우리의 프로토콜은 안구 형태 형성 과정이 정상 및 병리학 적 조건 모두에서 어떻게 발생하는지에 대한 시각 및 실시간 정보를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 z-스택의 신속한 수집을 허용하여 데이터 세트의 각 3D 이미지 사이의 시간을 줄입니다. 이것은 안구 형태 형성이 어떻게 발생하는지에 대한 증가 된 시간적 분해능을 제공합니다.
모세관 내에 배아를 배치하는 것은 단일 소마이트 단계에서 구형 모양으로 인해 어려울 수 있으므로 적어도 하나가 올바른 방향에 있는지 확인하기 위해 여러 배아를 모세관에로드하는 것이 중요합니다. 수정 후 10 시간에 소마이트의 존재를 스크리닝하려면 배아를 스테레오 현미경 아래에 놓고 형광 어댑터를 사용하여 rx3 : GFP 전이유전자의 존재를 확인하십시오. GFP 양성 단일 소마이트 배아가 세 개에서 다섯 개까지 확인되면 미세 포셉을 사용하여 배아를 장식하십시오.
배아를 아가로스에 내장하려면 배아를 트리카인 밀리리터 당 168 마이크로그램으로 보충된 500 마이크로리터의 E3 배아 완충액이 들어있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 냉각되었지만 액체 2%의 낮은 용융 온도 아가로스 및 E3 버퍼를 500 마이크로리터를 부드럽게 혼합하여 튜브에 첨가하십시오. PTFE 플런저와 함께 한 밀리미터 유리 모세관을 사용하여 아가로스 포매된 배아를 모세관 내로 당기고 실온에서 30 내지 60초 동안 아가로스가 응고되도록 한다. 그런 다음 모세관을 트리카인 보충 E3 버퍼의 비이커에 넣으십시오.
배아 이미징을 위한 라이트시트 현미경을 설정하려면 모세관을 모세관 샘플 홀더에 넣고 홀더의 금속 디스크 중앙에 있는 금속 시스를 클릭합니다. 슬릿이 칼집 끝을 향하도록 두 개의 고무 마개를 칼집에 넣고 고무 마개 중앙을 통해 모세관을 밀어 넣습니다. 마커가 금속 외피의 바닥에 있으면 금속 캡을 사용하여 모세관을 제자리에 고정하고 흰색 표시가 정렬 된 현미경 상단에 홀더를 놓습니다.
샘플 홀더의 뚜껑을 닫고 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 모세관 찾기 버튼을 클릭합니다. Ergo Drive 제어판을 사용하여 모세관을 목표 바로 위로 이동합니다. 뚜껑을 연 후, 배아를 함유하는 아가로오스의 섹션이 목적물 앞의 모세관 바닥 아래에 매달려있을 때까지 플런저를 부드럽게 밀었다.
모세관 찾기를 끄고 샘플 찾기 를 클릭하여 샘플 챔버 웹캠에서 현미경 목표로 뷰를 전환하고 이 뷰를 사용하여 샘플의 위치를 보다 정확하게 조정합니다. 그런 다음 찾기 샘플을 끄고 수집 탭으로 전환합니다. z-스택 및 시계열 상자를 선택합니다.
획득 모드 매개변수 창에서 양면 라이트시트 설정을 선택하고 온라인 이중 측면 융합 및 피벗 스캔을 위한 박스를 선택합니다. 연속을 클릭하여 배아의 라이브 뷰를 얻습니다. 채널 창에서 488 채널을 선택하고 레이저 파워를 하나로 설정하고 노출 시간을 7.5밀리초로 설정합니다.
Ergo Drive 컨트롤 패널을 사용하여 눈 필드가 카메라를 직접 향할 때까지 배아의 위치를 조정하고 눈 필드에 충분히 초점이 맞춰질 때까지 채널 매개 변수의 왼쪽 및 오른쪽 라이트시트를 조정합니다. 첫 번째 및 마지막 z 위치를 마지막으로 감지할 수 있는 형광 신호보다 약 500마이크로미터 정도 높게 설정하고 최적을 클릭하여 스텝 크기를 0.477마이크로미터로 설정합니다. 인큐베이션 매개 변수를 설정하려면 펠티에 장치의 상자를 선택하여 온도를 섭씨 28도로 유지하십시오.
시계열 창에서 적절한 실험 빈도와 시간 간격을 선택하여 이미지를 획득합니다. 실험 시작을 클릭합니다. 이미지 세트를 저장할 폴더를 선택하고 이미지 접두사를 설정한 다음 저장을 클릭하여 이미징을 시작합니다.
이미지 분석을 위해 이미지 파일을 적절한 4D 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 4D 뷰어 큐브, 배율 표시줄 및 비디오 아이콘을 클릭하여 스토리보드 작업 표시줄을 엽니다. 키프레임 시퀀스 추가를 선택하고 비디오의 지속 시간(초)을 지정합니다. 회전 만들기 상자의 선택을 취소하고 시간 진행률 사용을 선택하여 비디오에 특정 시점을 포함시킵니다.
스토리보드를 저장하여 동일한 매개 변수를 여러 이미지 세트에 적용합니다. 동영상 내보내기를 클릭하여 타임랩스 이미징의 비디오를 저장하고 파일 이름 및 위치, 비디오 형식, 비디오 해상도, 프레임 속도, 데이터 해상도 등 동영상 내보내기 설정을 지정합니다. 원하는 경우 타임스탬프를 추가하고 레코드를 선택합니다.
특정 시점에서 회전 비디오를 만들려면 방금 설명한 대로 키프레임 시퀀스를 추가하되 회전 생성 상자를 선택하고 사용 시간 진행률 상자의 선택을 취소합니다. 모든 방향과 개별 시점에서 고해상도 이미지를 렌더링하려면 4D 뷰어에서 카메라 아이콘을 선택합니다. 분석용 파이프라인을 구축하려면 플라스크를 선택하여 분석 패널에 액세스하고 분석 작업 메뉴를 열어 관심 있는 작업 순서를 선택합니다.
파란색 삼각형을 클릭하여 파이프라인을 시작합니다. 실행이 끝나면 팝업 창에서 피쳐 열을 클릭하여 관심 있는 개체에 대한 정보를 제공할 수 있는 기능 목록을 본 다음 내보내기를 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 이 대표적인 분석에서, 트랜스제닉 rx3:GFP 배아를 총 14시간 동안 하나의 소마이트 단계로부터 24시간 동안 수정 후 24시간까지 매 5분마다 등쪽 유리한 지점에서 영상화하였다.
관찰된 바와 같이, 이 분석으로부터 캡처된 이미지의 파이프라인 실행을 수행함으로써 발달하는 눈의 마스크의 생성을 용이하게 하였다. 안구장이 두 개의 시신경 소포로 분리될 때, 시상하부에 기여한 전뇌의 세 번째 rx3:GFP 양성 영역이 관찰될 수 있다는 점에 유의한다. 이 정보는 또한 볼륨 데이터에서 관찰되었으며, 어느 광학 소포에 대해 관찰된 것보다 부피가 훨씬 작았기 때문에 광학 소포 데이터로부터 쉽게 분리될 수 있다.
이 절차는 이미지 데이터 세트에서 개별 셀 추적과 같은 추가 분석을 통해 후속 조치를 취할 수 있습니다.
