이 간행물은 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반  체 1708237입니다.

1입니다. 정화에 대 한 준비
<ol><li>셀 무료 원유 추출의 준비<ol>
<li>대장균 (BL21) overexpressed 태그 polyhistidine metalloprotein25 50 mL 원뿔 튜브에 그의 9 ~ 10 g 셀 펠 렛을 얻습니다.</li>
		<li>셀 펠 릿 총 볼륨 ~ 45-50 ml의 9 ~ 10 g을 방 임시 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미)의 그램 당 5 mL를 추가 합니다. 해산을 장려 하기 위해 주기적으로 소용돌이입니다. 펠 릿, 냉동 면 미지근한 물 욕조에 녹여.</li>
		<li>얼음 물 목욕을 사용 하 여, 진정 세포 세포의 용 해에 대 한 준비에 ~ 3 ° C에 세포 현 탁 액. 참고:이 시점에서 세포 세포의 용 해 쥡니다, 비드 밀링 또는 다른 방법에 의해 가능 하다. 비드 밀링 때문에 급속 한, 상대적으로 저렴 한, 그리고 귀 보호를 필요 하지 않습니다 여기 증명 됩니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 챔버 밀링 50ml 비드 조립.</li>
		<li>채우기의 전체 절반 비드 밀 챔버 냉장-20 ° c.에 저장 된 0.1 m m 유리 구슬</li>
		<li>냉장된 셀 서 스 펜 션 챔버의 나머지와 4 ° C 세포/바인딩 버퍼를 사용 하 여 챔버를 완전히 채우기.</li>
		<li>비드 밀의 샤프트를 회전 하는 구슬 세포 현 탁 액을 혼합 작은 주걱을 사용 합니다.</li>
		<li>피펫으로와 모든 큰 거품을 제거 하 고에 뚜껑을 나사.</li>
		<li>어떤 누설에서 챔버 드라이.</li>
		<li>명확 하 고, 플라스틱 자 켓에 얼음의 약 1 컵, 얼음 가득 재킷과 나사 폐쇄로 채워진된 50 mL 챔버를 반전.</li>
		<li>모터에 얼음 외피 챔버를 보호 합니다.</li>
		<li>비드 밀 15,800 rpm에서 15 초 동안에 모터 설정 후 45 초 동안 휴식을 허용. 8 회 반복 한다.</li>
		<li>8 주기 완료 되 면 50 mL 또는 더 큰 튜브 고속 원심 분리 (25000 g x 이상)에 대 한 평가로 전체 세포 세포 현 탁 액을 가만히 따르다. 작은 세포 파편과 유리 구슬에 4 ° C에서 40 ~ 45 분 스핀 25000 x g에서 원심 분리기에 균형된 관의 쌍을 놓습니다. 참고: 50 mL 또는 고속 원심 분리에 대 한 평가 큰 튜브 사용할 수 없는 경우에서 centrifuging 여 유리 구슬 제거 작은 양의 세포 현 탁 액 (25 mL) 작은 volum에 decanted 수 있는 수익률 50 mL 원뿔 튜브에 2-3 분 동안 g x 1000-2000 e 튜브 고속 원심 분리에 대 한 평가.</li>
		<li>원심 분리가 완료 되 면 가만히 따르다, 노란색 셀 무료, 원유 추출 물 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브로. 알아서 하지 어떤 세포 파편을 전송.</li>
		<li>SDS 페이지26에 의해 정화의 나중에 분석 셀 무료 원유 추출의 작은 샘플을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아이맥 칼럼의 준비<ol>
<li>수 지 입자, Luer 잠금 콘센트 및 Luer 잠금 피팅을 포함 하는 상위 모자를 유지 하기 위해 낮은 침대 지원을 갖춘 1.5 x 20 cm 열을 가져옵니다. 흐름을 제어 하는 자 지와 Luer 잠금 콘센트에 맞게.</li>
		<li>안전 하 게 벤치탑에서 working, 링 스탠드에는 열을 탑재 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 저장 된 20% 에탄올에 니켈 바인딩된 nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 50% 슬러리를 얻기</li>
		<li>부드럽게 균등 하 게 다시 중단 수 지 병을 소용돌이 친다.</li>
		<li>실내 온도에 및 벤치탑, 사용의 1 mL을 보장할 슬러리의 2 개 mL를 철회 졸업된 피펫으로 정착 수 지 바인딩 polyhistidine의 50-60 밀리 그램의 단백질, 태그와 열에 슬러리 전송에 작업.</li>
		<li>자 지를 열고 수 지에서 중력에 의해 배수 하는 과잉 스토리지 솔루션을 허용 합니다.</li>
