlo são gravadas em conjunto, pode-se não precisa de um padrão interno para normalização tal. Nós já usou uma versão deste ensaio para comparar o nível de centrosomal MPS1 em células com superexpressão ou ciclina A 19 ou Antizyme 20, que quer impedir a 19 ou 20 de promover a degradation de centrossomas no MPS1, respectivamente, para que em células não transfectadas adjacentes espelhados ao mesmo tempo. A fim de examinar o efeito de inibição sobre VDAC3 centrosomal proteassoma, utilizou-se marcação com BrdU para identificar e comparar as células que se encontram em fase S. Embora o tratamento MG115 pode inibir a progressão do ciclo celular, esta inibição requer uma concentração significativamente mais elevada 38 do que o utilizado no presente estudo. Nas concentrações utilizadas aqui MG115 pode bloquear os pontos de verificação do ciclo celular e as transições, mas não bloqueia a progressão do ciclo celular. No entanto, isto deve ser verificada para cada tipo de célula, como foi aqui mostrando que MG115 não alterou a percentagem de células positivas para BrdU em comparação com DMSO. No entanto, prender as células em fase S utilizando afidicolina ou hidroxiureia (HU) ou sincronizar usando células mitóticas &#39;shake-off&#39; e liberar ou bloquear timidina casal e liberação poderia ser usado como abordagens alternativas para a geração de popula equivalenteções de células em fase S. A estratégia de pulso-caça BrdU para estudar pontos de tempo do ciclo celular, será muito útil em diversos ensaios funcionais que requerem um ciclo celular perturbado. Este é um ensaio biologicamente mais significativo que pode ser capaz de substituir as técnicas de detenção do ciclo celular utilizando vários inibidores do ciclo celular. A utilização destes inibidores podem muitas vezes causar diferentes tipos de stress fisiológico em que as células aberrantes, resulta em alterações nos fenótipos ciclo celular. Uso da abordagem pulso-chase nos permitiu demonstrar que a depleção de Cetn2 só atrasou a montagem centríolo 39 e não de causar um bloqueio completo, tal como sugerido por estudos anteriores 23. Detecção de células positivas para BrdU requer hidrólise ácida das amostras. Nós e muitos outros pesquisadores estão usando uma técnica que re-corrige as células após a coloração primária e secundária de proteínas de teste, antes da hidrólise ácida, com perda insignificante de intensidades de coloração para different proteínas centrosome 40. No entanto, uma alternativa potencial poderia ser a utilização de 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU), um outro análogo da timidina, que é, semelhante ao BrdU, incorporada de forma eficiente na replicação de ADN 41. Visualização de Edu usando &#39;click chemistry &quot;não exige hidrólise ácida 42, e pode, portanto, mais adequado para alguns anticorpos. Além disso, este ensaio pode ser facilmente utilizado para medir a alteração em modificações pós-tradução de uma proteína particular, na centrossomas. Por exemplo, o nível de fosforilação centrosomal pode ser normalizada em relação ao teor total de proteína em si, desde que existem anticorpos específicos do local de fosforilação. Este ensaio pode ser aplicado imediatamente para avaliar os níveis relativos de fosforilação entre as condições experimentais ou de fases do ciclo celular, mas poderia ser adaptada para avaliar os níveis totais de fosforilação se parâmetros críticos de anticorpo affindades são conhecidas ou podem ser determinadas. Este ensaio deve ser aplicável também para o estudo das proteínas, em qualquer outro local em células, embora a região de interesse não deve ser demasiado grande. O ensaio será particularmente útil para medir a modulação de localização específica de uma proteína que está localizado em vários locais celulares. Há um punhado de parâmetros técnicos como fotodegradação diferencial, o efeito de imagem digital, linearidade das intensidades de fluorescência de fluoróforos, o ruído de fundo, etc., que devem ser levados em consideração para maximizar a precisão da medição 43. Por exemplo, pode-se mudar o fluorocromo associado com cada anticorpo secundário para avaliar a contribuição do fotobranqueamento. Muitos outros parâmetros podem ser bem controlada, se alguém usa condições idênticas de imagem (tempo de exposição, ganho, tamanho do passo, o número de Z-stacks, etc.) e o mesmo software de imagem em cada série de imagens. Embora tenhamos usadoo algoritmo de n-vizinho durante toda a ensaio para efectuar imagem de desconvolução, este ensaio pode ser combinado com outro algoritmo de desconvolução, tais como constrangido iterativo. Constatamos também que ele deve ser fácil de adaptar este ensaio para qualquer número de diferentes pacotes de software de imagem, como software de análise de imagem mais comumente disponíveis tem ferramentas para a análise da intensidade de fluorescência e distâncias. Este ensaio deve ser aplicável a qualquer tipo de célula, e nossa escolha de células aqui é puramente baseado em sua relevância na investigação em biologia centrosome, e seu uso em nossos exames anteriores da função VDAC3 centrosomal 16,28. No entanto, a validade das normas internas e momentos adequados para pulso-chase para identificar as células em fase S, G2, ou mitose deve ser determinado para cada tipo de célula. No geral, a técnica de fluorescência quantitativa recentemente desenvolvido em combinação com o ensaio de pulso-caça BrdU será um método muito útil para resolver vários intrincadomecanismos em biologia centrosome e, em muitos aspectos mais amplos da biologia celular.

