이 방법은 그대로 애기장잎에 면역과 같은 동적 생물학적 사건 동안 관심 있는 유전자의 현면적 조절에 응답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 며칠 동안 그대로 재배된 식물 잎에서 발기인 활동의 현면역학을 포착할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 플라스틱 셀 플러그 트레이에 자동 채광 토양을 채웁니다.
각 세포에 1개의 형질전환 아라비도시스 씨앗을 뿌리는다. 트레이를 섭씨 23도유지의 성장실로 옮기고 2~3주 동안 연속백색광 조건에서 식물을 성장시면 된다. 병원균 접종 이틀 전에, 글리세롤 스톡에서 avrRpt2를 운반하는 병원균을 리터당 100 밀리그램, 가나마이신을 리터당 50밀리그램으로 함유한 NYG 배지로 줄입니다.
48시간 동안 섭씨 28도에서 배양하십시오. 플라스틱 팁을 사용하여 매체 표면에 나타나는 세균 세포를 수확하십시오. 박테리아를 10 밀리몰라 마그네슘 염화 마그네슘이 함유된 플라스틱 튜브로 옮기고 다시 중단합니다.
그런 다음 600 나노미터에서 용액의 광학 밀도를 측정합니다. 세균 세포의 최종 농도를 밀리리터당 1억 개의 콜로니 형성 단위로 조정하여 일반적으로 0.2의 OD600에 해당한다. 첫째, 2~3주 된 식물이 들어 있는 셀 플러그를 조심스럽게 잘라 식물을 손상시키지 않도록 하십시오.
빈 셀 플러그 트레이에 셀을 설정하여 균형을 유지합니다. 접종을 위해 눈에 띄게 건강한 잎을 선택합니다. 일반적으로, 식물의 바닥에서 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 잎은 처리하기 쉽습니다.
장기 경과 이미징을 위해 접종 전에 식물을 들고 있는 토양에 물을 주면 됩니다. 선택적으로, 스트레스 반응성 프로모터를 분석할 때 병원균 접종 전에 형광 스테레오현미경의 하뭇잎을 검사하여 YFP 신호의 부재를 확인한다. 다음으로, 침투 하는 동안 병원체와 직접 접촉을 피하기 위해 일회용 라텍스 장갑에 넣어.
1 밀리리터 바늘없는 플라스틱 주사기를 사용하여 잎의 축축측에 세균 현탁액에 조심스럽게 침투합니다. 리프의 절반에 작은 부분의 접종은 PR1 프로모터 활성의 좋은 시각화를 가능하게한다. 부드러운 종이 타월을 사용하여 침투 된 잎의 침투 영역을 둘러싼 영역에서 과도한 세균 현탁액을 흡수하십시오.
접종 직후 수술 용 테이프를 사용하여 유리 슬라이드를 플라스틱 트레이에 고정하여 침투 된 잎이 유리 슬라이드의 중앙에 위치하도록합니다. 접종된 잎 블레이드가 유리 슬라이드 내에 완전히 장착되어 있는지 확인합니다. 2층 플라스틱 테이프를 두 조각으로 자르고 침투한 잎의 잎을 따라 공간에 맞고 각 조각에서 모서리를 잘라냅니다.
고급 핀셋을 사용하여 각 조각의 컷 모서리가 잎 블레이드의 베이스와 정렬되도록 petiole의 양쪽에 테이프 조각을 붙이면 테이프 조각이 petiole 또는 잎 블레이드에 닿지 않도록하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜 의 두 그림에 설명된 대로 이중 레이어 플라스틱 테이프를 추가로 준비합니다. 이전에 부착된 조각 위에 이 테이프 조각을 붙이면 쁘띠 조각 사이에 페티올 이나 잎 블레이드를 직접 잡지 않도록 주의하십시오.
그런 다음 작은 수술 용 테이프를 잎 블레이드 끝 위의 유리 슬라이드에 부드럽게 붙이기 때문에 슬라이드에 매우 부드럽게 고정됩니다. 유리 슬라이드를 직접 만지는 테이프 의 부분에만 단단히 누릅니다. 다른 작은 수술용 테이프를 페티올과 플라스틱 테이프 조각의 테두리에 부드럽게 배치하여 페티올이 유리 슬라이드와 플라스틱 테이프 조각 모두에 매우 부드럽게 고정되어 유리 슬라이드 또는 플라스틱 테이프 조각을 직접 만지는 수술 용 테이프의 부분을 단단히 부착하십시오.
200 마이크로리터 파이펫 팁을 토양에 부드럽게 삽입하여 인접한 잎을 침투한 잎에서 부드럽게 잡아냅니다. 먼저 형광 스테레오 현미경을 켭니다. 이미징을 위한 스테레오현미경의 객관적인 렌즈 아래 공간에 식물을 설정합니다.
시간 경과 이미징에 대한 매개 변수를 설정합니다. 기존의 YFP 필터를 사용하여 YFP 신호를 시각화합니다. 텍사스 레드 필터를 사용하여 엽록소 자동 형광을 시각화하여 PCD 도메인이 YFP 양성 세포 층으로 둘러싸인 어두운 영역으로 볼 수 있습니다.
다음으로 기존의 에피 브라이트 필드 설정을 사용하여 추가 광 노출 단계를 수행하여 빛이 식물 면역에 큰 영향을 미치기 때문에 시간 경과 이미징의 간격 기간 동안 광 노출단계를 프로그래밍해야 합니다. 시간 경과 이미징 프로그램을 실행합니다. 며칠 동안 장기 관찰을 위해 식물에 적절하게 물을 주는 것이 좋습니다.
이미지 수집 후 데이터 집합의 간격으로 광 노출에 사용되는 추가 채널을 생략합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 분석과 같은 다양한 방법으로 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는, 유난한 시간 경과 화상 진찰을 위한 아라비도시스 잎의 장착을 위한 다목적 방법이 입증됩니다.
avrRpt2 유도 ETI를 이용한 타임랩스 이미지 데이터의 대표적인 예는 일련의 이미지와 타임랩스 영화로 얻어진다. avrRpt2 유도 ETI 동안 pPR1-YPF-NLS를 사용하는 성공적인 실험에서 PR1 프로모터의 일시적인 활성화가 관찰되며, 이는 YFP에서 부터 PCD 도메인을 둘러싼 여러 층의 세포와 분명하게 드러난다. PCD 도메인을 둘러싼 세포에서 PR1 프로모터의 활성화는 일반적으로 약 5 시간 후 접종에서 시작, 약에서 피크 12 접종 후 접종 시간 및 최대 지속 40 시간 접종 후 접종.
이 절차를 시도할 때는 텍스트에 설명된 대로 시간 경과 조건을 신중하게 설정해야 합니다. 이 절차에 따라 프로모터 활성은 분석 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 그리고 질적으로 분석할 수 있습니다. 이 분석은 우리가 근기 성 식물의 살아있는 잎에서 발생하는 생물학적 사건에서 유전자 발현의 현면역학을 탐구하는 데 도움이됩니다.