		<li>자 지를 안전 하 게 닫으십시오</li>
		<li>파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 냉장된 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미) 추가 수 지-적어도 30 mL의 열. 알아서 하지 방해 수 지 표면. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼 컬렉션 비 커에 중력에 의해 열에서 천천히 배출 함으로써 수 지 equilibrate.</li>
		<li>세포/바인딩 버퍼는 대부분 물기를 때 세포의 용 해 버퍼의 ~ 5 mL 수 지 위에 때 버퍼의 흐름을 중지 하려면 자 지 닫고 열, 직 립, 진행 준비가 될 때까지 또는 최대 1 주에 대 한 탑재를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정화 태그 Polyhistidine 아이맥으로 대상의
<ol><li>워시 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 mM NaCl, 20mm 이미 pH 8) 및 차입 버퍼 (인산 염, 300 mM NaCl, 250 m m 이미 10% 글리세롤 pH 8 m 50 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 진정</li>
	<li>자 지를 열고 남은 세포/바인딩 버퍼 Ni NTA 수 지를 통해 중력에 의해 배수를 허용 하 여 Ni NTA 열 셀 무료 원유 추출의 추가 대 한 준비. 모든 버퍼는 물기와 수 지 표면 노출는 자 지를 닫습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫으로, 신중 하 게 피펫으로 사용 하 여 셀 무료 원유 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용 수 지에 추출 합니다. 원유 추출 물 튀는 것을 방지 하려면 열 벽을 아래로 실행 합니다. 원유 추출 물 적용의 볼륨은 polyhistidine 태그 단백질;의 표현 수준에 따라 원유 추출의 총 볼륨 포함 50-60 밀리 그램 이하의 Ni NTA 수 지의 mL 당 대상 단백질의 (1.2.4 단계 참조).</li>
	<li>때 모든 원유 추출의 열으로 전송 되었습니다, 그래서 열이 중력에 의해 배수 할 수 있다는 자 지를 엽니다. 이 흐름을 통해 수 지-SDS 페이지에 의해 정화의 향후 분석을 위해 수집 100 μ에 바인딩되지 않은 단백질으로 구성 된다. 26
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출의 점성 열의 중력 흐름을 상당히 느려질 수 있습니다. 흐름의 속도 높이려면 간단한 "손 펌프"를 적용:<ol>
<li>10 mL Luer 잠금 주사기를가지고 하 고 플라스틱 튜브 및 열 모자와 주사기 Luer 잠금 피팅 사이 짧은 길이 사용 하 여 열의의 모자를 연결 합니다. 주사기 플런저 밖으로 그리고 단단히 적합 열 상단 열 모자.</li>
		<li>부드럽게 수동으로 졸업된 실린더;에 eluent 수집 하 여 흐름 속도 평가 하는 동안 주사기의 플런저를 압축 분 당 1-2 mL의 수 지 및이 설치와 호환 됩니다. 부드럽게 유량으로 주사기 플런저의 압축을 증가.</li>
		<li>수 지에 공기의 도입을 방지 하려면 열 뚜껑을 제거 적용된 액체의 초승달 모양에 도달 하면 수 지 침대 위에 5-10 m m 손 펌프를 연결 및 중력에 의해 배수 하는 나머지 볼륨을 허용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 무료 원유 추출 물 배출 완료 하 고 수 지 표면에 다시 노출, 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 워시 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 열고 워시 버퍼 열을 통해 배수를 허용 합니다. 이 프로세스는 수 지에서 약하게 바인딩된 단백질을 제거 합니다. Eluent는 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼를 배출 하는 동안 준비 16, 표시, 1 mL 분수를 수집 하기 위해 microcentrifuge 튜브.</li>