Centrossomas consistem em um par de centríolos cercados por material de pericentriolar (PCM). Sendo os principais centros de microtúbulos organizadoras (MTOCs) em células de mamíferos, centrosomes servem como os dois pólos de fusos mitóticos em células em divisão, e, assim, ajudar a manter a integridade genômica 1. Em células quiescentes (por exemplo, durante a fase G0), um dos dois centrioles do centrossoma, a saber, a centriole mãe, é transformado em um corpo de base, ao montar o cílio primário, um organelo sensorial salientes para fora a partir da superfície de células 2. Uma vez que as células re-entrar no ciclo celular, os cílios são desmontados e cada centriole dirige a montagem de um procentriole na sua extremidade proximal que, gradualmente, se alonga para formar um centriole 3 madura. No início da fase S, uma estrutura semelhante a cambalhota que fornece a simetria de 9 vezes para a centriole é formada sobre a superfície de cada centriole existente e irá tornar-se a base de cada procentriole. SAS6 tchapéu é indispensável para a montagem centríolo é recrutado para formar o cubo da roda de carroça 4-6. Outras proteínas centriolar são então montados para a cambalhota em um ambiente altamente regulado, proximal para distal maneira 7. Depois de completar precisamente duplicação centríolo, células montar materiais pericentriolar adicionais para construir dois centrossomas funcionais até o final da fase G2 8. Em adição aos componentes principais centriolar 9-11, várias outras proteínas, incluindo cinases, fosfatases, chaperones, componentes de andaime, proteínas de membrana associadas a degradação e máquinas estão associados com centrioles, corpos basais e PCM em alturas diferentes do ciclo celular 12-16. Ele é frequentemente observado que os níveis de centrosomal muitas proteínas são temporalmente regulados por mecanismos de segmentação centrosomal e / ou degradação no proteossómica centrossomas. É importante ressaltar que as flutuações no nível centrosomal de várias proteínas, como Plk4, MPS1, SAS6 e CP110 umt diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para regular montagem centriole 5,17-22, e no caso de MPS1 prevenir essa degradação centrosomal leva à formação de um excesso de 19 centrioles. Por outro lado, as fracções centrosomal de várias proteínas são menos lábeis em relação a piscinas citosólicas. Por exemplo siRNA mediada down-regulação da Centrin 2 (Cetn2) levou a apenas uma diminuição moderada do nível de proteína nas centrioles apesar de grande redução em toda a sua níveis de células 23. É, portanto, essencial para medir as mudanças no nível de proteínas centrosomal no centrosome em vez de medir os níveis de proteínas inteiras celular ao avaliar suas funções específicas do centrossoma. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio utilizando imunofluorescência indireta (IFI) para quantificar o nível relativo de uma proteína no centrosomes. Este ensaio é desenvolvido particularmente para analisar as células que são a partir de diferentes amostrase, portanto, não pode ser trabalhada ao mesmo tempo. Estas amostras podem ser células que foram tratadas com diferentes reagentes (isto é, a droga versus controlo), recolhidas a diferentes pontos de tempo (isto é, contra perseguição de impulso), ou estão em diferentes fases do ciclo celular. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma região pequena e para normalizar o valor contra o mesmo para uma outra proteína cujos níveis não variam de acordo com as condições experimentais escolhidas. Vários estudos em biologia do centrossoma recentemente utilizados várias técnicas de microscopia quantitativa, em ambas as células vivas ou fixadas, para determinar a função específica do centrossoma de proteínas candidatas 24-27. Semelhante aos ensaios, a presente técnica também mede a intensidade de fluorescência de fundo corrigido da proteína a testar. No entanto, a inclusão da normalização utilizando um padrão interno no presente ensaio seria provável oferecer maiorprecisão e confiança na análise de