이 프로토콜은 장내 병원체에 의한 상피 침입을 모델링하기 위한 줄기 세포 유래 장 장기형 시스템의 유용성을 입증하고, 사이토카인을 이용한 이 과정의 수정을 보여준다. 마이크로 주사는 관심있는 병원체가 유기체의 루멘탈 캐비티로 직접 전달 될 수 있게하여 생체 내에서 감염 과정을 보다 면밀히 복제합니다. 이 방법은 다른 장 내 병원체 또는 관심의 대체 사이토카인의 연구에 적용 될 수있다.
나는 병원체를 사용하기 전에 마이크로 주입 기술을 마스터하기 위해만 페놀 빨간색으로 절차의 시험 실행을 완료하는 것이 좋습니다. 둘째 날, 성장 인자로 보충된 줄기세포 배양 배지의 10밀리리터로 미디어를 변경하여 분화를 시작한다. 6일째에는 6개의 마이크로몰러 CHIR99021과 3개의 마이크로몰러 망막산으로 보충된 RPMI-B27 미디어의 10밀리리터로 미디어를 변경하여 후방 내막을 힌구트로 패킹하기 시작합니다.
차분일째 10일에, 지하 막 매트릭스에 힌구트를 포함. 먼저, 힌드구트 플레이트에서 미디어를 제거하고, 칼슘 마그네슘이 없는 DPPS로 접시를 한 번 씻는다. 접시에 콜라게나아제 용액 5밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다.
다음으로, 접시에 오르가노이드 베이스 성장 매체의 5밀리리터를 첨가하여 콜라게나아제를 비활성화한다. 힌드구트 셀은이 시점에서 부동해야합니다. 15 밀리리터 원내 튜브에서 힌드구트 서스펜션을 수집합니다.
그런 다음 원심 분리기는 240 회 G에서 1 분 동안. 원심 분리 후, 상체에서 파이펫, 오가노이드 기본 성장 매체의 10 밀리리터를 추가하고, 부드럽게 파이펫을 통해 힌구트를 작은 조각으로 분해하고, 원심분리기를 95회 G에서 1분 동안 다시 분리합니다. 오가노이드 베이스 성장 매체에서 세포를 두 번 세척합니다.
기저 성장 배지의 300~500마이크로리터로 세포를 재일시 중단하고, 지하 멤브레인 매트릭스의 1.5 밀리리터에 이 용액의 약 100마이크로리터를 첨가한다. 섭씨 37도의 플레이트 히터에 24웰 플레이트를 설치합니다. hindgut 세포 매트릭스 혼합물의 60 마이크로리터를 24웰 플레이트의 한 우물로 내다볼 수 있습니다.
잠시 설정하고 현미경으로 밀도를 확인합니다. 나머지 매트릭스를 24웰 플레이트에 발견한 후 10분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에 성장 인자를 포함하는 기본 성장 매체의 800 마이크로리터를 추가합니다.
organoids를 통과하려면 먼저 미디어에서 미디어를 제거하고 셀 리프팅 용액의 웰당 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 40~50분간 섭씨 4도에서 배양하면 오르가노이드가 용액에 떠 있어야 합니다. 유기체와 세포 리프팅 용액을 15밀리리터 원내 튜브로 부드럽게 피펫하여 오르가노이드를 분해하지 않으려고 노력합니다.
오르가노이드가 3~5분 동안 정착하도록 허용한 후, 상수와 단일 세포를 제거합니다. 기본 성장 매체의 5 밀리리터로 오르가노이드를 다시 중단하고 부드럽게 파이펫하여 세척합니다. 95회 G의 원심분리기는 2분간.
다음으로, 후드 내의 섭씨 37도에 플레이트 히터에 24웰 플레이트를 설치하고 오르가노이드 펠릿에서 상퍼를 제거합니다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 기본 성장 매체의 300~500마이크로리터에서 오르가노이드를 재연하여 오르가노이드를 더 작은 덩어리로 분해합니다. 약 100 마이크로리터의 오가노이드를 지하 멤브레인 매트릭스와 파이펫의 1.5 밀리리터에 넣고 섞어 놓습니다.
지하 멤브레인 매트릭스의 60 마이크로리터를 24웰 플레이트 중 하나의 우물로 내다볼 수 있습니다. 30초 동안 고형화하기 위해 방치한 후 현미경 아래밀도를 확인하십시오. 나머지 매트릭스를 24웰 플레이트로 발견한 후 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이터에 넣은 다음 원고에 따른 성장 인자와 함께 기본 성장 매체의 800 마이크로리터로 오버레이합니다.