	<li>워시 버퍼는 물기, 수 지 표면에 다시 노출 되는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 차입 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.</li>
	<li>자 지를 천천히 열고 열에서 태그 polyhistidine 단백질을 elute 차입 버퍼를 허용 합니다. 각 표시 된 microcentrifuge 튜브, 1 16-eluent의 1 mL를 수집 합니다.</li>
	<li>단백질 시 약 또는 악기 제조 업체27,28여 Bradford 분석 실험 또는 특정 방법에 따라 UV 보이는 분광학 등 색도계 단백질 분석 결과 사용 하 여 분수를 테스트 합니다. 같이, 색도계 분석 결과 Coomassie blue를 사용 하 여이를 축소 100 μ 볼륨 각 분수에서만 작은 볼륨을 희생 하기 위하여.</li>
	<li>색도계의 100 µ L 각 분수의 혼합 3 μ 시 약을 시험 하 고 수동으로 분수; 단백질의 존재를 나타내기 위해 어떤 색깔 든 지의 형성 탐지는 분석기와 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>단백질 분수 16에에서 있으면 1 mL 분수와 단백질에 대 한 분석 결과 정기적으로, 방출까지 계속 eluted 분수 이상 단백질의 상당한 금액을 포함.</li>
	<li>깨끗 한 원뿔 관으로 포함 하는 단백질 분수를 결합 하 고 나중에 분석 100 μ 샘플 SDS 페이지26에 의해 철회.</li>
	<li>금속 이온 공동 인자의 재구성으로 진행 하거나 3 mL aliquots-80 ° c.에 있는 단백질을 고정 그 10% 글리세롤 포함 한지는 차입에 버퍼가 cryoprotectant 동결 동안 순수 단백질을 안정.</li>
	<li>Ni NTA 열의 차입 완료 되 면, 즉, 모든 단백질은 열에서 고 분수에서 수집, 전달 열을 통해 차입 버퍼의 또 다른 25 mL 단기 저장을 위해 차입 버퍼의 ~ 5 mL에 4 ° C에 열을 저장 또는 장기 저장을 위한 20% 에탄올과 세포/바인딩 버퍼.</li>
</ol>3. Fe2 + 대상 단백질의 재구성
<ol><li>Fe2 + 의 추가 참고:이 예제에서 아미노산의 일종 dioxygenase 같은 효소 바인딩 비 heme 철 (II) 필요는 Fe2 + 이온 활동; 그러나, 철 (II)는, 철 (III), 쉽게 산화 하 고 전혀 어떤 철 없이 정화 단백질의 일부분.<ol>
<li>금속의 재구성을 시작 하려면 차입 버퍼에 순화 된 효소의 3 mL을 구하십시오. 냉동, 미지근한 물 목욕을 사용 하 여 빠르게 해 동 하 고 한 번 해 동, 얼음에 단백질을 넣어.</li>
		<li>튜브에 단백질의 볼륨을 사용 하 여, 나트륨 하는데 (198.1 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 또한, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다.</li>
		<li>단단한 나트륨 하는데 및 DTT 추가 하 고 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 완전히 분해를 혼합. 알아서 하지 지나치게 공격적 혼합 단백질 강 수 발생할. 단백질 견본을 철 (II) 황산 염 heptahydrate (MW 278.01 g/mol)의 작은 금액을 추가 합니다.</li>
		<li>몇 가지 1 철 소금, 수돗물의 충분히 작은 수량을 얻기 위하여 mm FeSO4•7H2O 밖으로 단단한 조각에의 립 종이 무게과 립, 종이 접고 고 금속 주걱의 편평한 측으로 그것을 분쇄.</li>
		<li>단백질의 튜브를 결과 분말의 입자를 추가 합니다.</li>
		<li>혼합 하는 소용돌이 장미빛 핑크 색 튜브에 표시 됩니다.</li>
		<li>단백질, 얼음에 10-30 분 출장의 분홍색 솔루션을 품 어. 핑크 색상 천천히 시간이 지남에 사라질 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 여과<ol>
<li>약 6, 000의 분자량 제외 제한와 10 mL 저수지도 갖춘 1.5 x 12 cm 열 µ m 90-180의 수 화 입자 크기 범위 구형 polyacrylamide 젤 10 mL 포장 젤 여과 열을 사용 합니다. 열은 낮은 갖추고 상단 침대 지원 열에 수 지를 유지 하 고 수 지 침대 건조 실행에서 방지 30 um 다공성 폴 리 에틸렌 디스크의 형태로 확인 합니다. 젤 여과 열 링 스탠드를 탑재 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 뚜껑을 제거 하 고 상단 침대 지원 위에 초과 버퍼에서 부 어.</li>
