대부분의 옥수수 근친선은 기존의 변형 프로토콜을 사용하여 유전적으로 변형될 수 없습니다. 여기서는 빠르고 덜 유전자형에 의존하는 QuickCorn 변환 방법을 설명합니다. QuickCorn 방법은 옥수수 전사 요인 베이비 붐과 WUSCHEL을 활용합니다.
변형 벡터 시스템에 통합될 때, 이 유전자는 배아제 성장을 자극하기 위하여 시너지 효과적으로 작동합니다. 기존의 옥수수 변환 프로토콜과 달리 QuickCorn 방법은 변환 중에 callus 유도 단계를 포함하지 않습니다. 우리의 일에 사용된 이진 벡터의 T-DNA 지역은 3개의 중요한 분대, 형태성 유전자, 마커 유전자 및 cre/loxP 재조합 시스템을 포함합니다.
열 유도 된 cre/loxP 재조합 시스템은 식물 발달에서 정상적인 callus 재생을 허용하기 위해 옥수수 게놈에서 형태 성 유전자를 제거하기 위해 T DNA에 포함되었다. 실크가 나타난 지 약 2~3일 후에 꽃가루가 나올 경우 실크와 껍질을 70% 에탄올 멸균 가위로 자르고, 껍질 잎 끝 아래 약 2 1/2센티미터를 자르고 실크가 등장하는 촬영 백으로 실크를 덮습니다. 마취가 술에서 나오면 술조각을 태슬 백으로 덮고 가방 바닥에 비스키드 종이 클립을 놓습니다.
태슬 백을 놓은 다음 아침, 식물을 부드럽게 구부리고 가방을 탭하여 꽃가루가 방출될 수 있도록 합니다. 그런 다음 술 봉투를 제거하고 꽃가루가 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 가방 의 상단을 접습니다. 수령인 식물을 수분하기 위해 실크를 노출하고 술 가방에서 실크에 꽃가루를 빠르게 붓습니다.
수분처리된 귀를 태슬 백으로 즉시 덮고, 스테이플로 줄기 주위의 가방 의 베이스를 고정합니다. 미숙한 배아 크기를 확인하기 위해, 수분 후 9~12일 후에 껍질을 부드럽게 당겨 귀 둘레의 약 1/3 내지 1/4, 귀 아래 거리의 약 1/3에서 커널을 노출시한다. 메스를 사용하여 크기와 색상의 다른 커널의 대부분과 유사한 단일 커널의 캡을 슬라이스하고, 배아를 추출하는 눈금자와 주걱을 사용합니다.
그런 다음 눈금자 또는 캘리퍼를 사용하여 배아의 길이를 측정합니다. 수확 후 1~4일 이내에 수확된 귀에서 껍질과 실크를 제거하고 각 귀의 상단이나 베이스에 적절한 핸들을 삽입합니다. 핸들이 위로 향하는 멸균 라미나르 플로우 후드에 소독 표백액의 큰 용기에 귀를 담급.
20분 후, 신선한 멸균 증류수의 넉넉한 볼륨으로 귀를 세 번 헹구고, 귀를 몇 분 동안 건조시로 씻는다. 다음으로 귀당 2밀리리터 미세센심분리기 튜브 1개를 700A 액체 배지로 채우고 멸균 메스를 사용하여 각 커널 크라운의 상단 1~2밀리미터를 제거하여 귀의 내정자를 노출시합니다. 코브에 부착될 때 귀 끝을 마주보고 있는 측면의 커널 내의 미숙한 배아를 찾습니다.
상단 핸들러 와 오른손잡이 연산자의 경우, 큰 멸균 페트리 접시에 귀를 휴식하고 배아에서 가장 멀리 떨어진 복근의 내피에 마이크로 주걱을 삽입하십시오. 부드럽게 위쪽으로 비틀어 내정자를 빼내고 배아를 노출시키고 주걱을 사용하여 700A 액체 배지의 한 튜브에 조심스럽게 배치합니다. 왼손으로 귀를 잡고 있는 베이스 핸들러 작업자의 경우 배아에서 가장 멀리 떨어진 복근의 내정자에 마이크로 주걱을 삽입하고 부드럽게 위쪽으로 비틀어 내정자를 제거합니다.
Agrobacterium 현탁액 배양에서 배아를 배양하기 위해 갓 준비된 작업 플레이트에서 700A 액체 배지의 10 밀리리터로 박테리아를 수집하고, 소용돌이를 통해 박테리아 문화를 완전히 중단한다. 550 나노미터의 파장에서 광학 밀도를 측정하고, 신선한 700A 배지의 1 밀리리터로 배아를 세척한다. 아그로박테리움 현탁액의 1밀리리터에 배아를 담그고, 30초 동안 낮은 설정에 소용돌이를 가합니다.