duas amostras diferentes que estão em duas lamelas diferentes. Além disso, em adição ao exame do nível de proteína no centrossomas, com pequenos ajustes este método pode ser aplicado a um conjunto diversificado de condições experimentais ou em outros locais celulares. Aqui, nós combinamos nosso ensaio microscopia quantitativa, com uma estratégia de pulso-chase BrdU para comparar as células de diferentes fases do ciclo celular. Em vez de utilizar técnicas de paragem do ciclo celular e padrão de libertação para o estudo de vários pontos de tempo do ciclo celular, as células que crescem de forma assíncrona são incubadas com BrdU para marcar as células em fase S, e as células marcadas são perseguidos durante vários tempos (tipicamente 4-6 h). A maioria das células marcadas estará em fase S imediatamente após o pulso. O comprimento da perseguição é escolhida de modo que após a perseguição, células marcadas será no final de S, G2 ou mitose, o que pode ser verificado por características morfológicas, tais como- posição de centrossomas no que diz respeito ao nuclei, a distância entre os centrossomas, condensação de cromossomas, etc. Assim, o comprimento da perseguição depende da duração média de S, G2 e M de fase num tipo de célula particular. Uma vez que esta abordagem evita a inibidores do ciclo celular, tais como a hidroxiureia, a afidicolina, nocodazol, etc, que permite uma análise mais fisiologicamente relevante do ciclo celular. Assim, demonstramos aqui que o ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa sozinho, ou em combinação com BrdU de pulso-caça ensaio, é uma técnica simples e poderosa para medir com precisão as mudanças relativas no nível centrosomal de uma proteína candidata durante um ciclo celular perturbado. Foi medido o nível de centrosomal VDAC3, uma proteína que, recentemente identificado em centrossomas além de mitocôndrias 16,28, utilizando estes ensaios. Os resultados obtidos aqui verificar a nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação, e também varia em um dependen ciclo celulart modo 16, além disso validando a aplicabilidade deste método.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock of 1 mg/ml in water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF blocking buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&amp;nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rat monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H&amp;amp;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland antibodies</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Round coverslips 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 numerical aperture</td></tr><tr><td>Slidebook software package</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Centrossomas são pequenas, mas importantes organelas que servem como os pólos do fuso mitótico para manter a integridade genômica ou montar cílios para facilitar funções sensoriais nas células. O nível de uma proteína pode ser regulado de forma diferente em centrossomas do que em outros locais .cellular, e a variação no nível centrosomal de várias proteínas em diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para a regulação correcta da montagem centriole. Foi desenvolvido um ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa que mede as mudanças relativas no nível de uma proteína na centrossomas em células fixadas a partir de diferentes amostras, tais como em diferentes fases do ciclo celular, ou após tratamento com vários reagentes. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma pequena região, e que normalizar medição contra o mesmo para uma outra proteína que não varia no âmbito do c experimental escolhidoondition. Utilizando este ensaio, em combinação com BrdU de pulso e caça estratégia para estudar os ciclos celulares não perturbados, temos quantitativamente validado nossa observação recente de que o conjunto de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular, provavelmente pela degradação mediada por proteassoma especificamente em centrossomas.