		<li>열, equilibrate에 버퍼 후속 분석 결과 및 저장, 예를 들어 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤과 호환 되는 저수지를 작성 하 여 시작 합니다.</li>
		<li>사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 버퍼의 흐름을 시작 하 여 노출 Luer 슬립 피팅 젤 여과 열의 아래쪽 끝에서 스냅. 열, Luer 슬립 끝에 자 지를 맞게 하지만 고 열 중력 드립에 허용.</li>
		<li>버퍼 열에서 뽑아가 고 상단 침대 지원 노출, 자 지, 닫고 노출된 상단 침대 지원에 솔루션 pipetting으로 열에 Fe (II) 재구성 metalloenzyme ~ 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>자 지를 열고 전체 3.0 mL 샘플 중력에 의해 열을 입력을 허용 합니다. Eluent의이 첫 3 mL을 삭제 합니다. 솔루션을 처리 하는 동안 형성 된 핑크 색상 열의 상단에 갇혀 있을 것입니다.</li>
		<li>열 물이 뚝뚝 떨어지는 중지 하 고 상단 침대 지원 노출, 열에 젤 여과 버퍼 (예를 들어, 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤)의 4 개 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 microcentrifuge 튜브 8 0.5 mL 분수는 eluent 수집 합니다.</li>
		<li>앞에서 설명한 대로 색도계 단백질 분석 결과 또는 UV 마주27,28 를 사용 하 여 단백질에 대 한 분수를 테스트 합니다.</li>
		<li>결합 단백질이 포함 된 분수.</li>
		<li>SDS 페이지 분석26에 대 한 샘플을 철회 한다.</li>
		<li>분석 결과 또는 샘플의 스토리지와 함께 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

저자 아무 공개 있다.

재조합 형 단백질을 아이맥에 의해 그들의 정화 polyhistidine 태그의 추가 생 화 확 적인 문학3,4,5, 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션에에서 거의 유비 쿼터 스 되는 생화학에 스파스, 남아 가르치는 실험실 및 게시 방법을 항상 교육의 자원 한계를 고려 하지 않습니다 연구소20. 또한, 교육 연구소에 아이맥의 사용 평가 활동 및 순수성, 효소는 이상적인 교육 활동의 아이맥 정화를 만드는 실험에 결합 될 때 가장 효과적입니다. 아이맥의 효소, metalloenzymes를 포함 하 여 교육 실험실에서의 정화에 응용 프로그램을 확장 하기 위해 안정적이 고 저렴 한 방법 필요 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 벤치탑 아이맥 또한 종속 iron(II)를 재구성 하 여 metalloproteins22아이맥의 응용 프로그램에서 한계를 해결 하는 동안 쉽게 구할 수 있고 저렴 한 실험실 공급을 사용 하 여 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 정화 게시. 8 학생 그룹에 대 한 소모품의 비용입니다 $500-600 그림 1 과 그림 2에서 설명 하는 분석 단계를 포함 하 여이 프로토콜을 실행 하는 학기 당 사이 예상 시 약 및 자료를 사용 하 여.
용이성은 Fe2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24 와 Fe2 + 의 손쉬운 산화 O2 Fe3 +, 비-헤의 재구성으로 인해 재조합 metalloenzyme에 iron(II) 아미노산 킬레이트 화 되는 효소 정화의 일반적인 구성 요소입니다. 클래식 크로마토그래피를 사용 하면 일부 경우32, 철 분의 총 손실을 방지 하기 위해 가능 하다 그러나 철 (II)를 추가 하 여 다시 감소 시키는 대리인33,,3435, 의 존재는 더 자주, 36 및 과잉 철은 어떤 경우에는 혐 기성 분위기가37,,3839, 아래 자주 제거33,,3436, 복잡 모든 후속 분석 결과입니다. 클래식 크로마토그래피와 혐 기성 분위기의 연속 단계 학부 실험실,이 프로토콜의 개발을 자극에 대 한 현실 되지 않습니다.