각 튜브의 전체 내용을 562V 공동 재배 배지의 개별 플레이트에 전달하기 전에 5 분 동안 수평 방향으로 튜브로 벤치에 배아를 정착시킵니다. 부드럽게 균등하게 배아를 배포하기 위해 판을 소용돌이, 과잉 Agrobacterium 현탁액을 흡인. 조심스럽게 배아를 손상시키지 않도록주의를 기울여 돔 모양의 측면을 향하고 있는 배아를 지향합니다.
그런 다음 접시를 플라스틱 상자에 넣고 어둠 속에서 섭씨 21도에서 하룻밤 동안 잠식합니다. 다음날 아침, 감염된 배아를 휴식 매체 605T에 조심스럽게 옮기고, 판당 약 30개의 배아를 올려 놓고, 스커텔룸 쪽은 어둠 속에서 섭씨 26도에서 4-10일 배양을 한다. 약 7 일에서, 체세포 배아 발달은 zygotic scutellum의 표면에 관찰될 수 있습니다.
휴식 기간이 끝나면 2시간 동안 상대 습도가 70%인 섭씨 45도 인큐베이터에 배아 상자를 넣은 다음 어둠 속에서 섭씨 26도에서 1~2시간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 선택적인 에이전트로 제초제 imazapyr의 리터 당 05 밀리그램으로 보충 촬영 형성 매체의 개별 접시에 10 에서 15 열 충격 미성숙 배아를 배치합니다. 필요에 따라 콜리파탈을 조심스럽게 제거하고 배아를 2주 동안 섭씨 26도의 다크 인큐베이터로 되돌려 보세요.
인큐베이션이 끝나면 접시당 약 8개의 조직을 1~2주 동안 배양시 중간 접시에 전달하여 16시간의 빛과 8시간의 어두운 시간을 섭씨 27도에서 전달합니다. 화분이 발달함에 따라 7~14일 동안 발사와 격렬한 뿌리를 모두 포함하는 하나의 더 강한 화분1개를 빛 아래 루핑 매체의 개별 접시에 놓습니다. 완전히 개발되지 않은 촬영이 토양으로 이동할 준비가 될 때까지 다른 1 ~ 2 주 동안 동일한 매체에서 배양 할 수 있도록합니다.
식물이 더 활발해지면 수돗물로 뿌리를 헹구어 한천을 제거하십시오. 그런 다음 개별 식물을 배수 구멍이있는 트레이에 미리 젖은 토양없는 기판을 포함하는 3 인치 냄비로 이식하고 플라스틱 습도 돔의 유무에 관계없이 성장 챔버에 트레이를 놓습니다. 냄비 이송 후 9~14일, 토양으로 각 화분을 1.5갤런 냄비로 이식합니다.
제어 방출 비료를 냄비에 추가하고 온실에서 식물을 유지합니다. 귀 싹이 공장에서 나타나기 시작하면 반투명 촬영 백을 사용하여 촬영을 덮어 가방을 제거하지 않고도 신흥 실크를 관찰 할 수 있습니다. 그런 다음 입증 된 대로 개발의 적절한 단계에서 식물을 수분.
옥수수 귀는 일반적으로 수분 후 9~12일 수확됩니다. 1.5와 2 밀리미터 사이의 길이를 가진 미성숙 태아는이 프로토콜에 대한 변환을위한 최고의 항문입니다. 감염 후 8일 후, ZsGreen 발현 체형 배아는 형광 현미경 검사법에 의해 시각화될 수 있다.
감염 후 8일 간 열처리는 두 loxP 부위 사이에 상반된 형태성 유전자, cre 및 ZsGreen 발현 카세트의 절제를 초래하여, cre 재조합발현을 유도한다. 제초제를 함유한 촬영 형성 매체에 3~4주 간의 배양 후, 성숙배아로 조직을 증식하거나 제초제에 내성있는 싹을 쏘는 것을 관찰할 수 있다. 제초제 내성 조직의 일부는 ZsGreen에 대 한 부정적인 수 있습니다., cre 매개 절제 가능성이 이러한 조직에서 발생 제안.
중간 및 빛 배양을 근절하기 위해 조직을 이동 한 후, 건강하고 활발하며 잘 발달 된 뿌리로 성장하는 싹을 수확 할 수 있습니다. 일부 조직은 동일한 균질 통합 패턴을 갖는 복제 식물로 인해 여러 싹을 가지고 있는 것처럼 보일 수 있습니다. QuickCorn 방법은 옥수수 변환 효율성을 크게 개선하고 변형 가능한 유전자형 목록을 확장할 수 있습니다.
이 프로토콜은 최소 옥수수 변환 교육을 받은 연구원에 의해 성공적으로 재현될 수 있습니다. QuickCorn 방법을 사용하여, 뿌리 식물은 감염의 날 후에 단지 5 7 주에 토양으로 전송할 준비가 되어 있어야 합니다. 중간 구성, 하위 문화의 타이밍 및 온도 및 조명 조건에주의를 기울이는 다.
시작 재료의 품질은 성공적인 변환을 위해 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용되는 화학 물질, 표백제 용액 및 제초제는 생물위험입니다. 사용 중에 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