Os nossos estudos recentes identificaram novos centrosomal localização e função de VDAC3, uma das porinas mitocondriais 16,28. A imunocoloração de várias células de mamíferos, incluindo células RPE1 utilizando um anticorpo específico VDAC3-centrosomal apresentaram coloração proeminente e coloração mitocondrial comparativamente fraca. Nós também mostrou que VDAC3 centrosomal é preferencialmente associado ao centríolo mãe, ea piscina centrosomal tanto da endógeno e ectopically expressa VDAC3 é regulada pela degradação 16. A fim de validar o ensaio quantitativo IIF analisamos as variações na piscina associado VDAC3-centrossoma em células que estão na fase S. Aqui, de forma assíncrona em crescimento RPE1 células foram tratadas com o inibidor de proteassoma MG115 ou o controle de solvente DMSO durante 4 h. Para restringir nossa análise de células que que estão em fase S e passando por montagem centrosome, temos células que incorporaram BrdU du só examinoutocar o mesmo 4 horas e tinha dois centrossomas estreitamente espaçadas (espaçados dentro de 2 m uns dos outros). Foram examinados vários campos aleatórios de células coradas para BrdU e núcleos de controlo e no tratamento MG115 (Figura 1A) para se concluir que o tratamento breve de MG115 não afectam a incorporação de BrdU (aproximadamente 58%) em comparação com o tratamento controlo (aproximadamente 56%) em células RPE1. À medida que foram comparando apenas as células que estavam em fase S (tal como avaliado pela presença de dois focos γ-tubulina espaçados dentro de 2 m uns dos outros), considerou-se γ-tubulina como um potencial padrão interno para normalização. Assim, começou por examinar se centrosomal níveis de γ-tubulina em células positivas para BrdU variar de acordo com a inibição do proteassoma. Não surpreendentemente, houve variação considerável de célula para célula em γ-tubulina intensidade de fluorescência de uma célula para outra, e nós achamos que essa variação foi melhor apresentado em diagramas de caixa e suiça que apresentam o conjunto de dados como um todo disponível. EUQuadro N e suiça diagramas, caixas representam o quartil inferior e superior, o marcador na caixa indica a mediana de cada série, e os bigodes representam os valores mínimos e máximos, que são muitas vezes (mas nem sempre) discrepantes. Como se pode ver na Figura 1D, o nível γ-tubulina centrosomal não foi significativamente diferente entre as células positivas para BrdU tratados com MG115 ou DMSO, validando assim γ-tubulina como um padrão interno para esta experiência. Em contraste com γ-tubulina, a intensidade de fluorescência corrigida-fundo correspondente ao VDAC3 centrosomal foi cerca de 2,5 vezes mais elevada em células tratadas com MG115 do que em células de controlo (Figura 1C). Quando normalizada fluorescência total VDAC3 contra que de γ-tubulina, o aumento de vezes caiu ligeiramente para cerca de duas vezes (Figura 1E). Embora a mudança vezes foi maior sem normalização, temos mais confiança na precisão dos dados normalizados, o que nós sentimos Bettcontroles er para qualquer efeito geral de tratamento MG115, assim como a variação devido ao processamento da amostra. Coloração VDAC3 em locais não-centrosomal (Figura 1B) ou a nível celular total de VDAC3 (Figura 1F) não foi afetado pela inibição do proteassoma. Assim, quantitativamente verificar nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação mediada-proteassoma. A fim de medir a variação na VDAC3 centrosomal durante o ciclo celular já marcaram as células com um pulso de BrdU 4 horas seguido por uma perseguição de 4 h das células marcadas. Uma vez que apenas as células em fase S, irá incorporar BrdU durante o impulso (distância média entre dois centrossomas é 1,35 ± 0,16 micron), a maioria das células positivas para BrdU RPE1 após 4 h perseguição será no final ou fase S ou fase G2 precoce ( distância média entre dois centrossomas é de 1,55 ± 0,22 mM), com uma população menor na fase G2 tardia, onde o centroalguns par separou significativamente (distância média entre dois centrossomas&gt; 2 m) 30. γ-tubulina, sendo um componente principal de PCM muito acumula no centrossomas durante a maturação do centrossoma que tem lugar a fase G2 31,32, e este aumento torna um padrão interno pobre para verificar as variações no ciclo celular de outras proteínas centrosomal. Por outro lado, é recrutado para SAS6 procentrioles durante a fase S precoce para estimular a montagem dos cartwheels 4,5,7, e permanece na base dos centrioles recém-formados células entram em mitose até quando se começa a degradar-se (Figura 2 e de referência 5). No entanto, em células HeLa ou U2OS, o nível de centriolar SAS6 gradualmente aumenta à medida que as células progridem da S-fase para fase G2 5. Portanto, medimos o