Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
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프로토콜 생성 과정에서 그녀의 아이디어와 토론에 대한 줄리아 파인 박사와 편집 전반에 걸쳐 도움이되는 의견을 주신 Cassondra Vernier 박사에게 감사드립니다. 이 자료들은 보조금 ID 549025에 따라 식량 농업 연구 재단이 부분적으로 지원하는 프로젝트에 기여했습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 정량화될 수 있다(도 5). 감염 능력 및/또는 병리학의 확인 후, 생성된 입자는 꿀벌과 꿀벌 바이러스 사이의 상호작용을 밝히기 위해 생물 검정에 사용될 수 있다.
기술된 프로토콜의 가장 독특한 이점 중 하나는 번데기 수확, 입자 생성 또는 생물학적 검정 수행 여부에 관계없이 각각이 대량으로 쉽게 스케일링된다는 것입니다. 번데기 절제 방법33을 사용하면 시간당 ~ 100 마리의 번데기를 제거 할 것으로 예상 할 수 있지만이 숫자는 숙련도에 따라 확장됩니다. 그러나 여기에 보고된 애벌레 자가 제거 방법은 다양한 계획 및 스케줄링 절차가 필요하지만 밤새 제거된 꿀벌 수의 10-20배를 쉽게 생성할 수 있으며, 비교적 적은 수작업 노력과 꿀벌에 대한 기계적 부담이 적다.
이 방법의 주요 한계는 자체 제거 된 유충이 이전에 Varroa에 감염되지 않았 음을 보장 할 수있는 방법이 없다는 것입니다. 정기적 인 진드기 치료 및 근원 두드러기의 모니터링은이 위험을 최소화 할 수 있지만 일부 유충은 여전히 어느 정도의 Varroa 기생을 가졌을 수 있습니다. 그러나 번데기를 개별적으로 수동으로 제거하면 사용자는 주어진 번데기의 세포에 진드기가 있는지 관찰 할 수 있습니다. 또한, 자체 제거 과정은 애벌레의 음식 추구 행동에 의존하기 때문에,이 애벌레를 포함하는 프레임은 정상적으로 발생하는 최종 먹이 전에 제거되어야합니다. 노동자들에 의한 이러한 공급 부족으로 인해 애벌레는 세포에서 기어 나옵니다. 따라서이 방법으로 파생 된 번데기는 식민지 내부에서 완전히 발달 한 유충에 비해 영양 스트레스의 매우 짧은 창을 경험하며 약간 작게 나타날 수 있습니다. 이것은 프레임에 존재하는 코호트에서 가장 어린 애벌레에서 특히 주목할 만하다. 여왕이 24 시간 창문 위에 알을 낳았 기 때문에이 애벌레들은 비례하여 더 많은 먹이 시간을 놓치고 있습니다. 이들은 일반적으로 수동 절제에 의해 제거 된 것과 비교하여 매우 작은 크기로 번식하는 동안 분명히 주목할 만합니다. 그러나, 자기 제거에 의해 생성 된 유충의 양은 감소 된 개별 바이오 매스를 보상하는 것 이상입니다. 또한, 수동 절제 방법은 번데기가 세포에서 뽑힐 때 상당한 기계적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 두 방법 중 하나를 바이러스 입자를 생성하는 것뿐만 아니라 실험의 일부로 사용해야하는 경우 적절한 제어를 보장하기 위해주의를 기울여야합니다.
