세포 행동에 대한 미세 환경 요인의 영향은 종종 단일 단서를 분리하는 지나치게 단순화 된 in vitro 플랫폼을 사용하여 연구됩니다. 우리의 접근 방식은 이러한 여러 단서를 결합하는 세포 배양 기질을 만듭니다. 이 접근법은 매우 다재다능하며 다양한 세포 배양 물질, 접촉 유도 패턴, 세포 판독 및 단백질을 사용하여 체계적인 연구를 가능하게합니다.
이 절차는 우리 실험실의 두 PSE 후보자가 시연합니다. CAS VAN DER PUTTEN, MIRKO D'URSO 먼저, 관심있는 모든 기능을 포함하는 펨토초 레이저 직접 오른쪽 기술을 사용하여 네거티브 유리 몰드를 만듭니다. 그런 다음 페트리 접시 바닥에 음극 유리 몰드를 조심스럽게 놓고 폴리디메틸실록산 프리 폴리머를 네거티브 유리 몰드 위에 부어 완전히 덮습니다.
이 페트리 접시를 진공 데시케이터에 넣고 진공 펌프를 시작합니다. 진공이 달성되면 5분 동안 기다렸다가 금형 표면과 폴리디메틸실록산 프리폴리머 사이의 계면에 존재하는 모든 기포를 제거합니다. PDMS 프리폴리머를 섭씨 65도의 오븐에서 밤새 경화시킵니다.
경화 후 주걱을 사용하여 PDMS의 가장자리를 들어 올립니다. 음극 유리 몰드에서 새로 경화된 포지티브 PDMS 칩을 제거하고 포지티브 PDMS 칩이 네거티브 유리 몰드에 달라붙는 경향이 있는 경우 들어 올리면서 임프린트 가장자리에 에탄올 또는 물을 추가합니다. 그런 다음 포지티브 폴리디메틸실록산 칩을 실란화제 방울이 있는 작은 바이알 옆의 데시케이터에 넣고 칩을 밤새 진공 상태로 둡니다.
PDMS 프리 폴리머를 네거티브 PDMS 몰드에 부어 5mm 두께의 여러 세포 배양 칩을 생성합니다. 다음으로 데시케이터를 사용하여 기포를 제거하고 섭씨 65도에서 3시간 동안 경화합니다. 면도날을 사용하여 칩을 최종 크기로 자르고 칩을 실온에서 보관하십시오. 핀셋을 사용한 기판 패시베이션의 경우 칩을 플라즈마 Asher의 바구니에 넣으십시오.
그런 다음 산소 플라즈마를 사용하여 칩 표면의 수산기를 활성화하고 질소를 사용하여 애싱 챔버를 배출합니다. 바구니에서 칩을 꺼내 작은 폴리디메틸실록산 용기에 넣습니다. 이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 칩 상단에 500마이크로리터의 Poly-L-라이신을 추가하여 표면을 용액에 완전히 담그고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
이어서, 피펫으로 세포 배양 칩으로부터 450 마이크로리터의 Poly-L-lysine을 제거한다. 다음으로, 칩 표면을 500 마이크로 리터의 0.1 몰 HEPES 버퍼로 헹굽니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 폴리디메틸실록산 칩에 소량의 액체를 남겨 최종 패턴 품질을 유지합니다.
사용 직전에 세포 배양 칩 당 0.1 몰 힙 버퍼에 밀리리터 당 50 밀리그램의 메 톡시 폴리에틸렌 글리코 시아 나미 달 발레 레이트 용액 500 마이크로 리터를 준비하고 60 분 동안 샘플을 배양합니다. 마이크로 피펫을 사용하여, 450 마이크로리터의 메톡시 폴리에틸렌 글리코시아나미달 발레레이트 용액을 제거한다. 칩 표면을 PBS로 5회 피펫팅 안팎으로 세척합니다.
결합되지 않은 모든 mPEG-SVA를 제거합니다. 형광등 형광펜이 있는 유리 슬라이드를 현미경의 광학 경로에 놓습니다. 현미경에서 형광 모드로 전환하고 프리모 이미지의 초점을 조심스럽게 맞추어 로고와 텍스트에 모두 초점이 맞춰지도록 합니다.
다음을 클릭하면 교정 데이터와 패턴을 확인하여 교정 절차를 마칠 수 있습니다. 교정할 때 스테이지의 Z 위치를 기록하고 이 위치를 나중에 프로토콜의 참조로 사용합니다. 스테이지로부터 보정 슬라이드를 꺼낸 후 상기 광개시제의 액적이 들어 있는 유리 슬라이드를 상기 스테이지 위에 놓고 PDMS 세포 배양 기판을 거꾸로 놓은 후, 상기 광개시제 액적에 놓는다.
