심근세포 활성에 대한 상이한 검소성 액추에이터의 생체 물리학 적 효과로 프로토콜을 사용하여 심장 조직 및 전체 심장에서 광유전학 실험의 발달을 돕기 위해 테스트 할 수 있습니다. 패치 클램프 기술과 사코메레 추적 및 탄소 섬유 보조 힘 측정을 결합하여 GtACR1 광활성화가 심실 심근세포의 전기 및 역학에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 광유전학 적 억제는 잠재적으로 광학 제세동에 사용될 수 있습니다.
GtACR1은 심장 활동의 침묵을 가능하게 하는 광유전학 공구입니다. 이 기술은 매끄러운 및 단세포 근육 세포 연구와 같은 다른 연구 분야에 완전히 적용 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수 없지만 심근세포 전기 및 기계적 기능의 포괄적인 분석을 위한 수단을 제공합니다.
속담이 진행됨에 따라 그림은 천 단어 이상을 말합니다. 비디오에서 얼마나 많은 정보를 얻을 수 있습니까? 단일 심낭 스트레칭 및 프로브 준비에 관련된 도구와 기술 중 일부는 매우 복잡하며 설명에 비해 비디오에서 전달하는 것이 훨씬 쉽습니다.
9에서 10 주 된 뉴질랜드 흰 토끼에서 식염수에서 심장을 씻어 낸 후, 저칼슘, 높은 칼륨 용액으로 배설물을 전환하고 심장박동이 멈춘 후 2 분 동안 심장을 퍼프합니다. 효소 용액을 흡수하고, 2분간의 소화 후 효소 용액을 다시 저수지로 재순환하고, 소화 5분 후 분당 16밀리리터로 속도를 줄입니다. 40-50분간의 소화 후 조직이 부드러워지면, 심장을 잘라내고 즉시 심장을 차단용액에 놓습니다.
조직이 완전히 다뤄질 때까지 차단 용액을 추가합니다. 오른쪽 심실과 중격을 잘라 왼쪽 심실을 분리합니다. 유두 근육을 제거하고 미세 한 집게와 파이펫을 사용하여 조직을 부드럽게 분리하여 기계적 해리에 의해 세포를 방출합니다.
1밀리미터 제곱 모공과 원심분리에 의한 퇴적물로 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. 그런 다음 심근세포 펠릿을 신선한 차단 용액으로 다시 중단합니다. 패치 클램프 실험을 위해, 세포 배양 직전에 라미닌 밀리리터 당 100 마이크로그램으로 페트리 접시에 오토클레이브 커버립을 코팅합니다.
탄소 섬유 실험을 위해 페트리 접시에 폴리-HEMA 밀리리터 당 0.12그램을 95-5에 대수 용액으로 코팅하십시오. 심근세포를 다시 중단한 후 10~15분 동안, 상체를 제거하고 배양 배지에서 세포를 재연한다. 계산 후, 밀리리터 당 4개의 세포에 1.75배의 표적 밀도로 페트리 접시의 커버슬립에 세포를 시드한다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3~4시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 75의 감염의 복합성에서 GtACR1-eGFP에 대한 아데노바이러스 유형 5 코딩을 포함하는 신선한 배지로 커버슬립 배양에서 배지를 교체한다. 문화를 인큐베이터에 48시간 동안 되돌려 보입니다.
패치 클램프 실험을 수행하려면 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 소다 라임 유리 모세혈관에서 1.7~2.5메가옴 패치 파이펫을 끌어당겨 데이터 수집 소프트웨어를 초기화합니다. 외부 용액을 포함하는 측정 챔버에 세포가 있는 커버슬립을 넣고 eGFP 형광에 기초하여 심근세포를 선택합니다. 다음으로 패치 파이펫을 내부 용액으로 채우고 피펫을 피펫 홀더에 부착하여 실버 염화물 코팅 실버 레코딩 와이어를 내부 솔루션에 삽입합니다.
멤브레인 테스트를 설정하여 10밀리볼트 펄스를 15밀리초 동안 0 밀리볼트의 기준선으로 적용합니다. 셀 부착 된 구성에 도달 한 후 데이터 수집 소프트웨어에서 마이너스 60 밀리볼트의 보유 잠재력을 가진 전체 셀 모드로 전환하십시오. 그런 다음 음압을 부드럽게 적용하여 멤브레인을 파열하여 전체 세포 구성에 액세스합니다.
성공적인 파열은 측정된 커패시턴스의 즉각적인 증가에 의해 입증될 것입니다. 전압 클램프 모드에서 300밀리초의 광 펄스 또는 제로 피코암페어의 동작 잠재력을 기록합니다. 탄소 섬유를 생산하려면 먼저 파이펫을 풀러의 파이펫 홀더에 장착하십시오.
유리 모세 혈관을 총 테이퍼 길이약 11mm와 약 30 마이크로미터의 최종 내지름으로 두 개의 파이펫으로 당깁니다. 다음으로, 스테레오 현미경을 사용하여 방향 원에 하나의 모세관을 정렬하고 벤더로 모세관의 끝을 아래로 밀어 최대 45도 구부립니다. 모세관이 벤더를 제거한 후에도 45도 각도를 유지할 때까지 필라멘트를 가열합니다.
