이것은 인간 유방 조직과 인간 적인 유방암 사이 상호 작용의 연구를 직접 허용하는 시간의 연장된 기간 동안 살아있는 ex vivo를 유지하는 인간 유방 조직을 허용하는 첫번째 프로토콜입니다. 이 기술의 주요 장점은 유방 지방 세포, 면역 세포, 혈관 구조, 덕탈 구조 및 세포 외 매트릭스를 포함한 인간 유방 조직의 거시적 조각을 살아있는 전 생체 균증으로 유지한다는 것입니다. 이 기술은 개인화된 약, 제약 발달 및 섬유증 및 세포외 매트릭스 리모델링과 같은 느린 유방암 프로세스의 종양 개시 및 느린 유방암 프로세스의 병생리학을 포함하여 유방암 연구의 몇몇 지역에 대한 중요한 연루가 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 캐서린 헤버트, 툴레인 대학원생과 내 실험실에서 툴레인 의대생 레이크시 구랄라입니다. 먼저 준비된 젤라틴 용액을 섭씨 37도의 수조에 녹입니다. 5 밀리리터 또는 10 밀리리터 세로지오티 파이펫을 사용하여 이 솔루션의 2.5 밀리리터를 각 플런저에 분배하여 6개의 웰 플레이트의 우물을 제공합니다.
젤라틴이 고화되면 pNIPAAm 코딩 된 ASC 플레이트를 바이오 안전 캐비닛으로 옮기습니다. 젤라틴이 ASC에 접촉할 수 있도록 플런서를 이 플레이트의 우물에 부드럽게 넣습니다. 플런저에 금속 와셔를 놓아 질주하여 젤라틴이 실온에서 30분 동안 ASC 시트와 직접 접촉하도록 합니다.
플런저로 접시를 부드럽게 움직여 바이오 안전 캐비닛의 멸균 상자에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 상자를 4도 냉장고로 옮기거나 접시를 얼음과 얼음 양동이에 넣고 30분 동안 바이오 안전 캐비닛에 놓습니다. 바이오 안전 캐비닛에서 멸균 PBS 10 밀리리터로 인간의 유방 조직을 세 번 씻으하십시오.
멸균 집게와 면도날을 사용하여 BC-MPS를 거칠게 다진 다음 가능한 한 많은 근막과 결합 조직을 제거하십시오. 결합 조직이 제거되면 멸균 면도날을 사용하여 균질성 액체 일관성이 될 때까지 조직을 마침내 다진다. P1000 파이펫 팁의 끝을 잘라 다진 조직을 파이펫팅에 도움이됩니다.
1.5 밀리리터 튜브에서, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 다진 조직, 암 세포주 및 BC-MPS 미디어를 결합한다. 배양기에서 바이오 안전 캐비닛으로 하단 셀 시트에 사용되는 ACS 플레이트를 이동하고 플레이트에서 미디어를 흡습합니다. 절단 파이펫 팁을 사용하여 바닥 ACS 플레이트의 우물 의 중심에 준비 된 유방 조직 혼합물 파이펫, 바이오 안전 캐비닛에 플런저와 상부 ACS 플레이트를 포함하는 상자를 이동합니다.
pNIPAAm 코팅 플레이트에서 젤라틴 플런지를 부드럽게 제거하고 조직 혼합물 위에 놓습니다. BC-MPS 미디어를 우물에 추가하고 BC-MPS 혼합물과 플런저로 바닥 ACS 플레이트를 멸균 플라스틱 상자에 조심스럽게 이동합니다. 문화의 오염을 피하기 위해 주의, 운송을 위해 상자의 뚜껑을 배치합니다.
젤라틴이 녹고 상단 ACS 층이 바닥 층을 부착하기 시작 할 때까지 상자와 섭씨 37도 인큐베이터의 하단 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 플레이트와 함께 상자를 생체 안전 캐비닛으로 이동하여 바닥 판에서 플런지를 부드럽게 제거하여 암세포가 우물 바닥에 고정된 조직을 관찰합니다. 6웰 플레이트의 뚜껑을 다시 하단 플레이트에 놓고 37도에 배양하여 젤라틴을 완전히 녹이고 상단 층이 아래층으로 고정되도록 합니다.
플레이트를 생체 안전 캐비닛으로 부드럽게 이동하고 10 밀리리터 세로지피트로 우물 가장자리에서 미디어를 흡인합니다. 조직을 해소하기 위해 각 우물의 가장자리에 신선한 매체의 2 밀리리터를 추가합니다. BC-MPS를 원하는 시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지합니다.
