이 방법은 수용체 효소 상호 작용 및 효소 활성화에서 다른 단백질 도메인의 중요성과 같은 세포 신호 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수용체 효소 상호 작용의 수반되는 테스트와 효소 활성에 대한 이러한 상호 작용의 기능적 결과를 수반하는 것입니다. 각 플레이트에 대해 10%의 FBS와 1%페니실린 및 연쇄 절제술로 보충된 DMEM 10밀리리터를 사용하십시오.
이식 전날, 세포 수를 계산하기 위해 혈류계를 사용하여 12 10센티미터 플레이트로 인간 배아 신장 293-T 세포를 종자. 5%C02에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 일단 세포가 80 에서 90%의 응수되면, 지질 계 형 형 질광제를 사용하여 5 개의 플레이트를 트랜스펙트하십시오.
10센티미터 플레이트의 준수 세포에 대한 제조업체의 지침에 따라 경전을 수행합니다. 그런 다음 면역 침전 전에 발현 된 단백질 량의 측정을 위한 비감염 된 대조군역할을 하는 1 개의 추가 플레이트와 함께 5 개의 플레이트의 동일한 두 번째 세트를 트랜스펙트합니다. 48시간 동안 5%의 CO2에서 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 전감염된 플레이트를 배양한다.
형광 현미경을 사용하여 GFP 발현에 대한 세포를 검사하고 형질이 성공적으로 발생했는지 확인합니다. 100밀리머 나트륨 orthovanadate의 15 마이크로리터를 과산화수소 30%의 마이크로리터 50마이크로리터와 혼합하여 신선한 퍼바나데이트 혼합물을 준비합니다. 태그가 지정된 버전의 PD-1을 인광하려면 PD-1-GFP 전세포로부터 미디어를 제거한다.
일반 DMEM 10밀리리터와 각 플레이트에 10마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그 후, 세척당 PBS 의 5 밀리리터를 사용하여 얼음 차가운 PBS에서 세포를 세 번 세척하십시오.
면역 침전을 수행하는 동안 모든 단계는 얼음이나 섭씨 4도에서 수행되어야합니다. 10 밀리리터의 완충제에서 억제제 1정을 용해시켜 프로테아제 억제제로 용해 완충제를 보충한다. 또한 PD-1-GFP-전감염 플레이트에 사용될 완충제에 소도바나데이트 나트륨 1밀리머를 첨가한다.
500 마이크로리터의 얼음 냉기 용해 버퍼를 세포에 추가하여 PD-1-GFP-전세포가 함유된 플레이트에만 나트륨 orthovanadate를 함유한 리시스 버퍼를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 즉시 제거하고 수집합니다. 용양을 1.5 밀리리터 콜드 튜브로 옮기고 중력0.005배, 섭씨 4도에서 30분 동안 회전합니다.
용사에서 핵 후 상체를 수집하려면 10, 000 배 의 중력및 섭씨 4도에서 10 분 동안 아래로 회전하십시오. 수퍼네이너츠를 새로운 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기합니다. 나중에 WCL 분석을 위해 얼음에 6 개의 플레이트의 두 번째 세트에 대한 슈퍼 네이너티츠를 저장합니다.
안티 GFP 구슬을 준비하기 시작하려면 침전을 방지하기 위해 열기 전에 구슬이 들어있는 병을 부드럽게 흔들어 줍니다. 각 조건당 슬러리에서 항 GFP 구슬 의 40 마이크로리터를 제거합니다. 원심분리기는 중력 500배, 섭씨 4도에서 3분간.
상체를 제거하여 구슬을 세척하여 피펫과 구슬 사이의 접촉을 최소화하여 손실을 방지하십시오. 샘플당 리시스 버퍼의 80 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 4개의 플레이트의 첫 번째 세트의 PD-1-GFP 표현 세포로부터 세척된 구슬을 셀 용해에 직접 추가합니다.