동안 Ni NTA 열의 수동 준비 및 중력에 의해 크게 샘플의 처리는 추가 시간 및 노력 때 사전 패키지 된 열에 비해 크로마토그래피 계측 자동화, 수동 단계 허용에 대 한 실습 학습 과정의 뒤에 과학의 증가 이해에서 발생 하는 학생에 의해. 여기에 설명 된 조건 하에서 철 (II) 소금의 추가 초과 dithiothreitol에 특히 민감합니다. 학생 dithiothreitol의 과잉, 실수로 추가 강수량 이벤트가 높습니다. 우리는 도움이 필요 시 수량 계산 실험실 시간 벤치에 가장 효과적으로 사용할 수 있도록 실험실에 도착 하기 전에 수행 하는 학생을 발견 했다. 세포-세포 단백질 차입-하에서 전체 벤치탑 아이맥 정화-재구성 및 이후 실험실 기간 분석 결과 1 4 시간 실험 기간에 수행할 수 있습니다.

고정된 금속에 의해 히스티딘 태그의 chelation를 사용 하 여 호스트 유기 체의 추출 물에서 태그 polyhistidine 단백질의 정화의 첫 번째 보고서는 문학 19881,2입력. 그때 이후로, 재조합 단백질 및 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 그들의 정화 태그 polyhistidine 추가 되었다 생 화 확 적인 문학3,4,에에서 거의 유비 쿼터 스 5. 아이맥 정화 방법 자동된 크로마토그래피를 사용 하 여 벤치탑 및 스핀 열 형식을 구현할 수 있습니다. 친 화력 정화 방법, 특히 아이맥, 연구 실험실에서 널리 이용 된다, 그러나 그들은 보다 적게 일반적 학부 교육 연구소. 생화학 실험실에 대 한 가장 널리 사용 되는 실험실 교과서 정기적으로 치지 않는다 이러한 방법, 대신 더 전통적인 이온 교환 또는 염료 바인딩 크로마토그래피6,,78 선택 , 9. 예를 들어 앤더슨10 젖 산 효소의 정화 염료 바인딩에서 선호도 사용 하 고 소 우유 α-lactalbumin7,11 Boyer에 의해 정화 사용 니켈 nitriloacetic 산 행렬, 하지만 아무 재조합 폴 리 히스티딘 태그, 수 지에 대 한 단백질의 본질적인 선호도에 대신 의존. 일부 현대 학부 실험실 교과서 및 출판물 녹색 또는 빨간색 형광 단백질12,13와 같은 폴 리 히스티딘은 단백질 목표에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 구현 14,15,16, 항 체 및 선택한 효소17,18,,1920, 심지어 알 수 없는 함수21일부. 확실 하 게, 효소의 정화는 교육 연구소에서 바람직 대상 수 수 분석 활동에 대 한 후속 세션에서 학생; 편에서 "진짜 과학"의 경험을 풍부 하 게 하기 때문에 사실, 실험실 경험의이 종류는 출판 하 고 학생 들의 학습에 도움이 결과 보고17,18,,2021. 생화학 실험실 스파스, 유지 및 게시 방법 일반적으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 계측에 대 한 액세스를 감히 심지어 수 있습니다 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션 교실 실험실에서 사용 하는 아직, 그리고 20. metalloproteins, 특히 그 활동22에 필수적인 산화 환 원에 민감한 divalent 금속 묶는 아이맥의 응용 프로그램에 제한이 있다. 자주, 금속 이온은 분실 또는 정화 저조한 학부 실험실에 어울리지 비활성 효소 중 산화.
