이 절차의 주요 목표는 다양한 임플란트 표면에서 마이크로파지의 배양 및 특성화와 마이크로세포의 아형에 대한 특성화를 위한 포괄적인 프로토콜을 구현하는 것입니다. 이러한 특성 분석의 일부로 qRT-PCR, EISA 및 CLSM을 포함한 여러 방법이 사용되어 유전자 발현 프로필, 분비 단백질 및 세포 표면 마커를 결정합니다. 그 결과, 마이크로파지와 임플란트 표면을 편광하고 유전자 발현, 분비된 단백질 및 세포 표면 마커를 기반으로 이를 정확하게 식별하는 데 구현된 프로토콜의 유용성과 효과를 보여줍니다.
또한, 마커는 MDM의 다양한 하위 유형을 구별하는 데 사용할 수 있는 반란의 일관되고 구체적인 발현 패턴을 설명합니다. 전반적으로 이 연구는 성공적인 조직 재생 과정을 개선 및 촉진하고, 임플란트 관련 만성 염증을 예방하고, 성공적인 임플란트 통합을 향상시키기 위한 면역 조절 재료의 개발 및 설계에 기여할 것입니다. 먼저 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포를 15ml의 예열된 단핵구 부착 배지에 재현탁하고 T-75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
접착을 위해 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 상등액을 버리고 플라스크를 부드럽게 기울여 부착되지 않거나 느슨하게 부착된 세포를 제거하여 10% FBS와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충한 예열된 RPMI 1640 배지로 세포를 한 번 세척합니다. 부착 세포에 밀리리터당 10나노그램의 대식세포 집락 자극 인자를 포함하는 15ml의 완전한 배지를 첨가합니다.
그리고 분화를 촉진하기 위해 6일 동안 배양합니다. 분화 후 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 10ml의 PBS로 세포를 5분 동안 세척합니다. 부착 세포를 분리하려면 예열 세포 분리 용액 10ml를 넣고 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 분리하고 50ml 튜브로 옮깁니다. 나머지 세포를 분리하려면 플라스크에 PBS 10ml를 넣고 세포를 스크랩합니다. 분리된 셀을 50ml 튜브로 옮깁니다.
분리된 세포 현탁액을 300g에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 버리고 예열된 완전 배지 5ml에 세포를 재현탁합니다. 트리판 블루 염색을 사용하여 혈구계에서 세포를 계수하여 세포 수와 생존력을 측정합니다. 세포 수를 160, 완전한 배지 1밀리리터당 000개의 세포로 조정하여 세포 현탁액을 준비합니다.
다음으로, 생체 재료 디스크를 70% 에탄올에서 5분 동안 초음파로 세척한 다음 70% 에탄올에서 30분 동안 멸균합니다. 티타늄 디스크를 건조시킨 후 처리되지 않은 24웰 플레이트에 넣고 각 웰에 1ml의 준비된 세포 현탁액을 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 48시간 동안 세포를 배양하여 M0 대식세포를 얻습니다.
M1 편광 대식세포를 얻으려면 인터페론 감마와 지질다당류를 24웰 플레이트의 웰에 추가합니다. M2 분극의 경우 인터루킨-4 및 인터루킨-13을 추가합니다. 분극을 유도하기 위해 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.
인간 말초 혈액 단핵 세포에서 편광 단핵구 유래 대식세포를 얻은 후 1.5ml 튜브에 세포 상층액을 수집합니다. 티타늄 디스크를 새 24웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 상등액을 300g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
사이토카인과 케모카인을 450나노미터에서 제조업체가 제공한 특정 지침에 따라 측정합니다. 표준 곡선을 사용하여 분비된 사이토카인 또는 케모카인의 농도를 계산합니다. bicinchoninic acid protein assay kit를 사용하여 총 단백질 양을 측정합니다.
분비되는 단백질의 농도를 총 단백질의 밀리그램으로 정상화합니다. 편광된 대식세포를 800마이크로리터의 PBS에서 두 번 세척합니다. 디스크를 실온에서 20분 동안 400마이크로리터의 고정 완충액에 배양합니다.
정착 완충액을 제거한 후 400마이크로리터의 PBS에서 디스크를 세 번 세척합니다. 이제 400마이크로리터의 차단 버퍼로 디스크를 30분 동안 배양하여 불특이적 결합 부위를 차단합니다. 차단 완충액을 버리고 400마이크로리터의 염색 완충액에 희석된 1차 항체로 디스크를 1시간 동안 배양합니다.
1시간 후 1차 항체를 제거하고 400마이크로리터의 세척 버퍼로 디스크를 세 번 세척합니다. 염색 완충액에 희석된 표지된 2차 항체에 대한 형광을 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 세척 버퍼에서 샘플을 각각 3분씩 3회 세척합니다.
PBS에 10 밀리몰 DRAQ5를 넣고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 PBS로 디스크를 한 번 씻습니다. 장착 매체 한 방울을 넣고 5분 후에 커버 안경을 바르고 샘플을 1시간 동안 건조시킵니다.
건조 후에는 투명한 매니큐어로 가장자리를 밀봉하십시오. 세포의 개요를 얻으려면 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에서 25X 배율로 샘플을 이미지화합니다. 배율을 63X로 변경하여 표면 마커의 구조와 위치를 확인합니다.
1차 단핵구 유래 대식세포는 티타늄 표면에서 M1 및 M2 대식세포로 성공적으로 분극되었으며, CCR7은 M1 대식세포에서, CD209는 M2 대식세포에서 더 강하게 발현되었습니다. qRT-PCR 분석은 M1의 경우 CCR7 및 TNF-alpha, M2의 경우 CD209 및 CCL13의 높은 발현으로 티타늄 및 커버 슬립 표면 모두에서 1차 단핵구 유래 대식세포의 성공적인 분극화를 보여주었습니다. 높은 수준의 염증성 TNF-알파 사이토카인과 CCL13 케모카인은 단백질 수준에서 M1 및 M2 분극을 확인했습니다.