primeiro nível SAS6 centrosomal com respeito à de Cep135, uma outra proteína do núcleo centriolar que localiza com as extremidades proximais dos centrioles todao ciclo celular 33. Não foi observada nenhuma diferença significativa nas intensidades de fluorescência total corrigido-fundo de Cep135 ou SAS6 em células RPE1 positivas para BrdU de pulso ou perseguição, quando centrossomas são espaçados (Figura 3A-D; &#39;close&#39; células distância onde média entre dois centrossomas é inferior a 2 um). Por conseguinte, o nível normalizado SAS6 permaneceu semelhante nestas células (Figura 3E). No entanto, observou-se um aumento modesto nos valores globais de intensidade de fluorescência de SAS6 e um ligeiro aumento do mesmo para Cep135 em células onde centrossomas são bem separados (distância entre dois centrossomas&gt; 2 m; células &quot;distante&quot;). Por conseguinte, o nível total de centrosomal normalizada SAS6 em células com dois centrossomas bem separados foi ligeiramente, mas significativamente maior do que em células com os centrossomas espaçados. Isto é provavelmente devido à regulação inerente SAS6 nível with progressão do ciclo celular 5. No entanto, é também possível que os aumentos ligeiros (que ou menor de significância estatística) é devido à adição de intensidades de fluorescência das duas centrossomas que foram analisados ​​separadamente, em comparação com a análise de duas centrossomas, ao mesmo tempo em células com os centrossomas espaçados. No entanto, quando a intensidade de fluorescência de VDAC3 foi normalizada para a da SAS6 sozinho, o nível VDAC3 em dois centrossomas espaçados foi aumentada aproximadamente 1,5 vezes em células que estão na fase tardia S-G2 precoce /, em comparação com a fase S precoce células (Figura 4A-C, F, CÉLULAS &quot;fechar&quot;). Quando estas células progridem para fase tardia G2, o nível VDAC3 normalizada em dois centrossomas foi reduzida em 2,4 vezes em relação ao que no final da fase S (Figura 4C, F). Porque os níveis SAS6 aumentar ligeiramente a partir do final da fase S para G2, utilizando SAS6 como um padrão interno leva a uma ligeira sobreavaliação do decrease em níveis VDAC3 em células em fase G2 tardia (centrossomas são separados por mais do que 2 mm). Enquanto os nossos dados sugerem que Cep135 é uma escolha melhor como padrão interno para avaliar as variações do ciclo celular, não podemos usá-lo para VDAC3 porque os anticorpos VDAC3 e Cep135 disponíveis para nós são ambos de coelho. No entanto, multiplicando-se o valor médio para VDAC3 SAS6 normalizada (F VDAC3 / F SAS6) pelo valor médio de Cep135-normalizado SAS6 nos dá um valor aproximado para VDAC3 Cep135 normalizada [(F VDAC3 / F SAS6) x (F SAS6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. Quando realizamos esta análise, a alteração dos níveis VDAC3 entre o final S / G2 precoce e tardia G2 cai um pouco a 2 vezes. Células positivas para BrdU que estão em qualquer fase da mitose como julgado por cromossomos condensados ​​e fraca coloração SAS6 são excluídos da nossa análise, devido à queda dramática nos níveis SAS6. No entanto, observamos que o VDAC3 centrosomal nível reneceu baixo durante a mitose (dados não mostrados). Porque os níveis Cep135 não cair durante a mitose (dados não mostrados), que pode, em princípio, repetir o procedimento de re-normalização para estimar os níveis VDAC3 Cep135-normalizados em mitose. No entanto, na realidade, os níveis SAS6 centrosomal na mitose eram muito variável para permitir uma determinação precisa dos níveis VDAC3 SAS6 normalizados em primeiro lugar. Independentemente disso, em geral, os nossos dados verificou-se que a associação de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52030/52030fig1highres.jpg" /> Figura 1. De forma assíncrona crescentes RPE1 células foram incubadas com BrdU e MG115 (MG) ​​ou DMSO (DM) durante 4 horas. (A) São mostrados campos aleatórios de DMSO ou MG115 tratados células coradas com anticorpo anti-BrdU (vermelho) e Hoechst ( DNA; azul). Aqui e em todas as outras imagens da barra representam 5 m.