생물막 형성 미생물은 낙농 산업을 포함한 식품 산업의 주요 문제입니다. 제품의 품질에 부정적인 영향을 미치기 때문에 생물막 제어 전략을 개발하는 것이 중요합니다. 이 접근 방식은 정적 고처리량 스크리닝 방법과 현장 조건을 모방하는 동적 방법을 결합합니다.
이 두 가지 방법은 생물막에 대한 소독제의 효능을 연구하는 데 상호 보완적입니다. 이 접근법은 식품, 의료 또는 환경 부문에서 생물막을 제어하기 위해 새로운 생물학적 또는 화학적 제형을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. Pseudomonas azotoformans 박테리아 배양 튜브를 vortexing하여 시작하십시오.
100 마이크로리터의 박테리아 배양물을 10 밀리리터의 멸균 트립신 대두 브로스 또는 TSB 배지로 무균적으로 옮겨 밀리리터당 약 2배의 10 내지 7번째 CFU의 최종 농도를 달성한다. 배양 튜브를 소용돌이. 이어서, 다채널 피펫을 이용하여, 희석된 박테리아 배양물 150 마이크로리터를 생물막 마이크로타이터 플레이트 웰에 3배로 옮긴다.
150마이크로리터의 TSB 배지를 대조군으로 3개의 새 웰에 로드합니다. 다음으로, 생물막 마이크로타이터 플레이트를 섭씨 30도에서 교반 없이 24시간 동안 배양한다. 마그네틱 바에 의해 홀더에 부착 된 1 리터 유리 비커 안에 평평한 블레이드를 넣기 전에 생물 반응기의 부품을 청소하고 자연 건조시킵니다.
바이오리액터 뚜껑의 안쪽에 부착된 플라스틱 막대를 사용하여 설정을 똑바로 유지합니다. 드라이버를 사용하여 스테인리스 스틸 쿠폰이나 슬라이드를 폴리프로필렌 막대에 놓습니다. 쿠폰이나 슬라이드를 노치에 정렬 핀을 넣지 않고 뚜껑의 구멍에 삽입하여 살균 중에 증기가 빠져나갈 수 있도록 합니다.
모든 생물 반응기 통풍구를 알루미늄 호일로 덮고 나머지 장비, 즉 크기 18 튜브 및 크기 16 튜브, 유리 흐름 브레이크, 용기 캡, 드라이버, 집게 및 0.2 마이크로 미터 필터를 알루미늄 호일로 감 쌉니다. 섭씨 121도에서 20분 동안 건조 사이클로 설정된 생물반응기를 오토클레이브합니다. 배치 모드에서 생물막 형성의 첫 번째 단계를 수행하려면 생물 안전 캐비닛 내부에서 크기 18 튜브의 한쪽 끝을 생물 반응기의 출구 스파우트에 연결하고 다른 쪽 끝을 알루미늄 호일로 싸서 유지합니다.
바이오리액터 뚜껑으로부터 하나의 쿠폰 또는 슬라이드 홀더를 제거하고, 멸균된 50 밀리리터 튜브에 넣는다. 이어서, 50 밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여, 로드에 의해 점유된 구멍을 통해 300 밀리리터 TSB 배지의 340 밀리리터로 생물반응기 비커를 채운다. 생물 반응기에서 배양 배지를 접종하기 위해, 5 밀리리터 피펫을 사용하여 오리피스를 통해 밀리리터 당 8 번째 CFU에 10 밀리리터의 슈도모나스 아조 토 포르만스 박테리아 용액을 첨가하고 막대를 원래 위치로 되돌린다.
핀이 각 노치에 맞도록 덮개 구멍에 이미 배치된 막대를 배치합니다. 그런 다음 바이오리액터 뚜껑에 있는 가장 작은 직경의 튜브 끝에 0.2마이크로미터 박테리아 공기 퍼지 필터를 놓습니다. 동일한 직경의 다른 튜브는 금속 나사 캡 또는 단단히 닫히는 실리콘 플러그로 영구적으로 막힌 상태로 유지됩니다.
