이 방법은 세포로의 지방산 전달을 개선하고 유리 지방산 전달의 독성 영향으로부터 지방산을 보호하여보다 일관된 라벨링을 보장합니다. 클릭 화학 검출의 민감도 및 효율은 지방산 라벨의 효과적인 흡수에 의존한다. 우리는 이것이 크게 개선 될 수 있음을 보여주었습니다.
프로토콜의 몇 가지 단계는 매우 구체적이며 면밀히 따라야합니다. 시각적 데모는 예를 들어 라벨링 믹스에서 고체의 형성을 피하는 방법을 명확히하고 보여줄 수 있습니다. 라벨링 배지를 준비하려면 DMEM에 5%덱스트란/숯으로 코팅된 FBS, 1X 페니실린 스트렙토마이신, 2밀리몰 L-글루타민 및 100밀리몰 소듐 피루베이트로 보충한 다음 사용하기 전에 섭씨 37도까지 예열하십시오.
여섯 웰 조직 배양 접시에서 하루 전에 플레이팅된 HEK-293 T 세포를 PBS로 부드럽게 세척한 다음, PBS를 표지 배지로 교체한다. 지방산으로 대사 표지를 진행하기 전에 세포를 섭씨 37도에서 약 45분 동안 5% 이산화탄소로 배양한다. 지방산 유사체를 비누화하기 위해, 적어도 두 마이크로리터의 알키닐 지방산 유사체를 세 밀리리터 원뿔형 반응 바이알의 바닥에 직접 피펫한다.
유리의 가장자리에 반응 바이알의 바닥에 가까운 동량의 희석된 수산화칼륨을 피펫팅하여 분배된 부피의 수산화칼륨이 지방산과 혼합되도록 한다. 바이알의 뚜껑을 닫고 부드럽게 탭하여 용액을 혼합하십시오. 반응 바이알을 섭씨 65도에서 약 5분 동안 또는 용액이 맑아질 때까지 가열하여 지방산이 혼입되었음을 나타냅니다.
그러나 액체가 너무 많이 증발하지 않도록주의하십시오. 다음으로, 피펫은 20% 무지방산 BSA를 가온하여 지방산 비함유 BSA에 대한 수산화칼륨에 대한 지방산의 부피비가 1-1-50이 되도록 하여, 20X BSA 결합 알키닐 지방산의 최종 농도를 달성하였다. 용액을 위아래로 피펫팅하여 섞은 다음 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오.
HEK-293 T 세포를 20X 지방산 BSA 접합체를 기아 배지에 직접 첨가하여 25 마이크로몰 알키닐 미리스테이트 또는 100 마이크로몰 알키닐 팔미테이트 및 알키닐 스테아레이트 중의 1%BSA의 최종 농도를 달성함으로써 표지한다. 비교를 위해, 라벨이 붙지 않은 지방산 두 마이크로리터를 기아 배지에 직접 피펫팅하여 비누화되지 않은 액체를 첨가한 다음, 세포를 다시 세 시간에서 여섯 시간 동안 배양기에 넣는다. 인큐베이션이 완료된 후, 세포를 실온에서 PBS로 부드럽게 세척한 다음, 500 마이크로리터의 EDTA-free 변형된 RIPA 완충액을 첨가하고, 용해물을 섭씨 네 도에서 15분 동안 회전시켜 세포를 수확하고 용해시킨다.
용해물을 섭씨 4도에서 16, 000배 G에서 10분 동안 원심분리한 다음, 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상층액을 수집하여 영하 20도에 보관한다. EDTA가 없는 변형된 RIPA 버퍼를 사용하여 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 50 내지 100 마이크로그램의 단백질 용해물을 동일한 부피로 가져온다. 반응 부피를 가능한 한 작게 유지하십시오.
각 샘플에 STS를 추가하여 최종 농도 1%클릭 시약의 마스터 믹스를 준비하고 용해물에 적절한 부피를 추가한 다음 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 용해물을 가끔 혼합하여 섭씨 37도 수조에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 면역 침전을 위해, 용해물을 토끼 항-GFP와 혼합하고 섭씨 네 도에서 회전하면서 밤새 배양하십시오.
0.1%SDS RIPA로 미리 평형화된 15~20마이크로리터의 마그네틱 비드를 각 튜브에 넣고 섭씨 네 도에서 끝까지 3시간 동안 반응할 수 있도록 합니다. 비드를 용해 완충액으로 세척하고 1%SDS를 함유하는 50밀리몰 HEPES 완충액 45마이크로리터에 재현탁시킨다. 구슬을 섭씨 80도에서 15 분 동안 가열하십시오.
인큐베이션 동안, 대략 다섯 분마다 튜브를 반전 또는 교반한 다음, 모든 튜브를 간단히 회전시킨다. 샘플이 여전히 따뜻하면 단백질을 함유 한 상청액을 수집하십시오. 상청액 43 마이크로 리터와 클릭 시약 마스터 믹스 7 마이크로 리터를 결합하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 어둠 속에서 반응하게하십시오.
웨스턴 플롯에서, 아실 사슬의 길이가 증가함에 따라 비누화 알키닐 지방산과 비누화되지 않은 알키닐 지방산 사이의 클릭 화학 검출을 위한 라벨링 효율에서 눈에 띄는 효과가 관찰되었다. 알키닐 스테아레이트로 표지된 세포에서, 지방산의 비누화 및 대사 표지를 위한 BSA로의 전달은 클릭 화학을 통한 S-아실화 단백질 신호의 검출 및 형광 아지토프로브에 의한 검출을 급격히 증가시켰으며, 이는 알키닐 지방산 표지의 세포 혼입의 전반적인 증가를 시사한다. 반대로, 가장 짧고 가장 가용성 지방산인 알키닐 미리스테이트로 처리된 세포에서는 눈에 띄는 차이가 관찰되지 않았다.
알키닐 팔미테이트로 표지된 세포는 알키닐 미리스테이트에 비해 표지의 중간 증가를 나타내었지만, 알키닐 스테아레이트보다 적었다. 중요하게도, PVDF 막을 0.1몰 수산화칼륨으로 처리하면 알키닐 팔미테이트 및 알키닐 스테아레이트와 함께 배양된 세포로부터 지방산 라벨이 크게 제거되었고, 대부분의 신호가 에스테르 또는 티오에스테르 결합을 통해 이루어졌음을 확인하였다. 예상한 바와 같이, 알키닐 미리스테이트의 혼입은 아미드 결합을 통해 단백질에 미리스테이트의 부착으로 인해 대부분 알칼리 내성이었다.
클릭 화학에 이어서, 야생형 미리스토일화 C-말단 헌팅턴 GFP의 미리스토일화는 용해물뿐만 아니라 면역침전물에서도 검출된 반면, G2A 돌연변이는 C-말단 헌팅턴 GFP의 미리스토일화를 완전히 차단하였다. 클릭 화학에 이어서, 우리는 질량 분광법을 위해 지방 아실화 단백질의 친화성 정제를 수행 할 수 있습니다. 이것은 독성으로부터 세포를 보호함으로써 지방 아실화 단백질의 상이한 프로파일을 산출할 수 있다.