(SER) ou DMSO MG115 tratado as células foram coradas com anticorpos contra VDAC3, γ-tubulina e BrdU. Células positivas para BrdU foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 ms para azul fluorophore / BrdU; 500 ms para verde fluorophore / VDAC3; 300 ms para fluorophore vermelho / γ-tubulina), eo fundo corrigidos intensidades de fluorescência de VDAC3 e γ-tubulina foram determinados. Imagens representativas mostrando VDAC3 (VD3; verde), γ-tubulina (γ Banheira; vermelho) e BrdU (azul) são mostrados em (B). Aqui e em todas as outras imagens, inserir digitalmente mostram ampliada centrosomes como indicado pelas praças. As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondentes a VDAC3 e γ-tubulina de vinte cinco células são representados graficamente na caixa e suiça diagrama em (C) e (D), respectivamente. Aqui e em todos os outros casos, caixas representam inferior e quartil superior, o marker na caixa (-) indica a mediana de cada série, e os bigodes representam os valores mínimos e máximos. Os valores da intensidade de fluorescência de VDAC3 normalizados provenientes dos vinte e cinco células estão representados em (E). Para (CE), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. *** Indica p &lt;10 -5, e ns indica p&gt; 0,05. (F) Immunoblots mostrando os níveis de células inteiras de VDAC3 (ambos VDAC3a e VDAC3b 16) e γ-tubulina (γ-banheira), onde α-tubulina (α-banheira) está carregando controle. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52030/52030fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52030/52030fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Assincronamente crescentes células RPE1 que foram marcadas com um 4 hr BrdU pulso e perseguido por mais 4 h na ausência de BrdU foram marcadas com anticorpos contra SAS6 (verde) e γ-tubulina (γ Banheira; vermelho). Imagens representativas mostrar coloração SAS6 durante (A) S-fase (com dois perto SAS6 focos), (B) metaphase (dois fraco focos SAS6 nos pólos) e (C) telophase (focos SAS6 são perdidos a partir dos pólos). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52030/52030fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52030/52030fig3highres.jpg" /> Células positivas para BrdU Figura 3. Assincronamente crescentes células RPE1 foram marcadas com um pulso de BrdU 4 horas e perseguido por mais 4 h na ausência de BrdU. Coradas para Cep135 e SAS6 foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 mspara o azul fluorophore / BrdU; 400 ms para fluorophore verde / Cep135; Foram determinados a 500 ms para fluorophore vermelho / SAS6), eo fundo corrigido fluorescência intensidades de SAS6 e Cep135. A distância entre dois centrossomas também foi medido em todas as células. A cela onde a distância entre dois centrossomas é inferior a 2 mm foi considerado como &quot;fechar&quot; e onde o valor é mais do que 2 mm foi categorizado como &quot;distante&quot;. (AB) Imagens representativas mostrando Cep135 (C135; verde), SAS6 (vermelho) e BrdU (azul) são mostrados. Em (B), C1 e C2 são as duas centrossomas da célula representativa &quot;distante&quot;. (CD) As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondente a SAS6 (C) e Cep135 (D) a partir de quinze células de cada categoria estão representados em diagrama e caixa de bigodes. (E) intensidades normalizadas de SAS6 from essas células são plotadas em caixa e diagrama suiça. Para (CE), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. * Indica 0,001 &lt;p &lt;0,05, e ns indica p&gt; 0,05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52030/52030fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52030/52030fig4highres.jpg" /> Figura 4. células BrdU-positivos do ensaio de pulso-chase BrdU acima (Figura 3) corada para VDAC3 e SAS6 foram fotografadas em condições idênticas de imagem (exposição vezes- 400 ms para azul fluorophore / BrdU; 500 ms para fluorophore verde / SAS6; foram determinados 1.000 ms para vermelho fluorophore / VDAC3), eo fundo corrigido fluorescência intensidades de SAS6 e VDAC3. A distância entre dois centrossomas foi medida em todas as células, e as células foram classificados como &quot;cperder &quot;(a distância entre dois centrossomas &lt;2 mm) e&quot; distante &quot;(a distância entre dois centrossomas&gt; 2 m), como na Figura 3. (AC) Imagens representativas de &#39;close&#39; célula em BrdU de pulso (A), em chase BrdU (B), e células &quot;distante&quot; em BrdU perseguição (C) corada para VDAC3 (VD3; verde), SAS6 (vermelho) e BrdU (azul) são mostrados. Em (C), C1 e C2 são as duas centrossomas. [DE] As intensidades de fluorescência de fundo corrigido (F; em unidades arbitrárias) correspondentes a VDAC3 (D) e SAS6 (E) a partir de quinze células de cada categoria estão representados em diagrama e caixa de bigodes. (F) intensidades normalizadas de VDAC3 partir dessas células são plotadas em caixa e diagrama suiça. Para (DF), o valor de p é derivado desemparelhado t-teste. *** Indica p &lt;-5 10, **indica 10 -5 &lt;p &lt;0,001, e ns indica p&gt; 0,05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52030/52030fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K visualizações.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Bioquímica

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Biologia

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Neurociência

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrossomas de imagem na mosca Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...