섭씨 30도로 설정된 가열판 위에 생물반응기를 24시간 동안 놓고 130RPM으로 교반합니다. 24시간 후, 연속 흐름 모드로 생물반응기에서 생물막 형성의 제2 단계를 수행한다. 18리터의 멸균 증류수가 들어 있는 카보이를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
그런 다음 리터당 1000 밀리그램의 TSB 배양 배지 2 리터를 첨가하여 리터당 100 밀리그램의 최종 농도를 얻습니다. 두 개의 튜브가 연결된 멸균 캡으로 용기를 덮으십시오. 첫 번째는 매체를 펌핑하기 위해 캡의 인터페이스에 고정된 실리콘 튜브입니다.
두 번째는 크기 16 튜브가 외부 포트에 연결되어 액체가 바이오리액터로 흐를 수 있도록 합니다. 크기 16 튜브를 유리 흐름 브레이크의 끝단에 연결한 후 후자를 생물 반응기 뚜껑의 가장 큰 튜브에 다른 쪽 끝으로 삽입한 다음 연동 펌프에 크기 16 튜브를 설치합니다. 또 다른 20리터 카보이를 사용하여 생물 반응기에서 폐수를 수집합니다.
생물 반응기 배출구에 연결된 튜브의 끝을 폐기물 용기의 캡에 부착합니다. 이 용기의 뚜껑에 있는 튜브에 0.2마이크로미터 필터를 삽입합니다. 완료되면 분당 11.3밀리리터의 유량으로 연동 펌프를 시작하고 시스템을 24시간 동안 작동 상태로 두십시오.
24 시간 후, 연동 펌프를 끄고 바이오 리액터의 교반 및 가열을 중지하십시오. 박테리아 생물막을 회수하려면 40 밀리리터의 PBS에서 쿠폰 또는 슬라이드를 헹구어 플랑크톤 박테리아를 제거하십시오. 그런 다음 40 밀리리터의 PBS가 들어있는 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 방출합니다.
30 초의 볼텍싱 후, 튜브를 40 킬로 헤르츠에서 30 초 동안 초음파 처리합니다. 이것을 세 번 반복하십시오. 완료되면 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 40 밀리리터의 생물막 현탁액을 수집하고 두 개의 멸균 PBS 용액으로 쿠폰 또는 슬라이드를 헹굽니다.
이 헹굼 액체를 회수하여 이미 수집 된 생물막 현탁액에 첨가하십시오. 섭씨 30도에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼냅니다. 200 마이크로리터의 PBS를 96-웰 마이크로플레이트의 3개의 웰에 첨가한다.
생물막을 세척하고 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해, 못 상에 형성된 생물막이 있는 생물막 마이크로플레이트의 뚜껑을 PBS가 들어 있는 96-웰 마이크로플레이트로 10초 동안 옮긴다. 필요한 농도의 소독제를 준비하고 각 소독제 농도의 200마이크로리터를 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 세 번 추가합니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 소독제가 들어 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트 위로 옮기고 원하는 노출 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
다음으로, 200 마이크로 리터의 Dey-Engley 중화 브로스를 새로운 96 웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 첨가하십시오. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 중화 브로스가 들어 있는 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다. 마이크로타이터 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 30분 동안 40킬로헤르츠의 수조 초음파 처리기에 넣습니다.
30분 후, 초음파 처리된 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 100마이크로리터의 분리된 생물막을 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 행으로 옮깁니다. 그런 다음 첫 번째 행을 제외하고 180 마이크로리터의 멸균 PBS를 96웰 플레이트에 추가합니다. 다음에, 20 마이크로리터의 생물막 용액을 제1 열로부터 180 마이크로리터의 PBS를 함유하는 제2 열의 웰로 옮겨 희석 10을 마이너스 1로 달성한다.
