이 방법은 개발 중인 SARS-coronavirus-2 백신과 관련된 더 중요한 질문 중 하나에 응답하는 방법을 제공합니다. 백신은 중화 항체 반응을 유도할 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 봉쇄 레벨 2 시설에서 수행 할 수 있다는 것입니다.
또한 비교적 빠르고 저렴하므로 많은 샘플을 한 번에 분석하는 데 적합합니다. 중화 산 성 절차를 시연, 우리는 리카르도 마리우스, 실험실의 수석 기술자와 테일러 제이미슨, MD 박사 과정 학생. DMEM에서 베로 E6 세포를 배양하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10%의 FBS로 보충됩니다.
세포를 통과하려면 먼저 PBS 10 밀리리터를 추가하고 부드럽게 접시를 4 ~ 5 번 흔들어 씻어 내십시오. PBS를 흡입한 후 트립신 EDTA 의 3 밀리리터를 추가하고 접시를 흔들어 전체 표면이 섭씨 37도에서 배양하기 전에 덮이도록 하십시오. 세포가 분리되면 10%의 FBS로 보충된 DMEM의 7밀리리터를 추가하여 트립신을 비활성화한 다음, 여러 번 배관하여 세포를 다시 분리합니다.
원심분리에 의해 트립신을 제거하고 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하기 전에 세포 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄을 흡인한다. 계산 후, 각 15센티미터 플레이트에 일곱 번째 세포에 약 1회 10을 추가하고 세포가 100% 컨플루토리될 때까지 1~2일 동안 배양한다. Titering에 대한 VSV 스파이크 EGFP 의사 바이러스를 준비하려면 혈청이없는 DMEM의 12 밀리리터에서 희석 된 주식 바이러스로 감염의 0.01 복합성에서 세포를 감염시 보종한다.
바이러스를 추가한 후, 세포를 섭씨 37도에서 1시간, 이산화탄소5%에서 가끔 흔들면 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 2%의 FBS와 20밀리머 힙으로 보충된 신선한 DMEM으로 접종을 한 다음 세포를 섭씨 34도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 형광 현미경을 사용하여 감염된 세포의 EGFP 발현을 시각화한다.
광범위한 세포 병증 효과와 세포 분리가 관찰되면, 배양 상체를 수집하고 원심 분리에 의해 파편을 제거합니다. 여러 동결 해동 주기를 피하기 위해, 영하 80도에서 저장하기 전에 상체를 알리쿼트. 바이러스 성 티터를 결정하기 위해, 6 개의 웰 플레이트에서 베로 E6 세포를 잘 당 다섯 번째 세포에 6 배 10의 파종 밀도로 플레이트하고 하룻밤 동안 배양한다.
다음 날, 중간 중형 마이크로리터 900마이크로리터를 7마이크로원심분리관에 추가하고 100마이크로리터의 바이러스 성 육수를 첫 번째 튜브에 추가하여 바이러스 성 육수의 10배 연속 희석 시리즈를 설정합니다. 짧은 소용돌이 후, 각 후속 튜브에 희석 된 바이러스의 100 마이크로 리터를 전송, 각 튜브 사이 소용돌이. 그런 다음 베로 E6 배양 판의 각 웰에서 500 마이크로리터를 마이너스 초10에서 마이너스 7 바이러스 희석으로 대체합니다.
세포 배양 인큐베이터에서 15분마다 부드럽게 흔들리는 배양 후, 접종을 오버레이 용액으로 대체하고 세포를 섭씨 34도에서 48시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 플라크를 시각화하고, 각각 의 2 밀리리터를 0.1%의 크리스탈 바이올렛을 첨가하기 전에 PBS로 세포를 한 번 씻는다. 접시를 실온에서 약 20분 동안 로커에 놓고 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다.
마지막 세척 후, 밀리리터당 플라크 성형 단위로 각 우물에서 바이러스의 티터를 계산하기 위해 지시된 바와 같이 수식을 사용하기 전에 플레이트가 적어도 1시간 동안 공기를 건조하게 한다. 중화 분석용 플레이트 셀에 멀티 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터를 밀리리터당 5세포에 2배 10의 밀도로 추가하고, 37°C와 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 플레이트를 배양한다. 다음 날, 열은 30 분 동안 섭씨 56도 수조에서 테스트 할 환자 혈청 샘플을 비활성화합니다.
그런 다음 항생제로 혈청없는 DMEM72 마이크로 리터에 혈청 8 마이크로 리터를 추가하여 빈 96 개의 잘 조직 배양 플레이트에 환자의 혈청 샘플의 10 배 희석 시리즈를 설정합니다. 행 A.Then 는 각 행 H.를 사용하여 H.12 웰 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 행 B와 80 마이크로 리터에 각 행 B와 80 마이크로 리터에 세럼이없는 DMEM 40 마이크로 리터를 추가합니다. 행 A에 샘플을 혼합한 다음 각 행 A웰에서 각 행 B.After 혼합 후 각 웰에서 샘플의 40 마이크로리터를 각 행 F.Next까지 각 후속 웰에 대한 희석을 반복하고, VV 스파이크 EGFP의 40 마이크로리터를 G행에 각각 의 외래에 0.05 의 복합성으로 추가합니다. 그리고 37섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 접시를 배양하기 전에 4~5회 배관하여 섞는다. 인큐베이션의 끝에서, 베로 E6 배양판의 각 우물에서 상체를 신중하게 흡인시키고, 60 마이크로리터의 항체 바이러스 혼합물을 시료 희석 플레이트의 각 웰에서 세포 배양판의 해당 우물로 이송한다. 모든 시료가 전달되면 세포 배양판을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 1시간 동안 배치하여 20분마다 흔들수 있습니다.
인큐베이션이 완료된 후, 140마이크로리터의 카박스티메틸셀룰로오스 오버레이 용액을 세포 배양 판의 각 웰에 추가하고 플레이트를 섭씨 34도 및 이산화탄소 인큐베이터로 옮길 수 있습니다. 24시간 후, 488나노미터 파장에서 자동 형광 이미저에 플레이트를 이미지화하고, 개별 EGFP 포시를 정량화하기 위해 이미서의 자동 계수 기능을 사용합니다. 본 대표적인 예에서, SARS-코로나바이러스-2 스파이크 수용체 결합 도메인에 대하여 상업적으로 이용 가능한 중화 항체는 부정적 대조군으로서 IgG와 함께 양성 대조군으로서 사용되었다.
백분율 억제는 형광 화상 진찰을 통해 검출된 EGFP foci의 수에 근거하여 계산되었습니다. SARS-coronavirus-2 감염 후 약 3개월 동안 수집된 병변 환자 샘플에 의한 의사바이러스 중화는 입원 환자가 입원을 필요로 하지 않는 환자에 비해 중화 능력이 증가한 것으로 나타났다. 이 절차는 또한 바이러스 감염을 차단하는 것을 목표로 다른 COVID-19 예방 및 치료 제를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
