이 프로토콜은 뇌의 다양한 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법과 특히 신경 회로를 자극하거나 억제하는 것이 성인 신경 줄기 세포의 증식에 미치는 영향에 대해 대답 할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 원하는 신경 회로를 구체적으로 표적으로 삼을 수 있을 뿐만 아니라 동물에게 유입되는 응력의 양을 줄일 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 뇌 회로가 성인 신경 발생을 조절하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 특히, 특정 신경 전달 물질을 해제 하는 특정 세포 유형 성인 신경 줄기 세포 증식을 조절 하는 방법.
이 절차를 시작하려면, PBS에 조직 섹션을 배치하고 전방에서 후방에 직렬 순서로 양전하 슬라이드에 5 ~ 8 개의 섹션을 마운트. 티슈 섹션이 실온에서 2~5분 동안 건조하고 슬라이드를 완전히 부착하십시오. 그런 다음 컨테이너에서 타일산 버퍼를 준비합니다.
용액이 끓을 때까지 5 분간 전자 레인지에 구연산 버퍼를 가열합니다. 한편, 장착 된 섹션을 유리 슬라이드 홀더에 놓습니다. 5분 후, 슬라이드 홀더에 섹션이 있는 파이펫 상자에 조심스럽게 넣습니다.
전자 레인지 전원을 50 %로 설정하고 요리 시간을 7 분으로 설정합니다. 타이머를 7분 동안 시작하고 솔루션을 모니터링합니다. 용액이 끓기 시작하면 전자 레인지를 멈추고 끓인 후에도 전자 레인지를 계속하십시오.
전자레인지의 조리 시간이 끝나지 않아도 타이머가 다 떨어지면 멈춥시다. 이 단계의 목표는 물을 지나치게 끓이지 않고 물을 끓는 온도 바로 아래에 유지하는 것입니다. 너무 많은 끓는 슬라이드에서 조직 섹션을 제거합니다.
그런 다음, 식염수 버퍼와 티슈 슬라이드와 함께 따뜻한 상자를 얼음 양동이로 옮겨 냉각시냉각시다. 상자를 덮고 약 30 분 동안 또는 용액이 터치에 식힐 때까지 기다렸다가 티미딘 아날로그 염색을 진행하십시오. 티미딘 아날로그로 조직 섹션을 염색하려면 구연산 완충에서 조직 섹션을 제거하십시오.
소수성 펜으로 테두리를 그리기 전에 조직 섹션이 건조하고 슬라이드를 완전히 부착하십시오. 다음으로, 20~30분 동안 투과화 버퍼로 섹션을 충마화합니다. TBS 트리톤을 사용하여 매번 5분간 섹션을 두 번 세척합니다.
그런 다음 Edu 반응 솔루션을 준비합니다. 에듀 반응 용액의 섹션을 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, TBS 트리톤에서 매번 5분간 세 번 씻는다.
슬라이드를 알루미늄 호일로 덮거나 빛으로 보호되는 챔버에 배치하여 이 단계 후 빛으로부터 보호합니다. 이 단계에서, 에듀 반응이 형광 현미경을 사용하여 작동하는지 확인하십시오. 에듀 표지된 세포는 반응이 작동하는지 관찰해야 한다.
지금, 30 분 에서 시간 동안 이차 항체와 같은 동물에서 제기 된 차단 버퍼를 사용하여 장착 된 조직 섹션을 차단합니다. 그런 다음 TBS 트리톤에서 매번 5분 동안 두 번 씻습니다. 차단 단계 동안, 1차 항체를 차단 완충제에서 혼합하여 1차 항체 용액을 준비한다.
그 후, 조직 섹션이 완전히 침수되도록 슬라이드 당 250 마이크로 리터의 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, TBS 트리톤에서 조직 섹션을 3회 세척하여 각각 5분간 세척하여 과도한 1차 항체를 제거합니다. 이어서, 실온에서 2시간 동안 완충액을 차단하는 데 제조된 플루오로포레-컨쥬게이드 이차 항체의 조직 섹션을 배양한다.