추출 방법에 관계없이, 바이러스 전파 프로토콜은 번데기를 사용하여 다량의 바이러스 입자를 생성 할 수 있으며, 이는 꿀벌 바이러스 반응을 테스트 할 때 현재 시행되는 다른 바이러스 접종 방법35,36,37에 의해 유도 된 변동성을 최소화합니다. 이 프로토콜은 피코나비랄레스(Picornavirales) 순으로 외피되지 않은 바이러스(예를 들어, 이스라엘 급성 마비 바이러스, 변형된 날개 바이러스)를 사용하여 최적화되고 테스트되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 바이러스 입자를 분리하기 위한 상이한 전략은 외피된 바이러스(44)로 작업할 때 뒤따라야 한다. 대략적인 근사치로서, 바이러스 수확 노력에 관여한 16개의 샘플(도 4의 4개의 콜로니를 포함함)을 각각 200-300개의 주입된 번데기로부터 생성하고, 2-2.5 mL의 농축된 바이러스 입자 제제를 수득하였다. 바이러스 접종 농도가 0.1%이고 표준 35-bee 케이지가 있다고 가정하면, 16개의 바이러스 제제 각각은 3,300-4,200개의 케이지에 충분한 입자를 제공할 것이다. 감염성 물질의 이러한 잉여는 실험 제한을 줄이고 높은 처리량의 생물 분석을 가능하게합니다. 바이러스 입자 농축액이 -80°C에서 저장될 때 수개월 또는 수년 동안 생존 가능한 상태로 유지될 수 있지만, 몇 번의 동결-해동 사이클을 거치더라도 감염성이 서서히 감소할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서 바이러스 제제 스톡을 작은 분취량으로 저장하는 것이 좋으며, 그 중 몇 가지는 바이러스 역가를 정량화하고 실험 당시 치료 용량을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 도 5에서 입증된 연중 변동성은 주기적인 용량-반응 테스트의 필요성을 더욱 강화시켜 바이러스 생존력에서 예기치 않은 손실의 가능성을 최소화한다.
케이지 생물검정 자체는 또한 케이지 생물분석 환경의 인위적인 성질인 것인, 또는 고려하는데 필요한 한계 또는 적어도 주의사항을 갖는다(도 3). 꿀벌을 인클로저로 그룹화하면 개별 수준을 넘어서는 바이러스 검사가 가능합니다. 새장은 꿀벌 자체가 아닌 실험 단위가됩니다. 이것은 단일 꿀벌이 고립되어 치료되는 것보다 실제 식민지와 더 유사하지만 여전히 현실적인 벌집 환경과는 거리가 멀다. 여왕과 새끼 페로몬, 다른 나이의 꿀벌 및 기타 단서를 포함한 사회 환경에서 제거된이 꿀벌은 전체 크기의 식민지가 될 수있는 것처럼 반응하지 않을 수 있습니다. 그러나 이들은 케이지 시스템을 사용하는 대규모 실험에 대한 주로 고려 사항입니다. 케이지 바이러스 생물 분석으로부터 수집 된 결과는 주로 사용자가 원하는보다 현장 현실적인 설정으로 확장 된 미래의 바이러스 테스트 결정을 알리는 데 사용할 수있는 기준 정보 확립으로 취급되어야합니다.
여기에 기재된 방법은 꿀벌 바이러스 검정에 사용하기 위한 바이러스 입자의 대량 생산을 위한 표준화된 공정을 제공한다. 이러한 분석은 다중 바이러스 감염을 포함한 꿀벌 - 바이러스 상호 작용의 다양한 측면과 바이러스 감염에 직면하여식이 품질 및 영양 보충제가 생존에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 이미 구현되었습니다 11,18,45,46. 그들은 콜로니 전체 감염 실험11,47에 사용하고 행동 47 및 유전자 발현 48에 대한 감염의 영향을 연구하기 위해 확장되었습니다. 전반적으로, 이러한 방법은 꿀벌 바이러스 접종물을 생산하고 평가하는 데 사용할 수있는 도구의 기준선을 제공합니다.

꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지 않습니다 5,10 . 꿀벌과 바이러스 상호 작용의 기본 생물학과 다른 환경 요인과의 관계를 이해하는 것은 효과적인 바이러스 관리 기술을 개발하는 데 중요합니다.
그러나 꿀벌 - 바이러스 상호 작용을 연구하는 것은 과정을 복잡하게 만드는 수많은 알려진 요인과 알려지지 않은 요인으로 인해 어려움을 겪습니다. 여기에는 식이요법 11,12, 살충제 노출(13), 꿀벌 유전적 배경(14,15)과의 상호작용이 포함된다. 바이러스 감염에만 초점을 맞출 때조차도, 꿀벌 개체군은 관리되고 야생이기 때문에 합병증이 흔합니다.하지만 종종 급성 증상을 나타내지 않고 바이러스 16,17 및바이러스 공동 감염의 효과는 잘 이해되지 않습니다 18. 이로 인해 꿀벌 바이러스 효과에 대한 연구가 풀리기 어려워졌습니다.
많은 꿀벌 바이러스 연구는 상황 바이러스 감염을 사용하여 다른 스트레스 요인과의 상호 작용을 찾아 배경 감염이 다른 치료법12,19,20,21과 어떻게 변하는지 관찰했습니다. 이 접근법은 중요한 효과, 특히 살충제 또는식이 요법이 바이러스 수준과 복제에 어떻게 영향을 미치는지 발견하는 데 성공했지만 알려진 함량과 농도의 바이러스 처리 접종은 바이러스 감염 역학의 실험적 테스트에 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실험적 치료를 배경 감염과 분리하는 것도 어려움을 초래할 수 있습니다. 현장 연구에서 연구자들은 꿀벌에서 꿀벌22로 바이러스가 전염되는 증거를 제공하기 위해 변형 된 날개 바이러스 (DWV)의 균주를 차별화했지만이 접근법을 사용하는 것은 꿀벌만으로는 어려울 것입니다. 바이러스 감염성 클론은 감염 23,24,25을 추적하는 것뿐만 아니라 꿀벌 바이러스의 역 유전학 연구 및 바이러스 - 숙주 상호 작용 연구 26,27,28을위한 강력한 도구입니다. 그러나 대부분의 경우, 감염성 클론은 입자를 생산하기 위해 세포 내부의 감염주기를 충족시켜야합니다. 이러한 입자는 그들의 감염성이 네이키드 바이러스 RNA보다 높고 캡슐화된 게놈을 사용한 접종이 자연 감염을 모방하기 때문에 실험적 치료를 위한 접종물로서 바람직하다.
오염되지 않은 순수 꿀벌 바이러스 접종물 (야생형 바이러스 균주 또는 감염성 클론에서 유래 한 균주)의 생산은 또한 도전을 제기합니다. 이들은 주로 순수 균주 바이러스29,30을 생산하기 위해 신뢰할 수 있고, 지속적으로 복제되는, 바이러스가 없는 꿀벌 세포주를 수득하는데 어려움 때문이다. 일부 세포주가 생산되었지만, 이러한 시스템은 불완전한 상태로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 생존 가능한 세포주가29 개 생산되어 바이러스 생산 및 조사를보다 세밀하게 제어 할 수 있기를 희망합니다. 이러한 라인이 널리 이용가능해질 때까지, 대부분의 바이러스 생산 프로토콜은 생체내 바이러스 생산 및 정제(18,31,32,33,34)의 사용에 계속 의존할 것이다. 이러한 접근법에는 관심있는 바이러스 입자를 확인하고 정화 (또는 전염성 클론을 생산)하고이를 사용하여 꿀벌, 보통 번데기와 같은 꿀벌을 감염시키는 것이 포함됩니다. 번데기는 표적 바이러스와 함께 주입 된 다음 희생되고 더 많은 입자가 추출되고 정제됩니다. 그러나 처음에는 바이러스가없는 꿀벌이 없기 때문에 그러한 농축액에서 다른 바이러스의 흔적으로 인해 어느 정도 오염이 항상 발생하므로 배경 감염 가능성이 낮은 꿀벌을 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 또한, 이들 프로토콜(33)에 사용하기 위해 빗 세포로부터 번데기를 제거하는 방법은 매우 노동 집약적이며 꿀벌에서 스트레스를 유도할 수 있으며, 이러한 수단(18,32)에 의해 생산을 제한한다. 여기에서, 우리는 꿀벌에 대한 노동이 거의없고 기계적 스트레스가 적고 애벌레를 대규모로 제거 할 수있는 대체 방법을보고합니다.
