이 프로토콜은 간 steatosis뿐만 아니라 간, 대사, 합성 및 steatosis의 맥락에서 독소 경로의 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 재현성과 결과를 얻는 데 필요한 짧은 시간입니다. 그것은 steatosis의 두 가지 수준을 제공 한다는 사실에 추가, 온화 한, 그리고 심한.
체외 유도 된 steatosis 질병의 진단에 대 한 잠재적인 마커의 식별에 대 한 증거를 제공할 수 있습니다., 치료 대상 뿐만 아니라. 이 방법은 스테토시스 결과에 적용되어야 합니다. 그러나, 그것은 지질 과다 노출에 의해 영향을 받는 다른 세포의 넓은 범위에 조정할 수 있습니다., 비만 과 지질 동안 처럼.
표준 RPMI 1640을 준비합니다. 열 활성화 FBS의 10%,페니실린 연쇄상구균용액1%를 갖춘 RPMI 1640 배양 배지를 보충합니다. 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 살균하고 섭씨 4도에 보충을 저장합니다.
팔미타테 스톡 솔루션을 준비하려면 지질 무료 BSA의 1%로 보충된 표준 RPMI 1640에서 팔미타테 50 밀리머 솔루션을 준비합니다. 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 스톡 솔루션의 약 5~10밀리리터를 살균하고 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 보관하십시오. oleate 스톡 솔루션을 준비하려면 보충 된 RPMI 1640에서 올레아테의 50 밀리 마일라 솔루션을 준비하십시오.
그리고 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 스톡 솔루션을 살균합니다. 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호받아 영하 20도까지 보관하십시오. 이전에 준비된 주식으로부터 스테토겐성 배지를 준비하려면 1부 팔미타트와 2부 올레아테의 50 마이크로몰라 믹스 100mm를 준비한다.
온화한 수준에 대 한, 1 부 팔 미 테의 500 마이크로 몰러 혼합 및 표준 RPMI1640에서 심각한 수준에 대 한 두 부분 올레아테. 그리고 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 살균. 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오.
대안적으로, 자유 지질 알부민을 사용하여 각각의 지방산으로 재고 용액을 준비하고, 절대 에탄올의 2밀리리터에 팔미타테 또는 올레아테를 용해한 다음 표준 RPMI 1640의 최종 부피에 섞는다. 표준 RPMI 1640 배양 배지에 저장하여 oleate를 직접 용해하십시오. 섭씨 70도에서 수조에서 배양하여 에탄올의 증발을 허용하고 철저히 섞습니다.
0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 두 스톡 솔루션을 모두 살균하고 팔미타테 스톡 솔루션을 섭씨 4도에 보관하십시오. 그리고 영하 20도의 재고 용액을 올레아트. 24웰 플레이트에 잘 당 0.1 백만 Hep G2 셀을 시트.
표준 RPMI 1640의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 동안 사전 배양하여 세포 부착을 허용합니다. 사전 배양 후 표준 RPMI 1640 배지를 폐기하십시오.
그리고 스테토제닉 배지를 추가합니다. 상체를 버리고 24 시간마다 신선한 steatogenic 배지를 추가하십시오. 생존력 및 형태 학적 평가를 수행하려면 0.05 %의 트립신 EDTA의 500 마이크로 리터를 추가하여 우물에서 슈퍼 나탄 및 분리 세포를 폐기하십시오.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분간 배양합니다. 마이크로 튜브에서 재중단 된 세포를 수집합니다. 그리고 원심분리기는 300배 G.Then에서 상퍼를 버리고, 표준 RPMI 1640의 200 마이크로리터를 추가하고, 세포를 다시 중단한다.
신선한 마이크로 튜브에 트립팬 블루 용액의 0.4 %의 15 마이크로 리터를 추가합니다. 이전 셀 서스펜션의 15 마이크로리터를 넣고 섞는다. 혈종계에 얼룩진 비염색세포와 비염색세포를 계산하고 생존율과 사망률을 계산합니다.
텍스트 원고에 설명된 바와 같이 24웰 플레이트및 시드 Hep G2 세포에 있는 모든 웰에 세포 배양 커버 슬립을 넣습니다. 적절한 인큐베이션 후, PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻고 상체를 폐기하십시오. PBS에서 4%의 파라포름알데히드 1밀리리터와 섞고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
여분의 파라포름알데히드를 버리고 증류수 1밀리리터로 세포를 헹구십시오. 그런 다음 70%의 밀리리터를 넣고 5분간 배양합니다. 여분의 이소프로판올을 버리고 오일 레드 O 용액 1밀리리터를 넣고 30분 동안 배양합니다.
여분의 오일-레드 O 용액을 폐기한 다음 증류수 1밀리리터로 헹구십시오. 400x배율로 현미경의 밑에 세포를 관찰한다. 웰의 전체 영역에서 10개의 광학 필드의 사진을 무작위로 선택하고 캡처합니다.
모든 웰에 대한 이미징을 반복합니다. 빨간색 스테인드 영역의 백분율을 평가하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 열고 필요한 파일을 가져온 다음 조정을 클릭하고 색상 임계값"도구를 사용하여 빨간색 색상 감지를 위한 색조 매개 변수를 정의합니다. 그런 다음 이미지의 채도와 밝기를 조정합니다.
스테인드 영역을 광학 분야의 전체 영역과 비교하여 입자 분석"도구를 사용하여 모든 웰의 평균 백분율을 계산합니다. 24웰 플레이트에 우물당 010만 개의 간구를 앉히면 최적의 합류가 제공됩니다. 문화의 시간이 증가함에 따라 생존가능성은 점진적으로 감소하여 4일 간 심한 스테토시스에서 60%로 가장 낮았습니다.
따라서, 사망률은 steatogenic 조건에서 배양된 간세포에서 더 높았다. 그리고 지질에 노출되는 시간으로 점진적으로 증가했습니다. 세포 수는 증식의 결과로 점진적으로 증가했습니다.
그러나, 증식율은 3일과 4일에 온화한 steatosis에서 더 낮았습니다. 대조적으로, 가혹한 steatosis는 24 시간까지 더 낮은 증식과 연관되었습니다. 오일-레드 O를 가진 염색 세포는 steatogenic 조건하에서 배양된 세포에 있는 지질 물방울의 적어도 2배 증가를 보여주었습니다.
세포 내 지방은 스테토겐성 배지에서 문화의 노출 시에 따라 증가하였다. 온화한 steatosis에서, 지질 내용물 2 일째부터 증가 했다, 반면 심한 steatosis에서 그들은 24 시간에서 시작 하 고 상당히 높았다. 세포 배양은 이전의 경험이 필요합니다.
이 프로토콜을 사용하기 전에 표준 조건에서 Hep G2 세포를 배양하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 지방산 육수의 준비도 중요한 포인트입니다. 팔미산은 실온에서 고체이며 관리 전에 데워져야 합니다.
이 방법은 증식, 세포사멸, 자가식, 산화 스트레스 및 약리학적 및 독성 분석을 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 경로의 분자 분석을 허용해야 한다.