재조합 인간 IL-22 사전 자극을 가진 마이크로 주사 암시의 경우, 주사 18시간 전에 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도에 재조합 인간 IL-22를 배양 매체에 첨가한다. 유기체를 함유 한 마이크로 주입 접시를 현미경 단계에 로드하고 뚜껑을 제거하고 오르가노이드를 초점으로 가져와 주입을 시작할 준비를하십시오. 인젝터와 암 제어 스테이션을 켭니다.
인젝터가 600킬로파스칼의 압력과 0.5초의 주입 시간으로 설정되어 있는지 확인합니다. 현미경 단계에서 아직 백업되지 않은 경우 사출 암을 회전하여 있는지 확인하고 그립 헤드를 제거하십시오. 드릴 팁을 10마이크로리터의 접종으로 적재하여 드릴 팁을 무딘 끝에서 부드럽게 잡습니다.
드릴 팁을 그립 헤드에 넣고 마이크로 사출 암에 다시 부착합니다. 바늘이 마이크로 주입 접시 위에 1~2센티미터 떨어진 위치로 팔을 부드럽게 움직입니다. 팔 컨트롤을 사용하여 바늘 끝을 접시 중앙에 배치하고 미디어 표면 바로 위에 놓일 때까지 낮춥습니다.
모든 주사 후이 시점에 바늘을 반환 하는 팔 제어 스테이션을 프로그램. 오가노이드에 현미경을 집중하고 주입할 대상을 선택합니다. 바늘을 바로 위와 오르가노이드의 오른쪽을 주입하고 바늘을 오르가노이드 루멘으로 아래쪽으로 그리고 측면으로 이동시합니다.
마이크로 인젝터의 주입 버튼을 눌러 페놀 염색 된 박테리아 혼합물이 바늘에서 나올 수 있도록합니다. 그리고 각 오르가노이드를 세 번 주입하십시오. 필요한 모든 오르가노이드를 주입하면 단계에서 마이크로 사출 플레이트를 제거하고 뚜껑을 교체하고 90 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오.
인큐베이션 후 성장 매체를 흡인하고 셀 리프팅 용액의 3 밀리리터로 대체하십시오. 그런 다음 섭씨 45분 동안 배양합니다. 다음으로, 유기체와 세포 리프팅 용액을 DPBS 의 5밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원내 튜브로 부드럽게 이동합니다.
370회-G에서 3분간 원심분리기. 상체를 제거하고 밀리리터 젠타미신 당 0.1 밀리그램을 함유한 기본 성장 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 다음으로, P1000을 사용하면 오가노이드를 분해하기 위해 피펫을 약 50배 위아래로 분해합니다.
4 밀리리터를 더 많은 미디어를 추가하고 세포 외 박테리아를 죽이기 위해 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 3분 동안 370회-G에서 오르가노이드원심분리합니다. 가능한 한 적게 떠나, 슈퍼 티퍼를 흡인.
DPBS로 오르가노이드를 한 번 씻고 원심분리기를 다시 씻으십시오. 리시스 버퍼의 500 마이크로리터를 추가하고 피펫을 약 50회 위아래로 추가하여 인간 장 내장을 수동으로 해리시합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 후, DPBS에서 생성된 용액을 10배 연속적으로 희석시 합니다.
파이펫 3 개의 20 미크론 방울의 깔끔하고 희석 된 용액을 미리 데운 LB 한천 플레이트에 놓습니다. 마지막으로, 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하고 식민지 계수를 진행합니다. 인간 장 가구는 페놀 적색 세균용 용액을 마이크로 주입했다.
오르가노이드에 의한 이 붉은 색을 유지하면 중복 주사를 방지할 수 있습니다. 재조합 인간 IL-22를 가진 COF-2 세포주에서 유래된 인간 장 기관가노이드의 사전 처리는 장 상피 세포로 S.typhimurium SL1344의 침입을 제한합니다. 감염된 오르가노이드는 숙주 IEC 세균성 상호작용의 시각화를 용이하게 하기 위해 면역 염색, 또는 전염 전자 현미경 검사를 위해 처리되었다.
RNA는 감염에 대한 전사 반응을 보기 위해 주입된 오르가노이드로부터 추출될 수 있다. 형광 및 전자 현미경 검사는 또한 더 자세하게 숙주 병원체 상호 작용을 관찰하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 일관된 결과를 위해 신속하고 효율적으로 주사를 완료할 수 있도록 마이크로 인젝터에 충분한 연습을 했는지 확인하는 것입니다.
마이크로 분사 드릴 팁은 미세하고 날카로운 점을 가지며 마이크로 인젝터에서 적재하고 하역 할 때주의해야합니다. 이 기술은 상피 세포 병원체 상호 작용이 이전에 얻을 수없는 세부 사항에서 연구 될 수 있습니다. 이 감염 모형은 인간 특정 병원체를 공부하는 사람들에게 특히 이용될 것입니다.