번데기를 얻고 시작 바이러스 접종물과 함께 주입하면 바이러스가 복제 할 시간을 제공하기 위해 배양되어야합니다. 이어서, 생산된 바이러스 입자는 실험용 꿀벌을 감염시키는 데 사용할 수 있는 형태로 가공될 수 있다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 간단한 방법들이 있는데, 여기에는 바이러스적으로 감염된 꿀벌로부터 생성된 조질 균질액(35,36) 또는 용혈림프(37)를 감염원으로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 효과적이지만 배경 기질로부터 알려지지 않은 변수 (예 : 죽은 벌 균질물의 다른 요인)를 도입 할 가능성이 더 큽니다. 또한, 실험이 단기간에 바이러스의 크고 알려진 복용량을 제공해야하는 경우 입자를 집중시키는 것이 바람직합니다. 따라서, 보다 나은 제어를 위해, 바이러스 입자의 어느 정도의 정제 및 농축을 허용하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 일련의 침전 및 원심분리 단계는 거의 모든 가능한 비표적 바이러스 물질(33)의 제거를 초래할 것이다.
이 농축 접종물을 생산 한 후, 바이러스 역가 (qPCR)를 정량화하고 생체 내 생물 분석법으로 특성화하여 생존력과 사망률을 유발하는 능력을 테스트 할뿐만 아니라 감염 후 증가 된 바이러스 역가가 얻어진다는 것을 확증하는 것이 유익합니다. 이것은 주사 실험 (번데기 또는 성인으로) 또는 먹이 실험 (애벌레 또는 성인에게)을 통해 달성 될 수 있습니다. 이러한 모든 접근법이 가능하지만 새장에있는 성인 꿀벌 그룹에 먹이를주는 것이 종종 가장 빠르고 간단합니다. 케이지 분석 방법은 또한 살충제 독성38, 난소 발달39 및 행동40,41에 대한 영양 영향을 포함하여 꿀벌에 대한 다양한 다른 치료법을 테스트하는 데 널리 사용되므로 바이러스 감염과 다른 요인(42)을 연결하는 실험을위한 좋은 기초를 형성 할 수 있습니다.
여기서는 꿀벌에 대한 노동 및 기계적 스트레스를 줄이는 번데기를 제거하는 방법과 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기위한 반복성이 높고 처리량이 높은 생물 분석을 포함하여 값 비싼 초원심분리기를 사용하지 않고 대량의 반 순수하고 고농축 바이러스 입자를 생산하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 바이러스 접종의 순도를 엄격하게 조절함으로써 조사관은 다른 바이러스 접종 방법에 비해 꿀벌 바이러스 반응의 변화를 줄일 수 있습니다. 또한, 생물 분석은 현장 현실적인 설정으로 확장하기 전에 매우 반복 가능한 실험 단위를 사용하여 소그룹 수준에서 바이러스 효과를 스크리닝 할 수 있으며, 이는 관리하기에 훨씬 더 노동 집약적입니다. 이 두 가지 방법이 결합되어 꿀벌 - 바이러스 생리 학적 상호 작용에 대한 전반적인 이해를 향상시키는 데 도움이되는 연구에 필요한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.

