이 방법은 유체 흐름이 곰팡이 생물막 의 성장 및 발달을 어떻게 변화시키는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 실시간으로 생물 막 의 성장과 개발에 대한 흐름의 효과를 정량적으로 평가 할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 흐름 장치의 어셈블리로 이 실험을 시작합니다.
실험 당일, 버블 트랩, 온도 프로브 및 모든 일회용 구성 요소를 부착합니다. 필터를 조립하려면 플런저를 1밀리리터 주사기에서 제거하여 어댑터로 만듭니다. 필터 병에서 튜브를 이 끝으로 강제로 넣고 2미크론 필터를 튜빙에 부착하여 성장 플라스크로 이어집니다.
이를 통해 시스템에 공기 누출을 방지하는 데 도움이 되기 때문에 슬라이드 어댑터의 바브 주위에 실리콘 진공 그리스를 적용합니다. 첨부 파일 플라스크를 YPD의 100 밀리리터로 채우고, YPD의 200 밀리리터로 성장 플라스크를 채웁니다. 녹색 측면 튜브가 각 플라스크의 미디어에 도달하도록 합니다.
모든 밸브가 열려 있는지 확인합니다. 버블 트랩을 진공에 부착하고 펌프를 버블 트랩의 하류에 있는 녹색 측면에 연결합니다. 유체를 분당 3.3 밀리리터의 유량으로 펌핑하여 녹색 측면을 완전히 채웁니다.
그런 다음, 분배하고 매체의 약 1 ~ 2 밀리리터를 폐기, 밀리리터의 처음 몇 종종 죽은 세포 또는 임의의 파편을 포함하기 때문에. 튜브의 녹색 면이 미디어로 채워지고 진행하기 전에 거품 트랩의 하류에 거품이 없는지 확인합니다. 거품을 소개하지 않도록주의, YPD와 채널 슬라이드와 저수지를 채웁니다.
슬라이드를 유량 장치에 연결합니다. 그런 다음 더 많은 유체를 펌핑하여 주황색 면에 약 5 미터의 버퍼를 만듭니다. 이는 역류 시 슬라이드에 실수로 공기를 포획하는 것을 방지하기 위한 것입니다.
이제, 먼저 버블 트랩의 입구와 출구를 심어 현미경으로 수송하기 위한 유동 장치를 닫은다. 그런 다음 녹색과 주황색 측 부착 플라스크 밸브를 닫습니다. 자동 도금 중에 느슨해질 수 있기 때문에 맥동 댐퍼 및 필터 병에 대한 나사 캡이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
튜브에서 펌프를 분리하여 운반을 더 쉽게 만듭니다. 그런 다음 핫 플레이트 교반기를 포함한 모든 구성 요소를 현미경 근처의 보조 용기로 이동합니다. 온도 프로브를 핫 플레이트 교반기에 부착하고 부착 플라스크를 섭씨 37도로 가열하기 시작합니다.
300 RPM에서 미디어를 저어 전체 실험에 대해 이를 유지합니다. 현미경에 슬라이드를 장착하고 필요한 경우 테이프를 사용하여 단단히 고정하십시오. 그런 다음 버블 트랩을 진공에 부착합니다.
이제 펌프를 유량 장치에 연결합니다. 분당 3.3 밀리리터의 유속도로 펌프를 시작하고 약 5~10초 동안 작동할 수 있습니다. 그런 다음, 렛 아웃 뚜껑 일족에 거품 트랩을 제거합니다.
부착 플라스크가 가열되는 동안 펌프가 계속 실행되도록 합니다. 부착 플라스크와 인큐베이션 챔버가 모두 섭씨 37도에 도달하면, 글리리터 당 백만 세포에 도달하기 위해 부착 플라스크에 곰팡이 세포의 충분한 하룻밤 문화를 추가합니다. 세포가 적응할 수 있도록 15분 간 기다립니다.
녹색과 주황색 측 부착 플라스크 밸브를 모두 열고 성장 플라스크 밸브를 모두 닫아 세포의 흐름을 시작합니다. 셀이 슬라이드에 도달할 수 있도록 약 5분 정도 기다립니다. 이 시간 동안 현미경에 초점을 맞추고 이전 실험에서 사용되는 동일한 이미징 매개 변수로 조정합니다.
첨부 파일 단계에 대한 이미지 수집을 시작합니다. 약 5분 과 10분 후에 다시 확인하여 포커스가 유지되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 다음 이미지를 획득한 직후에 포커스를 조정해 보려고 시도합니다.
첨부 파일 단계가 완료된 직후 파일을 저장합니다. 그런 다음 녹색과 주황색 측면 성장 플라스크 밸브를 모두 열고 부착 플라스크 밸브를 모두 닫습니다. 배양실 내부에 밸브가 있으면 스테이지를 부딪히지 않도록 주의하십시오.
온도계 프로브의 플러그를 뽑고 부착 플라스크를 성장 플라스크로 교체합니다. 이제 소프트웨어를 구성하여 22시간 동안 15분마다 이미지를 획득하고 성장 단계에 대한 이미지 수집을 시작합니다. 성장 단계 수집이 완료되고 파일이 저장되면 녹색 및 주황색 측면 부착 플라스크 밸브를 열어 주황색 측의 압력이 해제될 때 소음을 낼 수 있습니다.
두 미디어 플라스크에서 나오는 녹색 측면 튜브를 끌어 올려 미디어보다 적어도 몇 센티미터 가 될 때까지. 그런 다음 펌프를 고속으로 실행하여 튜브에서 모든 미디어를 제거하여 청소가 훨씬 쉬워집니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 비디오를 정량화합니다.
이번 경과 암필드 현미경 비디오는 부착 단계 동안 기판 하류에 야생 형 칸디다 알비칸 세포의 부착을 보여주고, 바이오 필름 형성으로 이어지는 성장 단계 동안 후속 성장 및 개발이 뒤따랐다. 이들 비디오에서 데이터는 시간이 지남에 따라 세포 부착 및 분리 및 바이오매스의 비율을 분석할 수 있으며, 여기에 도시된 총 바이오매스는 밀도 분석에 의해 결정된 바와 같이 이미징 영역 내의 총 바이오매스이다. 세포 부착의 누적 속도와 시간이 지남에 따라 바이오 매스 분리%도 표시됩니다.
이 절차를 시도하는 동안, 이것은 그들 사이에서 정량적 비교를 할 수 있기 때문에, 모든 실험에 걸쳐 동일한 화상 진찰 조건을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
