이 프로토콜은 성인 얼룩말피에서 확장 가능한 무딘 힘 외상성 뇌 손상을 유도하는 간단하고 빠르며 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 무딘 힘 외상성 뇌 손상을 겪는 성인 얼룩말 물고기는 무딘 힘 TBI로 고통받는 인간에서 관찰 된 많은 특성을 나타냅니다. 절차를 시연하는 것은 제임스 헨티그 씨와 제 실험실에서 박사 과정 학생 두 명인 Kaylee Cloghessy 씨가 될 것입니다.
먼저 페트리 접시에 모델링 점토를 채우는 것으로 시작합니다. 그런 다음 손가락이나 한 쌍의 집게 뒷면을 사용하여 추가 모델링 점토가있는 제기 플랫폼을 만듭니다. 제기된 플랫폼을 면도날을 사용하여 약 2개의 약 반쪽으로 세로로 나눕니다.
두 반쪽을 채널로 구성하여 성인 물고기의 길이를 수용합니다. 추가 점토를 사용하여 벽을 구축하여 머리가 노출된 물고기 몸체의 2/3을 확보하십시오. 부상 시 헤드의 회전이나 반동을 피하기 위해 벽에 수직으로 노출된 헤드 부위에 작은 지지체를 성형합니다.
채널의 측면이 감소된 무게를 방해하지 않도록 합니다. 미니 홀 펀치를 사용하여 22 게이지 스틸 깜박임에서 3mm 스틸 디스크를 만듭니다. 마취된 물고기는 등쪽을 위로 업하여 수로 내의 점토 몰드에 꼬리 꼬집어 반응하지 않고 몸에 고정되도록 합니다.
원하는 충격점을 중심으로 3밀리미터 22게이지 스틸 디스크를 머리에 놓습니다. 물고기가 수직으로 정렬하여 머리가 한쪽으로 기울어지지 않도록 하여 고르지 못한 영향을 줄 수 있습니다. 표준 링 스탠드와 암 클램프를 사용하여 강철 또는 플라스틱 튜브를 고정하여 직선이 되도록 하여 튜브의 바닥이 제브라피시 머리 위로 1.5cm 높이입니다.
튜빙을 내려다보며 강판 위에 정렬되도록 합니다. 부상의 원하는 심각도에 따라 적절한 볼 베어링을 선택합니다. 소정의 높이에서 강판에 튜브를 떨어 뜨립니다.
그런 다음 부상당한 물고기를 복구 탱크에 배치하여 모니터링합니다. 페트리 접시에 모델링 점토를 채우고 해부 중에 몸을 지탱할 수 있는 작은 캐비티를 만듭니다. 등쪽면을 위로 올려 놓고, 물고기를 점토 몰드에 놓습니다.
두 개의 해부 핀을 배치, 하나는 몸중간을 통해 다른 약 5 머리의 기지 뒤에 밀리미터. 5 개의 Dumont 집게 를 사용하여 시신경을 무뚝뚝하게 끊고 눈을 제거하십시오. 오른쪽 정수리 플레이트 아래에 5 개의 집게의 한쪽 끝을 놓습니다.
고의적인 가위 동작이 로스트랄 끝으로 이동하고 오른쪽 정면 플레이트를 제거합니다. 그런 다음 물고기를 시계 방향으로 90도 회전시합니다. 왼쪽 정수리 플레이트 아래에 5 개의 집게의 한쪽 끝을 놓고 동일한 가위 동작을 사용하여 왼쪽 정수리 및 전두엽 판을 제거하여 뇌의 전체 등쪽 측면을 노출시합니다.
5 개의 집게를 사용하여 후각 전구가 보존되고 손상되지 않도록 맥실라를 무뚝뚝하게 변형시하십시오. 동일한 포셉을 사용하여 오른쪽 오퍼클, 프리오퍼클, 인터로퍼클 및 스보퍼클을 제거합니다. 그런 다음 칼바륨의 caudal 끝에 있는 근육을 무뚝뚝하게 절제하여 척수를 노출시합니다.