번데기 주사 및 바이러스 추출을위한 프로토콜 (그림 1)을 성공적으로 따르면 다량의 바이러스 입자가 생성되어야합니다. 그러나 여러 시점에서 다양한 콜로니에서 공급되는 번데기를 샘플링하고 주입하면 오염이 적은 표적 바이러스를 획득 할 가능성이 극대화됩니다. 꿀벌 내에서 바이러스가 복제되고 서로 상호 작용하는 역학은 잘 이해되지 않았습니다. 기존 감염의 가능성과 함께, 번데기가 동일한 원래 식민지에서 샘플링 된 경우에도 주사 된 (원하는) 바이러스가 주어진 번데기에서 우세해질 것이라는 보장은 없습니다. 그림 4는 추출 후 볼 수 있는 바이러스 비율의 잠재적 범위를 보여줍니다. 표시된 네 개의 콜로니는 모든 번데기가 처음에 ~ 95 %의 이스라엘 급성 마비 바이러스 (IAPV) 접종을 주입 한 더 큰 바이러스 수확 노력의 하위 집합을 나타냅니다. 이러한 추출에 관여하는 16개의 콜로니 샘플 중 10개는 일부 > 99%(예를 들어, 콜로니 1)를 포함하여 매우 순수한 IAPV(> 95%)를 포함했지만, 다른 샘플은 IAPV 비율(예: 콜로니 2-3)이 다양했으며, 일부는 변형된 날개 바이러스(DWV)(예: 콜로니 4)와 같은 다른 바이러스에 의해 지배되기도 했습니다.
표 1은 RT-qPCR 역치 주기(Ct) 값 (PCR 표적이 검출 역치에 도달하는 지점) 및 100 ng RNA 당 총 바이러스 게놈 등가물 (ge)의 형태로 도 4에 도시된 4 개의 바이러스 (BQCV, DWV, IAPV, SBV)의 증폭 수준에 대한 추가적인 맥락을 제공한다. Ct값은 비율의 예측 변수로 사용될 수 있지만, ge 값은 표준 곡선 기반 방법(17)을 사용하여 계산될 필요가 있다. 생성 된 입자의 실제 양 (즉, ge)은 처리 된 번데기의 수와 추출 과정 동안의 필터링 엄격도에 달려 있습니다.
바이러스 입자 제제 (증폭 된 접종물)는 -80 °C에서 보관해야하며 여러 동결 - 해동 사이클(18)을 받으면 크게 저하 될 것이므로 분취하는 것이 좋습니다. 또한, 용량 반응 분석은 다양한 외부 요인 (벌집 유전학, 꿀벌 건강 등)이 매우 가변적 인 바이러스 반응을 유발할 수 있으므로 실험 전에 항상 수행되어야합니다. 실험 케이지로부터 유래된 데이터를 사용하여(도 3), 도 5 는 두 개의 상이한 연도 동안 동일한 IAPV 입자를 공급한 꿀벌의 용량-반응 생존 곡선을 비교함으로써 이러한 가변성을 입증한다. 동일한 바이러스 접종 및 1 % ~ 0.01 % IAPV의 시험 농도를 포함하여 동일한 테스트 매개 변수에도 불구하고 2018 년 (그림 5A) 및 2019 년 (그림 5B)에서 수행 된 시험은 수크로오스 접종물에서 바이러스를받지 않은 대조 처리를 제외하고는 모두 눈에 띄게 다른 생존 반응을 일으켰습니다. 원한다면,LD50 계산은 또한 보다 정확한 사망률 측정치(43)를 얻기 위해 이 시점에서 수행될 수 있지만, 근사치가 일반적으로 충분하기 때문에 이것은 일반적으로 필요하지 않다. 2018 년에 1 % 용량은 감염 후 72 시간 (hpi)에서 약 50 %의 생존율을 가져 왔으며, 따라서 그 해에 실시 된 대부분의 바이러스 케이지 실험의 기본 농도가되었습니다. 그러나 동일한 용량이 동시에 2019 년에 총 사망률에 가까운 결과를 얻었으며 그 결과 그 해에 수행 된 대부분의 바이러스 케이지 실험은 0.01 % IAPV 접종을 대신 받았다. 이 상당히 낮은 농도는 2018 년 1 % IAPV 접종과 동일한 수준의 사망률에 도달했으며 바이러스 입자를 100 배 적게 사용했습니다.
이들 데이터는 도 3에 도식화된 것과 유사한 케이지를 사용하여 생물검정으로 생성되었다. 상단과 측면의 피더 구멍은 쉽게 다이어트 제어를 할 수 있으며 슬라이딩 케이지 도어는 접종 트레이 또는 죽은 꿀벌과 같은 케이지 환경에서 물체를 간단하게 추가하거나 제거 할 수 있습니다. 그러나 일반화 된 바이러스 분석 프로토콜은 이러한 유형의 케이지 또는 식단 선택에 국한되지 않으며 실험 요구에 맞게 수정되어야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig01.jpg"> 그림 1 : 애벌레 자체 제거 프로토콜 중 다양한 단계의 대표적인 이미지. (a) 밤새도록 자가 제거 기간 (1.6) 이후에 예상되었던 유충 질량의 예. (B) 별도의 주사 / 성장 트레이 (1.6.3) (C, D) 바이러스 주사 준비가 된 흰 눈 번데기 (1.9)에서 서로 떨어져 있는 유충. 갈색 반점은 제거 할 필요가없는 말린 애벌레 찌꺼기입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig02.jpg"> 그림 2: 피하 주사 바늘과 다중 디스펜서 팁을 결합하여 만든 인젝터 장치의 예. 