우리는 관류된 심장에서 갑작스런 내재적 자율 뉴런 활성화의 동역학과 심장 카테콜아민성 및 콜린성 활성 간의 상호 작용을 조사하기 위한 가치 있는 실험적 접근 방식을 제시합니다. 관류된 마우스 심장은 온도, 산소화 및 관류액 농도와 같은 환경 변화에 매우 민감할 수 있습니다. 그들은 더 큰 동물 모델보다 더 면밀한 모니터링이 필요합니다.
또한 마이크로 LED는 일관된 결과를 얻기 위해 처음에는 약간의 시행착오를 거칠 수 있습니다. 우리는 교감신경계와 부교감신경이 동시에 활성화될 때 심장에서 어떤 일이 일어나는지 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 새로운 것은 우리가 심장 자체 내의 심장 신경절과 뉴런을 광자극하기 위해 광유전학을 사용하여 이 주제를 연구하고 있다는 것입니다.
여기에 표시된 마이크로 LED는 저렴하고 복제가 비교적 간단합니다. 마이크로 LED는 크기가 크기 때문에 기동성이 뛰어나며 대형 광원보다 더 정확하게 심장 부위를 겨냥할 수 있습니다. 먼저 환기가 잘 되는 곳에서 해부 현미경으로 두 개의 절연 구리선의 벗겨진 끝을 465나노미터 마이크로 LED의 접점에 납땜합니다.
마이크로 LED를 전원에 연결하고 전원을 켜서 납땜을 테스트합니다. 200마이크로리터 여과된 피펫 팁의 아래쪽을 1cm 자릅니다. 직경이 작은 막대를 사용하여 필터를 밀어냅니다.
전선이 연결된 마이크로 LED를 피펫 팁에 삽입하여 LED가 팁 끝과 같은 높이가 되도록 합니다. 피펫 팁 상단의 필터를 교체하여 LED와 전선을 고정합니다. 그런 다음 LED의 가장자리를 피펫 팁에 초접착합니다.
초강력 접착제를 건조시킵니다. 실리콘 엘라스토머를 준비하려면 용액이 균일해질 때까지 베이스와 경화제를 혼합합니다. 진공 챔버를 사용하여 혼합물에서 기포를 제거합니다.
그런 다음 0.5ml 원심분리기 튜브를 사용하여 측면을 쉽게 제거할 수 있도록 점수를 매깁니다. 누출을 방지하기 위해 원심분리기 튜브 외부를 테이프로 감습니다. 약 0.2ml의 실리콘 엘라스토머를 튜브에 붓습니다.
마이크로 LED 피펫 팁을 튜브에 넣고 LED와 튜브 바닥 사이에 최소 1mm의 공간을 확보합니다. 원심분리기 튜브 micro-LED를 섭씨 50도 오븐에 8시간 동안 또는 밤새 똑바로 세웁니다. 엘라스토머가 경화되면 튜브에서 LED를 제거합니다.
경화되면 정밀 유틸리티 나이프로 LED 팁에서 여분의 엘라스토머를 1mm 이상 남기지 않도록 잘라냅니다. 먼저 175ml의 Krebs-Henseleit 또는 KH 용액을 관류 시스템에 추가합니다. Langendorff 관류 시스템에 10마이크로미터 멤브레인 필터를 배치합니다.
그런 다음 순환을 시작하십시오. 수조를 켜고 관류액 온도를 섭씨 37도로 유지하도록 설정합니다. 유량계를 보정하려면 스톱콕을 사용하여 관류 시스템의 흐름을 중지하십시오.
그런 다음 유량계의 영점 버튼을 눌러 보정을 수행합니다. LabChart 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다. 12개의 채널을 포함하도록 소프트웨어를 구성합니다.
심장 수조 온도, 대동맥 관류액 온도, ECG 리드 1-3에 대한 채널을 설정하여 추가 계산된 리드, 심박수 계산, 유량 및 LED 펄스를 추적하기 위한 함수 생성기 출력을 설정합니다. 그런 다음 심박수에 지정된 채널을 사용하여 심박수를 계산합니다. 순환 측정 기능을 활성화하고 리드 1에서 마우스 ECG를 감지하도록 설정합니다.
LabChart의 Cardiac Access 확장 기능을 사용하여 리드 1과 2를 기반으로 리드 3, aVR, aVL 및 aVF를 계산할 수 있습니다. 마우스를 마취하고 안락사시킨 후 한 쌍의 집게로 xiphoid 과정을 잡고 수술 용 가위를 사용하여 복강을 자릅니다. 횡격막을 조심스럽게 잘라 흉강을 엽니다.
그런 다음 갈비뼈를 잘라 심장과 폐를 노출시킵니다. 부드럽게 폐를 잡고 심장과 폐를 절제합니다. 헤파린화된 KH 용액이 담긴 접시에 심장을 넣습니다.
폐와 큰 지방 침전물을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에서 2배 배율로 설정합니다. 세척된 심장을 헤파린화된 KH 용액의 두 번째 접시로 옮깁니다.
대동맥을 찾아 가는 집게를 사용하여 캐뉼라 위로 밀어 넣습니다. 4-0 실크 봉합사로 캐뉼라에 심장을 고정합니다. 다음으로, 관상동맥 혈관에서 혈액을 제거하기 위해 헤파린화된 KH 덩어리로 캐뉼라를 세척합니다.
캐뉼레이션된 심장을 관류 시스템에 연결하고 관류액으로 채워진 PDMS 접시에 넣습니다. 아인트호벤의 삼각형에 따라 ECG 바늘 전극을 PDMS 접시에 놓습니다. 왼쪽 심방에 접근할 수 있도록 심장을 회전합니다.
마이크로 자동 개방 가위를 사용하여 좌심방에 1mm 절개를 만듭니다. 절개 부위에 직경 1mm의 튜브를 삽입하여 좌심실에 갇힌 관류액이 배출되도록 합니다. 다음으로, 심장을 회전시켜 우심방이 위쪽을 향하도록 하고 동방결절이 조명을 위해 접근할 수 있도록 합니다.
신호 대 잡음비를 개선하기 위해 ECG 전극을 심장에 더 가깝게 이동하여 필요에 따라 조정합니다. 광유전학적 활성화를 위해 마이크로 LED 장치를 함수 발생기에 연결하고 10Hz의 주파수, 30밀리초의 펄스 폭 및 10V 피크 투 피크의 진폭을 가진 맥파를 생성하도록 구성합니다. 마이크로 LED를 동방결절에 부드럽게 놓습니다.
그런 다음 함수 생성기를 켜고 광자극으로 인한 심박수 변화를 관찰합니다. 심박수의 즉각적인 변화는 효과적인 활성화를 나타냅니다. 함수 생성기를 끕니다.
심박수가 활성화 전 수준으로 돌아갈 수 있도록 합니다. 광유전학적 활성화로 인해 심박수 변화가 100BPM 미만인 경우 마이크로 LED의 위치를 변경하여 우심방의 뉴런을 비춥니다. ChAT 뉴런의 광유전학적 자극은 광 자극 중에 심박수를 100BPM 이상 감소시켰으며, 노르에피네프린은 자극 내내 감소를 유지했습니다.
2, 000 나노몰의 노르에피네프린으로 심박수는 40BPM까지 떨어지고 빛이 꺼지기 전에 회복하기 시작했다. ChAT 뉴런 광자극에 의한 심박수의 광유전학적 억제는 높은 노르에피네프린 용량으로 인한 심박수 증가를 극복하는 데 덜 효과적이었으며, 그 결과 억제 시간이 짧아지고 심박수가 더 적게 감소했습니다.
