이 방법은 단백질 확인 및 단백질 상호 작용의 측정을 용이하게합니다. 완충 조성물, 시료 순도 및 단백질 농도 요구 사항은 유연하여 까다로운 구조적 문제를 해결할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 다양한 버퍼 시스템에서 샘플을 압축할 수 있습니다.
우리의 dosimetry 방법을 사용하여, 연구원은 그들의 레이블링 반응이 실시간으로 얼마나 잘 작동하는지 감시할 수 있습니다. 이 기술의 한 응용 프로그램은 연구원이 널리 다른 약물 제형과 단백질 구조에 미치는 영향을 테스트 할 수 있기 때문에 약물 개발에 있습니다. FPOP 광학 벤치를 준비합니다.
먼저 레이저를 켜고 레이저를 외부 트리거, 일정한 에너지 및 가스 교체로 설정합니다. 레이저가 따뜻해지면 펄스당 레이저 에너지를 펄스당 80~120밀리그램으로 설정하고 부탄 토치를 사용하여 인라인 도지미터가 레이저 노출 후 265나노미터에서 흡수성 신호를 판독하는 지점에서 모세관의 폴리이미드 코딩을 부드럽게 태울 수 있습니다. 보풀이 없는 와이프와 메탄올을 사용하여 모세관의 잔해를 부드럽게 닦고 청소된 모세관을 레이저의 빔 경로를 통해 인라인 도시계에 넣습니다.
인라인 도지계 상단의 레버를 눌러 힌지를 열고 자기 홀더를 제거합니다. 모세관을 마그네틱 홀더를 사용하여 인라인 도지계의 기계 홈에 모세관을 배치하여 모세관을 제자리에 유지하고 레버가 제자리에 잠기 때까지 힌지를 누르는 모세관 위에 도시계 힌지를 닫습니다. 도시메트리 소프트웨어의 시작 플래시 버튼을 클릭하여 엑시머 레이저를 발사하기 시작하고 레이저 발사로 도시메트리 소프트웨어에서 10~20 헤르츠 사이의 사전 설정 반복 속도를 설정하여 이동 범위를 통해 전동 스테이지를 이동하여 빔이 조리개 에 중심을 유지하고 모세관의 실루엣을 전체적으로 관찰할 수 있도록 합니다.
그런 다음 모세관을 분당 20 마이크로리터에서 1분 이상 물로 플러시하고 데이터 수집을 시작하기 전에 도시계 소프트웨어의 시작 데이터와 자동 0을 클릭하여 물으로 도시계를 0으로 클릭합니다. FPOP 실험을 수행하려면 과산화수소 2마이크로리터를 FPOP 용액 18마이크로리터에 추가하고 파이펫을 사용하여 원심분리에 의해 튜브 바닥의 용액을 신속하게 수집하고 즉시 가스가 단단한 주사기를 사용하여 용액을 주사기 펌프에 로드합니다. 측정기 소프트웨어에서 펌프를 시작하고 데이터를 시작하여 적절한 유량으로 주사기 펌프의 흐름을 시작하고 인라인 도지계를 사용하여 265 나노미터의 흡수신호가 폐기물 용기에서 시료를 수집안정화할 때까지 실시간 아데닌 판독값을 모니터링합니다.
사전 설정된 반복 속도 엔드 에너지에서 레이저를 발사하기 시작하려면 도시계 소프트웨어의 시작 플래시 버튼을 클릭하고 인라인 도시계를 사용하여 실시간 아데닌 판독값을 모니터링합니다. 레이저끄기와 레이저가 켜진 265 나노미터의 흡광도차이는 265나노미터 판독에서 델타 흡수제가 될 것입니다. 비교 가능한 하이드록실 라디칼이 다른 시료에 걸쳐 단백질과 반응할 수 있도록 합니다.
인라인 도지계로 얻은 265 나노미터 판독값에서 델타 흡수제와 이전 실험 또는 제어에서 얻은 265나노미터 판독값의 델타 흡수제와 비교합니다. 판독값이 원하는 수준에 있는 경우 담금질 버퍼에서 레이저 또는 방사선 직후 샘플을 수집한다. 흡광도 판독값을 균등화하는 효과적인 라디칼 용량을 보정하여 과산화수소 농도를 변화시키고, 펄스당 레이저 에너지를 변화하거나, 레이저 플루언스를 증가시키기 위해 초점 렌즈의 초점 평면을 변경한다.
델타 흡수제에서 10밀리 이상의 흡광도 단위 를 변경하려면 과산화수소가 다소 있는 시료를 리메이크하고 시연된 대로 시료를 재실행한다. 흡광도 판독을 실시간으로 작은 변화시키기 위해 50mm 전동 스테이지를 사용하여 초점 렌즈의 위치를 조정하여 인시던트 빔의 초점 평면을 조정합니다. 레이저 방사선 후 시료에 존재하는 활성량의 하이드록실 라디칼라디칼의 유효량을 측정하기 위해 265 나노미터 판독에서 델타 흡수제가 원하는 판독과 같을 때까지 전동 스테이지를 사용하는 인라인 UV 모세관 검출기를 사용하여 실시간으로 265 나노미터에서 아데닌 델타 흡수체를 모니터링한다.
인산염 완충제에서 아딜루무맙 바이오시밀러의 중사슬 펩티드 발자국을 비교하고 1시간 동안 섭씨 55도에서 가열한 후 표시된 펩티드 영역이 단백질이 응집체를 형성하도록 가열될 때 용매로부터 상당한 보호를 입증한다는 것을 알 수 있다. 레이저 또는 방사선 전후의 아데닌 흡수제의 차이를 실시간으로 모니터링하기 위해 인라인 도지계를 사용하면 인산염 완충액에 비해 MES 버퍼에서 아데닌 흡수제 수준의 유사한 변화가 관찰되고 있음을 나타낸다. 펩티드의 평균 산화는 인산염 완충제에 비해 MES 버퍼의 존재가 낮지만.
그러나, 레이저 유동이 증가함에 따라 평균 펩티드 산화 값은 FPOP 및 MES 버퍼 및 인산염 버퍼 후 거의 동일하다. 도시트리 판독은 레이저 플루엔트 과산화수소 농도뿐만 아니라 급진적 인 청소부에 의해 영향을받습니다. 샘플 조사 사이의 도시에이트 응답이 서로 가까이 있다는 것을 주의하십시오.
사이트 지시 돌연변이 발생은 종종 FPOP에서 보호되는 사이트를 조사하는 데 사용됩니다. 이를 통해 연구자들은 알리스테어에 대한 변경 사항이 있는지 확인할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 단백질 확인에 다른 첨가제의 효력을 결정할 수 있도록 다른 완충제 또는 제형에 있는 단백질의 비교를 용이하게 합니다.