바늘 및 팁을 액체 접착제를 사용하여 접합시켜 반복 피펫터에 부착할 때 1 μL 유체 주사를 일관되게 전달하였다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig03.jpg"> 도 3: 바이러스 생물분석에 사용된 실시예 케이지. 수크로오스 용액과 꽃가루는 시험 기간 동안 피더 구멍에도 불구하고 Ad libitum 을 제공받았다. 바이러스 접종물은 케이지의 바닥을 통해 삽입된 트레이를 사용하여 쉽게 전달될 수 있었다. 케이지 유형 및 피더 함량은 실험 매개 변수에 맞게 필요에 따라 조정할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig04.jpg"> 그림 4: 4개의 샘플 콜로니로부터의 바이러스 제제에 걸친 평균 총 바이러스 부하 및 비율. 바이러스 부하를 100 ng RNA에서 블랙 퀸 세포 바이러스 (BQCV) + 변형 날개 바이러스 (DWV) + 이스라엘 급성 마비 바이러스 (IAPV) + 사브루드 바이러스 (SBV) 게놈 등가 (ge)로서 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 각 샘플 콜로니는 원래 IAPV와 함께 주사된 150개 이상의 균질화된 번데기로 구성되었으며, 번데기 바이러스 주입 프로토콜로부터 생성된 바이러스 비율의 전형적인 범위를 나타낸다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61725/61725fig05.jpg"> 도 5: 꿀벌 생물분석 케이지의 용량-반응 생존 곡선. 2018 (A) 및 2019 (B)의 케이지를 IAPV로 접종하고 시험 기간 동안 30 % 수크로오스 용액 Ad libitum을 공급했습니다. 처리는 30% 수크로오스 용액에 혼합된 1% 내지 0.1% IAPV 입자 제제를 나타내는 10-2 내지 10-4로 IAPV 접종 농도를 나타내고; 대조군 수크로오스 접종은 바이러스를 함유하지 않았다. n = 56에서 2018 총 케이지; n = 77의 2019 총 케이지. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/61725fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 네 개의 샘플 콜로니로부터의 네 개의 바이러스 제제 내의 바이러스 혼합물의 100 ng RNA 당 평균 역치 주기 (Ct) 값 및 게놈 등가물. 각 샘플 콜로니는 번데기 바이러스 주입 프로토콜로부터 생성된 150개 이상의 균질화된 번데기로 구성된다. 바이러스는 각 바이러스에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-qPCR에 의해 검출되었다. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61725/Table_1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K 조회수.  University of Illinois. 여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

꿀벌의 코 확장 응답 클래식 컨디셔닝에 Behavioural 약리학 ( 아피스 mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

연구

신경과학

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

환경과학

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

촉각 시설과 꿀벌에 Antennal 샘플링 전략의 움직임 분석 (<em&gt; API를 mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

면역학 및 감염병학

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

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실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

촉각 시설과 꿀벌에 Antennal 샘플링 전략의 움직임 분석 (

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (

의 전파

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염