세포 배양 기판 표면의 3D 특징이 유리 슬라이드를 향하고 광 개시제에 완전히 잠겨 있는지 확인하여 적절한 패터닝을 보장합니다. 볼록 또는 오목한 구조의 상단 또는 하단에 각각 초점을 맞추고 원고에 설명 된대로 올바른 위치에있는 칩 영역에 초점을 맞 춥니 다. 기능에 따라 패터닝 설정을 조정하고 밀리리터당 1000밀리줄의 용량을 선택합니다.
화면 오른쪽 하단의 재생 버튼을 클릭하여 패터닝을 시작합니다. 완료되면 녹색으로 표시된 패턴을 관찰하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 20 밀리리터의 PBS를 20 마이크로 그램의 로다민 표지 된 피브로넥틴 바이알에 추가하여 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 농도를 얻습니다.
단백질 덩어리를 피하고 빛으로부터 보호하기 위해 부드럽게 피펫하십시오. 마이크로피펫을 사용하여, 200 내지 500 마이크로리터의 단백질 용액을 세포 배양 칩에 첨가한다. 선택한 단백질에 따라 배양 시간과 온도를 조정하고 샘플을 덮으십시오.
단백질 용액을 제거하고 칩을 500 마이크로리터의 멸균 PBS로 5회 세척한다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세포 배양 칩의 모든 관련 기능 위에 PBS를 위아래로 여러 번 피펫팅해야 합니다. 세포 현탁액이 준비되면 PBS를 제거하고 세포 현탁액 1 밀리리터를 칩에 첨가합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 60 분 동안 배양하십시오. 패턴 세포 배양 칩 상의 세포의 부착성을 명시야 현미경으로 확인하였다. 선 패턴의 경우 길쭉한 세포 형태를 찾으십시오.
그리고 세포가 패턴화된 영역 외부에 부착되기 시작하면 기질의 세포 바로 위에서 배지를 위아래로 피펫팅하여 제거합니다. 염색 후 염색된 샘플을 유리 슬라이드의 PBS 방울에 거꾸로 놓습니다. 그런 다음 필요한 디테일 수준에 따라 적절한 이미지 획득을 보장하기 위해 적절한 대물렌즈와 Z 간격으로 Z 스택을 만듭니다.
3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 Z 스택의 3D 렌더링을 생성합니다. 단백질의 광 유도 분자 흡수를 사용하여 오목한 피트를 패턴화하고 최대 강도 투영 및 직교도를 시각화했습니다. 강도 프로파일은 패턴화된 영역과 패턴화되지 않은 영역 사이의 높은 패턴 분해능의 날카로운 전환과 일관된 단백질 강도를 보여주었습니다.
단일 초점면과 2 및 3 초점면 방법을 사용한 패터닝은 특징 위에 패턴의 완벽한 정렬을 보여주었습니다. 오목한 반 실린더, 볼록한 반 실린더, 안장 표면 및 PID는 다양한 너비의 선 또는 동심원을 사용하여 패턴화되었습니다. 인간 각질 세포의 골격 내부의 영향은 엽면을 사용하여 염색되고 시각화됩니다.
진피 섬유아세포를 패턴화된 오목한 세미 실린더 상에서 배양하고 시각화하였다. 세포는 다중 큐 세포 배양 기질을 감지하고 부착했으며 F-액틴, 빈쿨린 및 핵에 의해 시각화된 대로 시간이 지남에 따라 생존 가능한 상태를 유지했습니다. 또한, 세포는 주로 피브로넥틴 라인에 초점 유착을 형성했다.
로다민 피브로넥틴의 존재하에 패턴화된 오목한 실린더 상에서 배양된 인간 진피 섬유아세포는 다중 큐 기질에 부착되고 접촉 유도 패턴에 따라 정렬 반응을 보였다. 정렬 반응 및 세포 생존율은 전체 배양 기간 동안 유지됩니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 가장 중요한 것은 세포 배양 칩의 표면이 마르는 것을 방지하는 것입니다.
다양한 기질 재료, 단백질 코팅 및 세포 유형을 사용하려면 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 3D로 여러 환경 신호를 제공하면 복잡한 엔지니어 조직에서 세포 조직을 조정할 수 있는 새로운 가능성이 열릴 수 있습니다.
