마우스 오르가노이드 배양은 전통적인 세포 배양보다는 생체 내 세포 조직에서 더 가깝게 유사합니다. 암 연구에서, 오르가노이드는 2D 세포주 보다 더 나은 원래 종양을 모델링하고 새로운 약 처리를 개발하기 위하여 시험관 내에서 잠재적인 암 치료를 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 남성 마우스 비뇨 생식기 시스템의 en 블록 추출을 위해 방광의 양쪽에 지방 패드를 잡고 고환을 노출하기 위해 위쪽으로 당겨.
각 고환을 비뇨 생식기 부위의 나머지 부분에서 조심스럽게 해부합니다. 비뇨 생식기 영역이 함께 상승되도록 방광을 부드럽게 들어 올려 그 아래에 요도가 노출됩니다. 방광을 들고 있는 동안, 요도를 절개하기 위해 등쪽 전립선의 밑면에 가위를 지향합니다.
전체 비뇨 생식기 지역은 복강에서 방출될 것입니다. 비뇨 생식기 시스템을 제거 한 후, 골반 림프절은 비뇨 생식기 시스템 바로 뒤에 위치하고 척추의 양쪽에 노출됩니다. 림프절을 제거하려면 림프 조직 하에서 직선 집게를 직구하고 당깁니다.
다음으로, 직선 집게로 직장을 잡고 절단하고, 창자 전체를 풀고 장 전체를 해명하여 장막림프절의 전이성 병변을 찾습니다. 전체 일리움이 제거되면 위장을 노출십인에 계속 당깁니다. 식도를 잘라 배를 완전히 제거합니다.
림프절에 있는 어떤 전이성 병변이 관찰되는 경우에, PBS에 있는 저장을 위해 창자에서 멀리 이 노드를 주의 깊게 해부합니다. 위장이 제거되면 비장을 복부의 등쪽에서 수확하여 4%의 파라포름알데히드에 보관할 수 있습니다. PBS에서 보관을 위해 간을 제거하십시오.
전이성 병변을 포함하는 신장 림프절과 더불어 척추의 양쪽에서 신장을 제거합니다. 흉부 구멍을 노출하려면 조심스럽게 흉곽을 따라 다이어프램을 잘라. 흉부 구멍 내에서 방출되는 부정적인 압력은 심장과 폐를 드러내게 됩니다.
흉골을 위로 당겨 흉부 구멍을 더 엽니다. 흉부 림프절에서 전이성 병변을 위해 흉곽 구멍의 복부 면을 스캔하여 해부에 대해 말하십시오. 흉골을 들고 있는 동안 복부 흉곽을 잘라서 심장과 폐에 접근하고 심장을 위로 당겨 폐 밑을 자른다.
완전히 심장과 폐를 제거하기 위해 en bloc는 기관내 전방 혈관을 모두 절단합니다. 폐 조직이나 폐 전이성 병변을 PBS 의 용기에 손상시키지 않고 심장을 조심스럽게 전달합니다. 전립선 종양의 해부에 대 한 해부 현미경 의 밑에 비뇨 생식기 영역을 배치합니다.
직선 집게 한 쌍과 곡선 된 집게 한 쌍을 사용하여 비뇨 생식기 영역을 등색 표면으로 뒤집습니다. 요도의 분홍색-붉은 색으로 식별할 수 있는 근접 전립선 영역을 찾습니다. 구부러져 있는 집게로 비뇨생식기 조직을 조작할 수 있도록 요도를 단단히 잡습니다.
정액 소포의 베이스를 찾아 조심스럽게 제거할 수 있도록 합니다. 그런 다음 집게의 곡선면을 사용하여 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하십시오. 요도와 근위 전립선 부위를 단단히 잡고 있지만, 요도에서 방광을 제거하기 위해 미세 뾰족한 가위를 사용합니다.