TBS 트리톤에서 조직 섹션을 3회 세척하여 각각 5분간 세척하여 과도한 이차 항체를 제거합니다. 다음으로 실온에서 15분 동안 PBS에 300 마이크로몰러 DAPI 솔루션을 1~100개에 적용합니다. 그 후, PBS에서 조직 섹션을 3회 세척하여 각각 5분간 세척하여 과도한 DAPI를 제거하고 면봉을 사용하여 조직 주위의 PAP 펜 원을 제거합니다.
마운팅 미디어를 적용하고 커버립으로 덮기 전에 섹션을 건조하게 하십시오. 이미징 소프트웨어를 사용하여 각 dentate gyrus 섹션의 이미지를 서로 다른 색상으로 병합된 채널과 복합 이미지로 열어 공동화를 쉽게 시각화합니다. 그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 각 섹션에서 축축자 류의 영역을 측정하고 각 마우스의 모든 섹션을 기록합니다.
이것은 밀도를 계산하는 데 사용되는 덴테이트 자이러스의 영역이 될 것입니다. 플러그인에서 발견 되는 소프트웨어 플러그인 셀 카운터를 사용 하 여, 분석, 셀 카운터, 셀 카운터, 합성 이미지에서 기본 항체와 티미딘 아날로그 에듀를 colocalizing 하는 dentate gyrus에 세포의 수를 기록. 또한 방사형 공정을 통해 에듀 양성 및 네신 양성 세포의 총 수를 기록합니다.
네신의 경우 세포의 형태에주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다. 신경 줄기 세포를 정량화하는 경우 방사형 공정을 가진 세포만 정량화되었는지 확인하십시오. 스프레드시트 소프트웨어에 셀 수를 입력하여 나중에 분석을 위한 모든 데이터를 컴파일합니다.
예를 들어, 줄기 세포 밀도를 얻으려면, 각 동물의 축축자 부피의 합으로 네신 양성 및 에듀 양성 세포의 합을 나눕니다. 각 단계가 하나의 마이크로미터라고 가정하면 각 섹션의 부피를 총 Z 단계 증분으로 영역을 곱하여 계산합니다. 이 프로토콜에서, 조직40 마이크로미터에서 단면되기 때문에 총 단계는 40에 가까워야 합니다.
그 후, 확산 세포의 전체 수를 계산, 증식 신경 줄기 세포의 퍼센트, 및 반대 이끼 세포를 자극 한 후 총 증식 세포. 네신염색을 위한 티미딘 아날로그 에듀 및 항원 회수를 이용하여, 증식신경줄기세포가 성공적으로 표지되었다. 또한 항원 검색 단계를 생략하여 Tbr2 양성 신경 전구및 신경 아세포 및 DCX 양성 신경 아세포 및 미성숙 뉴런이 표지되었습니다.
다음은 세포 밀도를 정량화하고 계산하는 데 사용되는 영역의 예이며, 여기에 슬라이드상에 장착된 조직의 예이다. 성공적인 및 하위 파 실험 모두 비교를 위해 표시됩니다. 마지막으로, 성공적인 실험으로부터 얻을 수 있는 몇 가지 다른 정량화가 있다.
정량화는 증식 신경 줄기 세포의 밀도, 증식 신경 줄기 세포의 백분율, 총 증식 세포 및 총 줄기 세포 풀을 포함한다. 이끼 세포의 모순 자극에 따라 신경 줄기 세포 증식의 감소가 관찰되었습니다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 전자 레인지에서 끓는 조직을 제어하는 것입니다.
그들은 너무 오래 끓는 경우 조직 섹션이 손상됩니다. 이 절차를 따라, 하나는 동일한 회로를 대상으로 다른 바이러스 벡터를 주입 할 수 있습니다. 예를 들어, 신경 회로를 자극 하는 경우, 하나는 억제 DREADD 바이러스를 사용 하 여 그것을 억제 수 있습니다.
이 프로토콜에 제시된 기술은 참신하지 않습니다. 그러나, 이 프로토콜의 강도는 회로가 성인 신경 발생에 미치는 영향에 대한 질문에 대답하는 데 필요한 모든 단계를 포괄적으로 다루고 있다는 것입니다.