집게를 사용하여 척수를 무뚝뚝하게 변질합니다. 집게를 조심스럽게 뇌 아래에 놓고 칼바륨에서 뇌를 부드럽게 제거합니다. 텍스트 원고의 지침을 사용하여 전체 뇌 또는 관심 영역을 해부하고, 미세 한 집게를 사용하여 작은 계량 보트에 즉시 뇌를 배치, 찌르거나 뇌를 긁어하지 주의.
타르 건조 계량 보트에 뇌를 전송하고 뇌의 젖은 무게를 기록합니다. 등쪽을 향한 등무게 보트에 평평하게 놓기 위해 뇌를 지향합니다. 그런 다음 뇌와 건조 계량 보트를 8시간 동안 섭씨 60도로 설정하여 혼성화 오븐에 놓습니다.
건조되면 새로운 타르작은 계량 보트로 뇌를 옮기려면 미세한 집게를 함께 꼬집어 뇌의 복부 측면에서 시작하여 위쪽으로 움직입니다. 젖은 스폰지에 부분 절개를합니다. 복부 측으로 개구부에서 한 번에 한 마리의 물고기를 놓고 30 게이지 바늘을 사용하여 10 밀리머 EdU의 약 40 마이크로 리터를 물고기의 몸에 주입하십시오.
그런 다음 물고기를 시스템 물로 채워진 지주 탱크로 되돌려 보입니다. 앞에서 언급한 바와 같이 뇌를 수집하고, 9부 100%에탄올의 2밀리리터를 함유한 9밀리리터 유리 바이알에 그룹으로 배치하여 37%의 포름알데히드에 배치한다. 로커 플랫폼에서 섭씨 4도에서 뇌를 수정합니다.
냉동 척을 사용하여 TFM에 뇌를 건조 얼음의 원하는 방향으로 포함시킵니다. 혈관 부상이 모델을 통해 성공적인 부상을 식별하기 위해 가장 쉽고 눈에 띄는 병리학 중 하나인 것으로 나타났습니다. 손상 중에 사용되는 물고기의 변형으로 변경 된 표시기를 식별하는 기능.
야생형 AB의 혈관 손상 식별은 색소 침착으로 인해 온화하거나 적당한 TBI와 손상되지 않은 대조군 어류를 구별하기가 어려웠습니다. 부상 후, 온화한 TBI 물고기는 최소한의 표면 찰과상을 표시하고, 적당한 TBI 물고기는 제한된 뇌 출혈을 나타냈다. 부상의 정도는 심한 TBI 물고기에서 명백했다.
대조적으로, 혈관 상해는 albino 또는 Casper 물고기를 사용할 때 쉽게 확인할 수 있습니다. 부상으로 인한 뇌의 붓기는 부종을 사용하여 평가되었다. 대조적으로, 적당한 TBI와 가혹한 TBI는 중요한 부종, 1 dpi 및 3 dpi를 가지고 있었습니다, 그러나 적당한 TBI와 가혹한 TBI둘 다의 유체 함량은 5 dpi에 의해 손상되지 않은 통제를 닮은 수준으로 돌아왔습니다.
이 무딘 힘 부상 신경 축에 걸쳐 강력한 세포 증식 응답 결과. 증가된 EdU 라벨링은 손상되지 않은 컨트롤에 비해 전뇌의 심실 및 심실 영역에서 관찰되었다. 부상당한 두뇌는 손상되지 않은 물고기 두뇌에 비해 심층 회색 영역, 광학 섬유 엽 및 전방 시상 하부의 양상에서 증가 EdU 라벨을 표시했습니다.
가혹한 TBI에 따라, 힌드뇌에 있는 신경 생성 지구는 손상되지 않은 두뇌에 비해 증가한 세포 증식을 전시했습니다. 부상의 적절한 유도를 위해, 물고기가 곰팡이에 고정되고 안정되어 있는지 확인하고, 튜브가 센터 의 충격을 피하거나 체중 방울 궤적을 변경하기 위해 직선인지 확인하십시오. 이 절차는 반복적인 머리 외상 또는 상해 유도한 재생 연구에 특히 적용될 재생 모형에 적용된 신속하고 비용 효과적인 무딘 힘 상해 유도 방법을 제공합니다.