모세관을 구부린 후 부드러운 튜브가 장착 된 미세 한 포셉을 사용하여 튜브에서 탄소 섬유 1 개를 꺼내 모세관의 미세 한 끝에 맞춥시게하십시오. 모세관의 섬유를 굴곡까지 밀어 넣습니다. 탄소 섬유를 잘라서 모세관 끝에서 2 밀리리터를 투사하고 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 섬유를 각 모세혈관의 전면 섹션에 고정시하십시오.
섬유를 보정하려면 미세 조작기와 압착기 모터에 의해 제어되는 홀더에 하나의 모세관을 부착하십시오. 모세관을 센서쪽으로 이동하고 센서를 기준으로 정렬합니다. 힘을 생산하지 않고 힘 센서와 접촉섬유의 끝을 배치합니다.
압제 모터의 총 움직임은 60 마이크로미터입니다. 압전 모터를 6개의 10마이크로미터 단계로 힘 센서쪽으로 이동합니다. 센서는 볼트당 0.05 밀리뉴턴의 감도와 0~0.5밀리뉴턴의 힘 범위를 가지고 있습니다.
각 단계에 대한 측정 된 전압을 읽고 센서에서 탄소 섬유를 제거합니다. 수축 심근세포의 힘을 기록하려면 폴리-HEMA로 커버글래스 표면을 코팅하고 측정 챔버에 놓습니다. 외부 목욕 용액으로 챔버를 채웁니다.
탄소 섬유가 적재된 모세혈관을 모두 단계 미세 조작기에 부착하고 각도로 정렬하여 탄소 섬유가 측정 챔버의 표면과 수평에 가깝게 되도록 합니다. 섬유가 올바르게 정렬되었는지 확인하려면 측정 챔버의 표면에 초점을 맞추고 첫 번째 섬유를 낮추고 섬유를 수평으로 이동하십시오. 섬유의 끝은 측정 챔버의 표면에 슬라이딩해야합니다.
두 번째 섬유에 대해 동일한 절차를 따르십시오. 조명이 꺼지면 챔버에 배양 된 셀 서스펜션 몇 방울을 추가하고 짧은 녹색 광 펄스를 적용하여 녹색 광 자극에 반응하여 수축되는 세포를 선택합니다. 첫 번째 섬유를 부착하려면 섬유를 낮추어 세포를 부드럽게 압축한 다음 압력을 방출합니다.
두 섬유 사이에 최대 수의 사코프레를 갖기 위해 심근세포의 다른 쪽 끝에 있는 제2 섬유를 평행하게 부착한다. 두 섬유가 부착된 후, 세포가 더 이상 챔버 표면과 접촉하지 않도록 섬유를 들어 올립니다. sarcomeres를 초점으로 가져오고, 섬유 사이에 sarcomere 길이 추적 창을 설정하고, 가장자리 감지 모듈을 사용하여 섬유 굽힘을 추적합니다.
빨간색 및 녹색 창으로 감지 영역을 설정하고 광 강도 추적의 첫 번째 유도체에서 임계값을 정의합니다. 사컴레 길이와 섬유 굽힘 추적하면서 셀의 전광적으로 속도를 내립니다. 이 경우, 우리는 0.25 헤르츠에서 진행.
적어도 15개의 광학적으로 유도된 수축을 기록한 후, 필드는 전적으로 세포를 자극한다. 수축을 유도하기 위한 임계값을 찾아 전기 적 속도의 임계값 전압의 1.5배를 적용합니다. 억제 프로토콜의 경우, 수축을 유도하기 위해 전기 자극을 적용한 다음 다양한 광 강도에서 지속광 펄스에 세포를 노출시한다.
빛 유도 억제 후 적어도 15 수축을 기록한다. GtACR1은 배양된 토끼 심근세포로 표현된다. 300밀리초 동안 제곱된 밀리미터당 4밀리와트의 광도에서 GtACR1 광활성화는 245피쿠암페어의 측정된 피크 전류로 마이너스 74 밀리볼트의 큰 내향 전류를 생성합니다.
이 대표적인 실험에서, 작용 잠재력은 현재 주사로 전기적으로 트리거되거나 임계값의 1.5배 또는 10밀리초 광 펄스를 가진 광학적으로 발동되었다. 광학적으로 진행된 심근세포는 느린 작용 전위 발병을 입증했습니다. 전기적으로 트리거된 작용 잠재력은 지속적인 빛 하에서 억제되었다.
높은 전류 주사 및 1.5 지속적인 빛 응용 프로그램 동안 임계값의 배도 작업 잠재력을 유도하지 않습니다. 심근세포는 전기 적 도면에 제곱 밀리미터 당 232 마이크로 뉴턴의 수축 력을 생성하고 광학 적 도면 에 따라 제곱 밀리미터 당 261 마이크로 뉴턴. 장기간 된 녹색 빛 펄스는 토끼 심근 세포에서 확장칼슘 손실에 따라 낮은 수축력을 생성 하는 후 억제 재발 수축수축을 억제.
실험을 수행하기 전에 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 근구 세포 수축을 분석할 때 매우 중요합니다. 등소 및 보조 수축 해석에도 다양한 후하가 적용될 수 있다.
이 기술은 각 실험에 가장 적합한 광유전학 공구를 선택하는 데 중요한 심근세포에서 새로 개발 된 광유전학 액추에이터를 활성화시키는 생물 물리학적 효과의 특성화를 허용합니다. 아데노바이러스 트랜스듀션및 트랜스듀션 다음의 모든 단계는 생물안전 수준 II 조건하에서 수행되어야 합니다.