그런 다음 두 번째 줄에서 다음 줄의 우물로 20 마이크로 리터를 옮겨 10에서 2를 뺀 희석을 달성하십시오. 이것을 반복하여 10에서 마이너스 5 사이와 10에서 마이너스 7 사이의 희석을 얻습니다. 원하는 희석액 100마이크로리터를 TSA에 접종하고 박테리아의 성장 매개변수에 따라 플레이트를 배양합니다.
바이오리액터 내의 쿠폰 상에 슈도모나스 아조토포르만스 PFLA 1 생물막을 형성하고, 쿠폰을 담고 있는 막대를 제거하고, 30 밀리리터의 PBS를 함유하는 원뿔형 튜브 내부의 막대를 헹구어 플랑크톤 세포를 제거한다. 드라이버를 사용하여 각 쿠폰을 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 떨어 뜨립니다. 그런 다음 대조군을 위해 적절한 유기 퍼옥시산 용액 또는 PBS 4밀리리터를 추가합니다.
배양 5 분 후, Dey-Engley 중화 국물 36 밀리리터를 첨가하십시오. 원뿔형 튜브를 30 초 동안 볼텍싱 한 후 40 킬로 헤르츠에서 30 초 동안 초음파 처리합니다. 이 과정을 3회 반복하여 생물막 현탁액을 얻었다.
다른 막대에 대해 동일한 절차를 반복하고, 생물막 현탁액의 연속 망상을 준비하고, 앞에서 설명한 대로 TSA 배지에 현탁액을 플레이트합니다. SCM 분석은 슈도모나스 아조토포르만스 PFL1A에 의한 생물막 마이크로플레이트 못 상의 생물막의 존재를 보여주었다. 바이오리액터를 이용하여 스테인리스 스틸 슬라이드 상에 형성된 슈도모나스 아조토포르만스 PFL1A 바이오필름은 매우 치밀하게 나타났으며, 성숙한 3차원 바이오필름의 형태학적 특성을 나타내었다.
동적 시스템에서 이 분리주에 의해 개발된 생물막의 박테리아 계수 결과는 TSB 배양 배지에서 제곱당 8.74 log CFU 및 멸균 탈지유에서 제곱당 7.86 log CFU 센티미터 제곱에 해당하는 상당한 세포 밀도를 보여주었습니다. B.vesicularis 분리 물로 얻은 결과는 영양소 농도가 리터당 100에서 900 밀리그램으로 증가하면 생물막의 박테리아 수가 6.11에서 8.71 log CFU 센티미터 제곱으로 증가한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 유속이 분당 6.0밀리리터로 감소되었을 때 상당한 생물막 성장이 관찰되었으며, 이는 특정 요인이 생물반응기 내의 생물막 형성에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다.
생물막에는 유기 과산화 산과 500 ppm 및 100, 000 ppm의 접촉 시간에 검출 가능한 생존 세포가 포함되어 있지 않았으며, 과산화수소 농도의 소독제는 일반적으로 낙농 식물에 적용되었습니다. SCM은 처리되지 않은 최소 생물막 박멸 농도 또는 MBEC 생물막의 3차원 구조를 보인 반면, 처리된 MBEC 생물막은 3차원 형태를 잃었습니다. 이 프로토콜을 수행하는 동안 무균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.
또한 사용자는 생성된 결과가 고유한 격리 및 소독제와 관련이 있음을 기억해야 합니다. 소독제와 기계적 진동, 초음파 또는 효소 처리를 병용하면 생물막 박멸의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 생물막을 형성하기 위해 정적 및 동적 방법을 사용하는 이 접근 방식은 연구자들이 다양한 분야에서 생물막을 더 잘 제어하기 위해 새로운 항생물막 제형을 선별하고 연구할 수 있는 길을 열었습니다.