GFP 태그 단백질을 면역침전을 위해 섭씨 4도에서 30분 동안 중력0.005배에서 회전합니다. 각 세척에 대해 orthovanadate를 포함하지 않는 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터를 사용하여 구슬을 세 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 원심 분리기는 10초 동안 2, 500배 의 중력에서 분리됩니다.
활성 SHP2의 용액을 첫 번째 플레이트 세트에서 3개의 동일한 부분으로 나누고 세척된 PD-1-GFP 함유 구슬을 포함하는 세 개의 튜브 각각에 일부를 추가합니다. 비감염 된 세포에서 용해 부피의 1/3을 야생 형, PD-1-GFP 구슬의 두 번째 튜브에 추가합니다. 나머지 2/3을 폐기합니다.
구슬을 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양하고 무게는 0.005배의 부드러운 회전으로 바짝 배양합니다. 그 후, 각 세척에 대해 차가운 용해 버퍼 1 밀리리터를 사용하여 구슬을 두 번 씻으시다. 각 샘플에 80마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가하여 각 튜브의 총 부피가 100 마이크로리터임을 보장합니다.
컷 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 부드럽게 위아래로 섞습니다. 그런 다음 각 튜브에서 50 마이크로리터를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮습니다. 구슬을 인산세척 버퍼로 한 번 씻으시다.
그런 다음 상체를 완전히 제거합니다. 100 마이크로리터의 분석 버퍼를 구슬에 넣고 부드러운 동요 하에서 30분간 섭씨 30도에서 배양합니다. 완충제가 노란색으로 변하면 수산화 나트륨의 1개의 어압 액면의 50 마이크로리터를 추가하여 반응을 종료합니다.
원심분리기는 10초 동안 2, 500배의 중력에서 분리됩니다. 그 후, 96웰 플레이트에서 상체를 하프 영역의 두 개의 우물로 옮긴다. 405 나노미터에서 흡수체를 읽고 PD-1-GFP의 제어 야생 형 버전을 통해 상대 광학 밀도로 결과를 표현한다.
먼저 구슬을 2, 000배, 섭씨 4도에서 30초 동안 회전하고 상수체를 제거합니다. 2회 Laemmli 버퍼20마이크로리터를 넣고 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다. BCA 키트를 사용하여 입력 컨트롤의 단백질 농도를 측정합니다.
가장 희석된 시료 30마이크로리터를 새로운 튜브로 옮기습니다. 리시스 버퍼를 사용하여 입력 컨트롤의 나머지 부분을 가장 희석된 샘플과 동일한 농도로 희석합니다. 그런 다음 희석된 각 입력 컨트롤의 30마이크로리터를 새 튜브로 옮기습니다.
lysates에 두 번 Laemmli 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 동안 섭씨 95도를 끓입니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 30초 동안 2, 000배 의 중력 및 섭씨 4도에서 구슬을 회전시합니다. 본 연구에서는, 결합된 공동 면역침전및 효소 활성 분석은 수용체 효소 상호 작용 및 활성화의 병렬 평가를 위해 개발된다.
당연히, SHP2는 ITSM이 돌연변이되었을 때 PD-1에 묶지 못했습니다. 놀랍게도 ITIM의 돌연변이 버전은 제한된 범위로만 SHP2 결합을 억제했습니다. 그럼에도 불구하고, SHP2-인산염 활성 분석은 ITIM과 ITSM이 효소 활동에 동등하게 필수 불가결하다는 것을 보여줍니다.
이것은 SHP2가 휴식 조건 하에서 자동 억제 된 형태로 접힌 2 단계 활성화 모델을 보여줍니다. PD-1의 활성화시, SHP2는 인광 ITSM에 모집된다. 그러나 ITIM은 SHP2를 활성 형태로 전개하기 위해 인광이 되어야 합니다.
개발 후, 이 기술은 수용체 효소 상호 작용에서 단백질 도메인의 기능을 탐구하는 세포 신호 의 분야에서 연구원을위한 길을 열 수 있습니다.