2~3일마다 미디어를 변경합니다. BC-MPS를 분석할 준비가 되면 플레이트를 바이오 안전 캐비닛으로 이동합니다. 조직의 우발적 인 탈지방지를 위해 혈청 피펫으로 미디어를 제거하십시오.
각 웰에 PBS의 한 볼륨을 추가합니다. 그런 다음 세로지학적 파이펫으로 PBS를 제거합니다. 각 웰에 세포 해리 용액 1 밀리리터를 추가하고 이 세포가 분리되도록 5 분 동안 플레이트를 인큐베이터로 다시 이동합니다.
인큐베이션 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 바이오 안전 캐비닛에서 배양 판에서 세포와 조직을 완전히 분리합니다. 15 밀리리터 원컬 튜브로 조직으로 용액을 옮기고 PBS의 2 밀리리터를 추가하여 남은 세포를 수집합니다. 세포가 형광인 경우 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니까.
조직에서 세포를 완전히 해리하기 위해 10~20분 동안 1회 G에서 궤도 셰이커에서 일정한 동요 하에서 튜브를 37도에서 배양한다. 바이오 안전 캐비닛에서 혈청 피펫을 사용하여 튜브에 남아있는 세포 덩어리를 방해하십시오. 그리고 250 마이크로 미터 조직 여과기를 통해 샘플을 새로운 15 밀리리터 튜브로 필터링합니다.
남은 세포를 수집하기 위해 PBS의 1 밀리리터로 여과기를 헹구세요. 원심분리기는 실온에서 500배 g에서 5분간 샘플을 분리하여 암세포와 AC를 펠릿에서 함께 혼합하여 상부 층에서 부동시킬 향포세포를 분리한다. 무딘 컷 파이펫 팁을 사용하여 지방 세포 층을 새 튜브로 옮길 수 있습니다.
원심분리시 시료를 다시 사용하고 주사기와 바늘을 사용하여 잔류 용액을 지방세포 아래에서 제거합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 ASC 및 암세포를 포함하는 관에서 나머지 용액을 흡인. PBS 또는 BC-MPS 미디어에서 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포측정을 사용하여 형광에 기초하여 세포를 정렬합니다.
컨실릭 ASC 시트의 스트트리 에이드 패턴이 여기에 표시됩니다. 부력 인간 유방 조직은 여전히 문화의 14 일 후에 우물의 바닥에 ASC 세포 시트에 의해 고정되었습니다. 형광 현미경 이미지는 14 일 후에 RFP 세포주를 발현하고 적어도 6 일 동안 3중 음성 종양이 PDX를 explant MDA-MB-231와 BC-MPS의 안정성을 보여줍니다.
유방 조직을 포함하는 BC-MPS는 100X 및 20X 배율에서 조직의 토착 요소를 보여주기 위해 14 일 동안 시험관 내에서 배양되었다. 대식세포 마커의 염색은 문화에서 3 및 7 일 후에 1 차적인 대식세포의 보존을 보여주기 위하여 이용되었습니다. 14일 후 Bodipy 염색 MDA-MB-231 세포의 유동 세포 분석은 2D 배양및 광범위한 지질 축적 및 BC-MPS에서 최소한의 지질 축적을 나타낸다.
지질 양성 MDA-MB-231 세포의 비율은 2D 배양보다 BC-MPS에서 26.2배 더 컸다. BC-MPS에서 배양된 세포는 표준 2D 배양에서 배양된 세포에 비해 지질 방울을 증가시한다. MDA-MB-231 세포로 BC-MPS로 표지된 RFP의 타임랩스 이미지는 의사 포드와 높은 운동성을 가진 231개의 세포의 아모에이드 운동을 보여주었습니다.
유방 조직은 충분히 작게 다진 하고 우물의 바닥에 걸쳐 분배될 정도로 분리되어야 합니다. 유방 조직은 아주 부력이고 조각이 너무 크거나 너무 밀접하게 함께 군집되는 경우에, ASC 세포 시트는 우물의 바닥에 유방 조직을 고정할 수 없을 것입니다. 결과 유방암 구조는 관심의 특정 세포 모형을 격리하기 위하여 효소 소화를 겪을 수 있습니다.
이것은 유방 조직에 있는 암세포가 전통적인 2D 배양 또는 오르가노이드에 비교된 화학요법에 다르게 반응하는 방법과 같은 중요한 질문을 대답할 수 있습니다.