근위 전립선 영역과 요도를 단단히 잡고 직선 집게로 앞쪽 전립선 부위를 잡아당기의 곡선면을 가진 전방 전립선 부위를 단단히 잡아 당광과 전립선의 나머지 부분에서 조직을 단단히 끌어당깁니다. PBS에 전방 전립선 조직을 놓고 복부 전립선 부위를 찾습니다. 같은 방식으로 복부 전립선 영역을 제거합니다.
측면 영역이 등쪽 영역으로부터 구별될 수 있는 경우 양쪽의 측면 전립선 부위를 제거한다. 그런 다음 등쪽 전립선 부위를 제거하고 근위 전립선 부위를 4%의 파라포름알데히드에 배치합니다. 다진 후 종양 조각을 15 밀리리터 의 소화 완충관에 넣고 섭씨 37도에서 1-2 시간 소화합니다.
소화의 끝에서, 퇴적물 원심 분리에 의해 소화 된 조직을 폐기하고 상체를 폐기. 튜브를 플릭하여 셀 펠릿을 풀어놓습니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 10 마이크로몰라 Y-27632 ROCK 억제제로 보충된 미리 따뜻워진 트립신의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
인큐베이션의 끝에서 표준 P1000 파이펫 팁으로 조직 슬러리를 다섯 번 세리라세레이트합니다. 튜브를 수조에 반납하여 5분 간 인큐베이션과 트리튜레이션을 추가로 준비합니다. 매트릭스 돔 도금은 차가운 매체의 9 밀리리터에서 소화 된 세포를 세척 한 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
계산을 위한 신선한 매체의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그리고 계산 한 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집. 매트릭스의 적절한 부피에서 종양 세포를 희석.
매트릭스 셀 용액 200마이크로리터를 55도의 각 웰에 조심스럽게 떨어뜨리면 6웰 플레이트를 데워집니다. 돔이 실온에서 2분 동안 고화된 후 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터에 20분간 거꾸로 놓습니다. 돔이 완전히 고화되면 각각의 웰에 안드로겐 R1881 및 ROCK 억제제로 보충된 전립선 오르가노이드 배지의 2밀리리터를 첨가합니다.
플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 형광 해부 이미지는 종양 세포가 Cre를 발현한다는 것을 나타내는 고형 전립선 종양에 의한 녹색 형광 단백질 또는 GFP 발현을 드러낸다. 같은 동물에서 간 및 폐는 이 종양이 1 차적인 전립선 종양에서 유래했다는 것을 보여주는 GFP를 표현하는 전이성 종양을 전시합니다.
이 마우스에서 골반 림프절은 GFP를 표현하고 토마토가 아닌, 이 전이성 종양이 림프절을 추월하고 정상적인 조직이 남아 있지 않다는 것을 나타냅니다. 첫날에는 고형 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드가 종양 오르가노이드 배양에 존재하는 토마토와 GFP 발현 세포로 형성되기 시작합니다. 그러나 전립선 종양 오르가노이드가 완전히 형성되었을 때 7 일 이상까지, 오르가노이드는 GFP를 표현하지만 토마토는 아니지만, 오르가노이드가 일반적인 상피 세포가 아닌 Cre-expressing 종양 세포에서 유래했다는 것을 시사합니다.
첫날에는 토마토와 GFP 발현 세포가 모두 유체로 채워진 전립선 종양에서 생성된 작은 오르가노이드 배양의 배양이 오르가노이드 배양 내에 존재한다. 그러나 유체가 채워진 전립선 종양의 오르가노이드는 GFP 또는 토마토를 7일 이상 표현하며, 이는 Cre를 발현하지 않는 세포에서 형성된 오르가노이드를 나타낸다. 전립선 조직을 수확 할 때 지향 상태를 유지하려면 항상 방광과 요도 위치를 알고 있어야합니다.
그들의 생성 후에 오르가노이드는 화상 진찰 응용 프로그램, 분자 생물학 분석 및 약 스크린에서 이용될 수 있습니다.
