이 프로토콜은 우리가 지금 3D 암 모형에서 상세히 migrastatic 억제제의 효력을 결정할 수 있다는 것을 보여주고 있습니다. 주요 장점은이 기술을 수행 할 수있는 용이성과 올인원 접근 방식입니다. 이 기술은 3D 조정에 있는 암 연구에서 미그레정성 약의 평가를 허용하고, 더 종양 환경 관련 조정에 있는 약의 시험을 허용합니다.
이 방법은 암에 있는 세포독성 약의 시험에 적용될 수 있고, 예를 들면, 암 증식 및 세포 이동에 방사선의 효력을 평가하기 위하여. 중간 제거 단계와 콜라겐 교체를 일반 96웰 플레이트로 연습하여 자신감이 되는 것이 유용합니다. 또한, 공초점 현미경에 대한 교육은 필수적입니다.
이 기술의 시각적 데모는 연구원이 구체형의 필수 섬세한 취급과 공초점 현미경 검사법에서의 사용을 이해하는 데 중요합니다. 실험 첫날에는 표준 배양 배지가 있으며, 이 경우 U251은 적절한 세포주에 대비한다. 조직 배양 후드에서, 암세포를 트립시니화하기 위해 배양에 트립신의 0.5 밀리리터를 추가합니다.
혈종계에 암세포를 계산하고 밀리리터 당 세 번째 세포에 5 배 10의 농도로 희석. 세포 현탁액을 명확하게 표지된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오. 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 세포를 다시 중단합니다.
파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양의 200 마이크로리터를 추가합니다. 증발을 피하기 위해 빈 웰에 1X PBS200 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
24 시간 후에, 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 세포를 확인하십시오. 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 이내에 우물 의 바닥에 있는 스페로이드를 형성한다. 3D 셀룰러 아키텍처가 형성되도록 48시간 동안 스페로이드를 배양합니다.
셋째 날에는 콜라겐, 5X 배양 배지, 수산화 나트륨 1개, 얼음 위에 20밀리리터 튜브 1개를 배치합니다. 차가운 컬러젠 10.4 밀리리터를 차갑게 식힌 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오.
그런 다음, 냉멸 균 5X 배양 배지의 1.52 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 거품을 피하십시오. 사용하기 직전에 72마이크로리터의 냉멸 살균 원 어금니 나트륨 수산화나트륨을 부드럽게 추가하고 얼음에 용액을 보관하십시오.
피펫팅과 거품을 피하여 부드럽게 섞습니다. 효율적인 혼합은 중간 크기의 빨간색에서 주황색-빨간색으로 색상 변화를 유도합니다. 사용이 될 때까지 혼합물을 얼음위에 둡니다.
다음으로, 첫날에 준비된 96웰 플레이트에서 190마이크로리터의 초판을 제거하려면, 파이펫을 웰의 측면을 향해 비스듬히 사용한다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록주의하십시오. 콜라겐 믹스 100마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 추가하여 우물의 측면을 피펫으로 바릅니다.
거품과 스페로이드 방해를 피하십시오. 20 밀리리터 튜브에 남은 콜라겐 믹스를 실온에서 유지하여 중합을 평가합니다. 콜라겐이 중합할 수 있도록 적어도 10분 동안 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
남은 콜라겐이 반고체및 스폰지같이 되면 스페로이드는 억제제로 치료할 준비가 되어 있습니다. 배양 배지의 5밀리리터에 2X 농도의 억제제를 추가합니다. 스페펫 100 마이크로리터의 배지는 스페로이드 교란을 피하기 위해 각 우물의 측면을 부드럽게 아래로 내려.
관찰 및 약물 활동을 평가하기 위해 0 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간의 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 이미지. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 이제 접시를 조직 배양 후드에 놓고 상판을 1X PBS의 100 마이크로리터로 부드럽게 교체하십시오.
스페로이드를 방해하지 말고 콜라겐을 만지지 않도록 주의하십시오. 이 워시 단계를 3번 더 반복하십시오. 각 우물의 최종 세척을 제거하고 1X PBS에서 4 %의 포름 알데히드의 100 마이크로 리터로 대체하십시오.
96웰 플레이트를 실험실 벤치에 놓고 호일로 덮고 실온에서 24시간 동안 둡니다. 다음 날, 포름알데히드를 조심스럽게 제거하고 1X PBS로 교체하십시오. 이 세척을 세 번 더 반복합니다.
그런 다음 1X PBS 워시를 갓 준비한 Triton X-100 용액 100 마이크로리터로 교체하십시오. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 한편, 블로킹 용액은 1X PBS 50 밀리리터와 05%의 탈지 된 분유로 50 밀리리터 튜브에 준비하여 철저히 섞습니다.
30분 후 트리톤 X-100을 제거하고 1X PBS로 세 번 세척합니다. 블로킹 솔루션 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 차단 완충제에서 항 마우스 IgG 아세틸화 튜룰린 항체를 희석한다.
원심분리기 1차 항체 차단 버퍼 믹스는 15, 682g에서 5분 동안 혼합한다. 각 웰의 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 튜브에서 완충제 슈퍼상극을 차단하는 항체 차단의 25~50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
이어서, 항체 용액을 각 웰에서 제거하고 1X PBS의 100 마이크로리터로 세 번 세척한다. 추가형 얼룩 이외에 권장 농도에서 차단 버퍼에 이차 항체를 희석시. 다시, 원심 분리는 15, 682 g에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리합니다.
각 우물에서 차단 용액을 제거하고 이차 항체 상체의 25 ~50 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 1 1/2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체 염료 용액을 제거하고 1X PBS, 100 마이크로리터로 세 번 세척하십시오.
개별 콜라겐 플러그를 플라스틱 200 마이크로리터 파이펫으로 흡입하여 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어올립니다. 콜라겐 플러그를 덮기 위해 적합한 마운트젠 1방울을 추가합니다. 샘플 위에 커버슬립을 배치하고 어두운 실온에서 슬라이드를 보관합니다.
3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호 작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 이 연구에서는 잠재적인 항철기 또는 프로 철새 효과가 발견되었습니다. 이것은 제어 또는 처리된 스페로이드에 있는 겉보기 마이그레이션이 없는 KNS42에서 특히 두드러지습니다.
세포사멸은 10마이크로몰러의 가장 높은 억제제 농도에서 관찰되었다. U251 세포에서 핵 분열과 이동 세포가 분명하게 드러났습니다. U251 세포 스페로이드는 원래 스페로이드에서 멀리 방출 스파이크를했다, 증가 억제제 농도와 명백한 세포반올림 증가와.
KNS42에서 붕괴된 소소와 핵 분열이 관찰되었다. 단일 셀 스파이크가 있는 시트 모양의 돌출은 KNS42 마이그레이션을 나타냅니다. 가장 낮은 억제제 농도에서, 이 표현형은 발음되었지만 억제제 농도가 증가함에 따라 손실되었다.
준비될 때까지 모든 시약을 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 콜라겐은 모두 스페로이드에 추가되기 전에 중합을 시작합니다. 예를 들어, 세포 형태에 대한 미정 약물의 효과를 평가하기 위해 공초점 현미경 검사법에 의해 생성된 이미지를 정량화하는 범위가 있다.
그것은 우리가, 처음으로, 미세 투하 염 분화 수준에 migrastatic 억제제 MI-192의 효력을 확인하고 세포 이동의 관점에서 이것을 더 탐구하는 것을 허용했습니다. 고정 단계를 위해 포름알데히드를 다룰 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다. 일반적인 건강 및 안전 지침이 적용됩니다.
