단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

엔도리소좀 구획(Endolysosomal compartments)은 세포에서 가장 작은 소기관입니다. 기존의 전기생리학적 기법은 전압 및 전류 변화를 직접 측정할 수 없습니다. 엔돌리소좀 패치 클램프 기법을 사용하면 직접 기록이 가능하여 이전에 이온 채널에서 연구할 수 있습니다.

주요 실험적 과제는 모든 화합물이 리소좀을 효과적으로 확대하는 것은 아니라는 것입니다. 적합한 세포를 식별하는 것은 어렵고, 이상적인 리소좀을 사용하더라도 성공적인 이온 채널 기록이 보장되지 않습니다. 우리는 엔도리소좀 막에서 직접 전기생리학적 기록을 가능하게 하는 엔도리소좀 패치 클램프 기술을 개발했습니다.

이 획기적인 발전을 통해 TRPML 및 TPC와 같은 이온 채널을 특성화하여 병원체 방어, 뉴런 변성 및 대사 장애에서 이들의 역할을 밝힐 수 있었습니다. 당사의 방법은 직접 리소좀 이온 채널 기록을 가능하게 하고, 전체 세포 패치 클램프 크기 제한을 극복하고, 형광 기반 기술을 통합하면서 소포 선택을 개선합니다. 시작하려면 모세관 튜브를 극성에 설치하십시오.

키패드의 녹색 당기기 버튼을 누릅니다. CL을 느슨하게amp손잡이를 잡고 극에서 당겨진 피펫을 제거합니다. 다음으로, 당겨진 패치 피펫을 Microforge 홀더에 넣습니다.

35x 대물렌즈와 15x 접안렌즈를 사용하여 총 525x 배율을 사용하여 피펫 팁을 검사합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 패치 피펫을 필라멘트에 가깝게 가져옵니다. 온도 다이얼을 80으로 설정합니다.

히터가 켜지면 풋 스위치를 1-2초 동안 누르고 있으면 짧은 열 펄스가 가해집니다. 연마 후 연마된 피펫을 밀봉된 상자에 넣어 먼지 오염을 방지합니다. 챔버에 1ml의 수조 용액을 추가합니다.

24웰 플레이트에서 처리된 HEK 293 세포가 있는 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 현미경 챔버로 옮깁니다. 집에서 만든 플라스틱 충전 바늘을 사용하여 분리 피펫을 피펫 용액으로 채웁니다.

patch-cl의 앞쪽 끝에 채워진 피펫을 설치합니다.amp 설정. 40x 대물렌즈와 10x 접안렌즈가 있는 현미경 아래에서 분리 피펫을 충분히 확장된 엔도솜 또는 리소좀 가까이로 이동합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 분리 피펫이 원형질막 가장자리에 닿을 때까지 분리합니다.

피펫을 빠르게 움직여 멤브레인의 작은 조각을 떼어냅니다. 동일한 피펫을 사용하여 반대쪽에서 세포를 눌러 세포에서 약 2마이크로미터 떨어진 엔도솜/리소좀을 짜냅니다. 새로 연마한 패치 피펫에 적절한 피펫 용액을 채웁니다.

의 앞쪽 끝에 피펫을 설치하십시오 amp리퍼. 피펫에 20-50mbar의 양압을 가하고 밸브를 잠궈 유지합니다. 다음으로, 피펫 팁을 수조 용액으로 옮기고 시야 중앙에 놓습니다.

반복되는 전류 펄스를 적용하여 피펫 저항, 밀봉 저항 및 직렬 저항을 측정합니다. 피펫 팁 크기, 밀봉 형성 및 전체 endolysosomal 구성 설정을 모니터링합니다. 피펫을 대상 소포의 상단 가까이로 빠르게 이동합니다.

피펫의 유체 흐름으로 인해 소포가 움직이거나 굴러가는 것을 관찰합니다. 피펫의 오프셋 전압을 0밀리볼트로 조정합니다. 즉시 양압을 해제하여 소포를 피펫 쪽으로 끌어당겨 1초 이내에 기가씰을 형성합니다.

전체 소포 기록을 위해 2-5밀리초의 고전압 단락 펄스를 사용하여 피펫과 소기관 사이의 접촉 지점에서 멤브레인을 파괴합니다. 전압을 500밀리볼트에서 1000밀리볼트로 설정합니다. 전류를 기록하려면 광범위한 입력 전압을 사용하여 엔도리소좀 전압 클램프 실험을 수행하여 멤브레인 특성을 평가합니다.

기가씰이 형성되는 동안 전류 반응이 급격히 감소하여 리소좀 부착 모드가 성공적으로 확립되었음을 나타냅니다. 연속 입력 전압을 반복적으로 적용하면 엔도리소좀 멤브레인 전체에 걸쳐 전류가 기록되어 기저전류, 작용제 활성화 전류 및 누설 전류를 보여줍니다.