이 샘플 준비 기술은 중점 이온 빔 스캐닝 전자 현미경에서 이미징 양식에 가장 적합한 대비와 초구조 보존의 최고 품질을 결합하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있는 초구조 보존을 위해 고압 동결에 의한 준비를 필요로 하지만 볼륨 이미징을 위한 동결 대체 중에 충분한 대조를 얻지 못하는 시료에 특히 유용합니다. 최소한의 수지 포함을 위해서는 가능한 한 많은 수지를 제거하여 나중에 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경에서 적절한 표적을 허용하는 것이 필수적입니다.
먼저 파이펫을 사용하여 절단 매트에 20% PVP PBS 한 방울을 떨어 뜨립니다. 물방울에 해부 된 nervus 티비아를 담급하십시오. 메스를 사용하여 샘플의 2 밀리미터 길이를 절단합니다.
미세 한 집게를 사용하여 샘플을 0.2 밀리미터 깊이 유형 A 금속 샘플 캐리어에 배치하십시오. 캐리어를 카트리지의 중간 플레이트로 옮킨다. 육사데카네 코팅형 B형 캐리어를 뚜껑으로 위에 놓습니다.
카트리지의 상반부를 낮춤으로써 어셈블리를 닫습니다. 고압 냉동고의 로딩 스테이션에 있는 3피스 카트리지를 닫습니다. 프로세스 버튼을 누르고 제조업체의 운영 지침에 따라 진행합니다.
액체 질소의 목욕에서, 냉동 0.1%탄닌산과 아세톤의 2 밀리리터를 포함하는 저온 바이알에 샘플 캐리어를 배치하고 캡을 닫습니다. 냉동 고비알을 영하 90도로 설정된 동결 대체 장치에 넣습니다. 프로그램을 시작하고 100 시간 동안 샘플을 유지합니다.
동결 대체 장치에서 는 30 분 동안 아세톤의 2 밀리리터로 샘플을 세 번 씻으십하십시오. 2%의 오스뮴 테트옥사이드를 0.1%의 우라일 아세테이트를 동결 대체 장치에 넣고 냉각을 위해 7시간 동안 시료에 첨가하여 영하 90도에서 계속 염색합니다. 동결 치환장치의 프로그램 온도가 섭씨 영하 20도에 도달하면 샘플을 16시간 동안 보관하십시오.
온도가 섭씨 4도까지 올라가면 바이알의 액체를 버리고 순수한 아세톤을 채웁니다. 동결 대체 장치에서 냉동 유리병을 제거합니다. 시료가 심하게 손상될 수 있기 때문에 동결 전 과 후 의약 처리가 중요합니다.
연기 후드에서 미세 한 집게를 사용하여 냉동고 바이알에서 금속 캐리어를 제거하고 캐리어에서 샘플을 전송하여 아세톤으로 채워진 150mm 깊이의 시계 유리 접시에 잠급됩니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 아세톤으로 채워진 두 밀리 리터 반응 튜브로 샘플을 전송 합니다. 전자레인지를 250와트로 40초 동안 설정하고 전자레인지를 시작하여 샘플을 세척하고 4회 반복합니다.
파이펫 1 밀리리터 1%의 티오카르보히드라지드 용액을 반응 튜브에 넣고 전자레인지에 넣습니다. 진공 기능을 2분 이상 켜고 2분 쉬면 총 14분 동안 반복하여 150와트로 설정합니다. 전자 레인지를 시작합니다.
이전과 같이 아세톤에서 샘플을 4번 세척합니다. 파이펫 1 밀리리터 의 2% 오스뮴 테트란화물 용액반응 튜브에. 샘플을 전자레인지에 넣고 티오카르보히드라지드와 동일한 전자레인지 설정을 사용합니다.
이전과 같이 아세톤에서 샘플을 4번 세척합니다. 파이펫 1 밀리리터의 25% 수지 아세톤에 반응 튜브에 넣고 전자레인지에 넣습니다. 진공 기능을 3분 동안 켜고 250와트로 설정합니다.
전자 레인지를 시작합니다. 이쑤시개를 사용하여 반응 튜브에서 nervus 티비리얼리스를 제거하고 플라스틱 필름 조각에 놓습니다. 할로겐 램프를 시료 에 가까이 두어 수지를 가열합니다.
이쑤시개를 사용하여 남은 수지가 감지되지 않을 때까지 플라스틱 필름의 샘플을 부드럽게 밀어 넣습니다. 플라스틱 필름을 위에 놓고 온도를 섭씨 60도로 설정하여 샘플을 최소 48시간 동안 중합합니다. 면도날을 사용하여 중합화된 시료와 SEM 스텁에 맞는 크기로 플라스틱 필름을 잘라냅니다.
이쑤시개를 사용하여 SEM 스텁에 전도성 실버 수지와 절단 샘플을 부착합니다. 그런 다음 샘플 주위에 수지를 추가합니다. 오븐에 SEM 스텁을 넣어 적어도 4 시간 또는 하룻밤 동안 섭씨 60도에서 중합하십시오.
중합 후, 스퍼터 코터에 SEM 스텁을 배치합니다. 스퍼터 코터를 35밀리암퍼로 설정하고 10나노미터 두께의 골드 코팅이나 코트를 1분 동안 바치십시오. 코팅 후, 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 내부에 SEM 스텁을 배치합니다.
이 연구에서는, 마우스의 nervus tibialis뿐만 아니라 C.elegans에 대한 향상된 프로토콜이 수행되어 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경으로 3D 부피 이미징을 수행하는 최적의 보존 및 대비를 보여 주도록 수행되었습니다. 표준 프로토콜은 종종 향상된 프로토콜이 강력한 멤브레인 대비를 제공하는 멤브레인 대비의 부족으로 고통받습니다. 향상된 프로토콜과 표준 프로토콜을 갖춘 C.elegans의 단면 이미지는 뚜렷한 차이를 보여줍니다.
nervus tibialis의 단면 이미지뿐만 아니라, 향상된 프로토콜은 표준 프로토콜에 비해 더 강한 멤브레인 콘트라스트를 표시하는 데 도움이됩니다. 후처리 후, 전자 현미경 데이터는 IMOD, 이미지 처리 및 모델링 프로그램을 사용하여 시각화됩니다. 파란색 강조 표시된 영역은 분할된 축축을 표시합니다.
빨간색 으로 강조 표시된 영역에는 Remak 번들이 표시됩니다. 노란색과 주황색으로 강조 표시된 영역은 myelin 칼집을 보여줍니다. 그리고 청록색 으로 강조 된 지역은 미토콘드리아를 보여줍니다.
가상 리살리싱 및 3차원 모델은 미세 조직 아키텍처를 보여 주며 그 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 다른 부피 주사 전자 현미경 검사 방법은 직렬 블록 - 얼굴 스캔 전자 현미경 검사 및 배열 단층 촬영과 같은 뿐만 아니라 사용될 수있다. 이 프로토콜은 또한 중추 신경계에서 견본과 같은 전송 전자 현미경 검사법 및 그밖 견본 모형을 위해 이용될 수 있습니다.
오스뮴 테트록사이드, 티오카르보하이드로지드, 우란 아세테이트는 독성 화학물질이며 신중하게 사용해야 합니다. 수지는 또한 유해하며 주의와 함께 사용해야합니다. 장갑및 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비는 전체 프로토콜을 위해 착용해야합니다.
