이 프로토콜은 담배 연기가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 세균부하에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 3개의 접근을 이용합니다. 이 방법은 내피 세포 또는 다른 세포 탭으로 확장될 수 있다. 담배 연기 추출, 세균 감염 및 세균 부하와의 결정의 준비는 이 비디오에서 자세히 설명되어 있습니다.
이 절차는 새로운 사용자를 위해 따라하기가 매우 쉽습니다. 60 밀리리터 주사기에 혈청없는 세포 배양 배지의 10 밀리리터를 그립니다. 트림의 좁은 끝을 1 밀리리터 파이펫 팁에 주사기의 노즐에 부착하고 담배를 잡을 어댑터로 연결합니다.
담배에서 필터를 제거하고 어댑터에 담배를 부착합니다. 분석 작업을 수행하기 30 분 전에 담배를 연소하고 주사기에 공기를 포함하는 연기 40 밀리리터를 그립니다. 주사기를 힘차게 흔들어 미디엄과 연기를 섞는다.
담배가 완전히 소진 될 때까지 그리기 과정을 반복하여 약 7 분 안에 약 11 개의 무승부가 필요합니다. 매체에서 미생물 및 불용성 입자를 제거하려면 0.22 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 그런 다음, 중간을 폐쇄멸균튜브로 이송한다.
선택한 슈도모나스 균주와 트립틱 콩 국물 또는 TSB 오거 플레이트를 접종한다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양하십시오. 탄소 공급원으로 5%의 글리세롤을 함유한 20밀리리터TSB를 포함하는 튜브를 준비합니다.
오거 플레이트에서 얼룩을 수집하고 TSB를 접종합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 약 1 시간 동안 200 RPM에서 37섭씨 37도 쉐이커에서 슈도모나스 서스펜션을 배양한다. 원고에 설명된 바와 같이 폐 상피 세포를 배양한 후 세포에 0.25%의 트립신을 1밀리리터를 추가합니다.
약 5분 후, 세포가 플레이트 바닥에서 완전히 분리되었을 때 트립신을 중화시키기 위해 전체 Heights 배지의 10 밀리리터를 추가합니다. 세포를 15 밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 300회 G.Remove하고 슈퍼나티를 폐기합니다.
그런 다음 10%의 FBS를 통해 셀을 Heights 배지의 밀리리터로 다시 일시 중단합니다. 피펫 10 새로운 플레이트에 상피 셀 서스펜션의 마이크로 리터. 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 얻습니다.
밀리리터당 5번째 세포에 3회 10분의 10의 농도로 폐 상피 세포를 플레이트, 잘 당 중간 의 총 2 밀리리터의 총 부피. 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 배지를 Heights 배지와 1%FBS로 대체합니다.
그런 다음 우물에 4 %의 CSE를 추가하고 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다. CSE 처리폐 상피 세포의 각 웰에 슈도모나를 추가합니다. 그런 다음, 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 1 시간 동안 플레이트를 배양.
다음으로, 6개의 웰 플레이트의 배지를 젠타마이신밀리리터당 4%CSE와 100마이크로그램을 함유한 2밀리리터의 신선한 하이츠 배지로 교체합니다. 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양한 후 우물에서 배지를 흡인시합니다. 겐타마이신 처리 세포를 두 번 씻어 차가운 PBS의 두 밀리리터로 씻으신다.
폐 상피 세포의 박테리아 부하는 낙하 플레이트 방법, qRT-PCR 또는 유동 세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 폐 상피 세포의 각 우물에 세포 리시스 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 1에서 10에서 10, 000에 이르는 셀 용양의 직렬 희석을 복구합니다.
그런 다음 TSB 오거 플레이트를 접종합니다. 16시간의 배양 후, 세균성 식민지수를 계산하여 폐 상피 세포에 얼마나 많은 식민지 형성 유닛이 존재했는지 결정한다. 관니디늄 티오세네이트 리시스 버퍼의 0.35 밀리리터를 폐 상피 세포의 각 웰에 추가합니다.
셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 리세이트 파이펫은 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 파이펫과 부드럽게 섞습니다. lysate에 70%에탄올에 신선하게 준비된 0.35 밀리리터를 넣고 잘 섞습니다.
모든 샘플을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 전송합니다. 원심 분리는 10, 000 배 G 및 섭씨 20 ~ 25도에서 30 초 동안 수집 튜브를 분리합니다. 수집 튜브의 버퍼를 버리고 0.7 밀리리터의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
30초 동안 10, 000배 G로 컬럼을 원심분리합니다. 버퍼0.5 밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. 원심분리를 10회, 000회 G로 2분간 반복합니다.
컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 넣고 RNase 가 없는 물 30~50마이크로리터를 추가합니다. 10, 000회 G에서 튜브를 원심분리한 후, 1분 동안 의 흐름을 수집하고 RNA 농도를 측정한다. 20 마이크로리터 역전사 반응을 준비하기 위해 반응 버퍼 10마이크로리터, 역전사 및 RNase 가 없는 물의 마이크로리터 10마이크로리터를 가진 총 RNA의 마이크로그램 1마이크로그램을 만듭니다.
제조업체의 프로토콜에 따르면 1시간 동안 섭씨 37도에서 역전사 반응을 수행한 다음 섭씨 95도에서 5분간 진행합니다. 그런 다음 각 cDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 사이버 염료를 포함하는 마스터 믹스의 5개의 마이크로리터와 각각 200나노몰러 특이적 프라이머의 1개의 마이크로리터를 혼합한다. 총 20마이크로리터에 물을 추가합니다.
제조업체의 권장 사항에 따라 PCR 분석을 수행합니다. 그런 다음 비교 CT 방법을 사용하여 식을 결정합니다. BEAS-2B 세포에서는 세포가 3시간 동안 4%CSE로 치료되었을 때 생존가능성은 크게 변하지 않았습니다.
슈도모나스 감염으로 한 시간도 생존가능성에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, 그들은 배양 배지에서 슈도모나를 죽이기 위해 젠타마이신을 사용하여 세포 생존에 통계적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 낙하 플레이트 방법에 의해 측정된 바와 같이, BEAS-2B 세포내세균감염은 CSE를 이용한 치료에 의해 실질적으로 증가하였다.
HSAEC의 CSE 치료에도 마찬가지였습니다. CSE 처리BEAS-2B 세포의 세균감염은 또한 슈도모나스 아에루기노사의 증가를 나타내는 16S rRNA의 양을 정량화하기 위해 RT-PCR을 사용하여 평가되었다. CSE로 처리되고 슈도모나스 형광미굴라에 감염된 BEAS-2B 세포는 509 나노미터에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었다.
결과는 또한 CSE 처리가 세균성 감염을 증가시킨다는 것을 표시했습니다. 형광 현미경 검사법의 결과는 GFP 표지된 박테리아가 슈도모나스 형광소 미굴라 감염 실험에서 BEAS-2B 세포와 공동 국화되었다는 것을 보여주었습니다. 세포는 인간의 행동을 모방하고 직접 폐 상피 세포에 담배 연기의 효과를 연구 할 수 있도록 할 수있는 로봇 흡연과 담배 연기에 노출 될 수있다.
이 기술은 폐 감염의 맥락에서 그밖 세포 탭에 담배 연기를 탐구하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 기술된 접근은 담배 연기가 나는 폐 상해 및 C0PD 추가에 대하여 효과적인 치료의 발달을 위한 기초가 될 것입니다