효소의 전체 1/3 바인딩 금속 이온23, 그리고 모든 형태의 생활23에 대 한 거의 보편적인 요구에도 불구 하 고 철 틀림 없이 enzymology에서 가장 금속 이온 중. 비 헤 Fe2 + 바인딩 효소는 아이맥; 중 특히 손실 및 금속의 산화 하는 경향이 heme는 Fe와2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24용이성 같은 전용된 유기 ligand의 결여 때문에 아마도 또한, Fe2 + Fe3 + 산소 의존 산화 용액, 부정적인 자유 에너지 변화와 Fe3 +의 상대적인 안정성 때문에 자연입니다. 종종, 이러한 과제는 혐 기성 분위기 및/또는 비-아이맥 컬럼에 방법22의 사용에 의해 극복 된다. 이 문서에서는, 우리 벤치탑 정화는 Fe2 + 종속 metalloenzyme l 아미노산의 일종 dioxygenase 사용 하 여 간단 하 고 저렴 한 크로마토그래피 소모품, Fe2 +, 활성 사이트의 재구성에 의해 다음 아이맥의 사용을 시연할 예정 이다 하 고 효소 분석 실험입니다. 이러한 방법 6-12 학생 그룹의 우리의 자신의 학부 생화학 실험실에 있는 표준 및 효소 조사 학부 수준에서의 레 퍼 토리를 확장 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0.1mm glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101</td><td>1 pound each</td></tr><tr><td>50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, monobasic</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Resin&amp;nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&amp;nbsp;</td><td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stopcock Valve, one way, female to male luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>pack of 50</td></tr><tr><td>BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fiserbrand universal pipet pump</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipets</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG desalting columns</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>box of 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 gels</td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&amp;nbsp;</td><td>case of 500</td></tr><tr><td>Cuvette Caps Square Disposable</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Equipment:&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 50mL chamber&amp;nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 chamber</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&amp;nbsp;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&amp;ndash;120/220&amp;ndash;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td></tr><tr><td>UV-1800 with UV-Probe Software</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>version 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 태그 polyhistidine 단백질의 학부 학생 들에 의해 쉽게 마스터 그리고 현대 문학에서 가장 널리 사용 되 단백질 정화 방법 되고있다. 하지만, 산화 철, 민감한 금속에 특히 그들 금속 바인딩 단백질 친화성 크로마토그래피의 응용 프로그램은 종종 실험실 글러브 박스-일상적으로 학부에서 사용할 수 있는 장비에 대 한 액세스 제한 실험실입니다. 이 문서에서 설명 하는 절연, 아이맥 폴 리 히스티딘 태그의 정화 및 금속 이온 재구성, 산화 환 원 활성, 비 heme 철 바인딩 extradiol dioxygenase 및 다양 한 기판으로 dioxygenase의 분석 결과 대 한 우리의 벤치탑 메서드 농도 그리고 산소를 흠뻑 젖 게입니다. 이러한 메서드는 학부 학생 들에 의해 실행 되 고 액세스할 수 있고 주로 학부 기관에서 저렴 한 계측과 학부 교육 및 연구 실험실에서 구현.

이러한 대표적인 결과 BCM 341의 2 개의 과정 실험실 기간 동안이 프로토콜을 실행 그들은 학부 학생 들에 의해 수집 된: Muhlenberg 대학에서 실험 생화학. 그림 1 보여줍니다 20 kDa 폴 리 히스티딘의 정화의 결과 4 시간 교실 실험실 기간 동안 두 학부 학생에 의해 수행으로 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 태그와 같은 SDS 페이지 분석 후속 실험 기간 동안 학생입니다. 폴 리 히스티딘은 단백질이 효과적으로 정화 (그림 1, 2 차선). 폴 리 히스티딘 태그에 대 한 항 체를 사용 하 여 젤의 immunoblot 나타냅니다는 흐름-를 통해 (데이터 표시 되지 않음), 폴 리 히스티딘 태그 대상 단백질의 작은 금액을 손실 됩니다 가능성이 있기 때문에 대상 단백질에의 100 밀리 그램 양 보다 큰에 수 지의 바인딩 용량 초과 lysate.
그림 2 에서는 철 (II)와 여과 젤-후속 프로토콜에서 설명 된 대로 재구성 후 폴 리 히스티딘 태그 metalloenzyme 대상, l 아미노산의 일종 dioxygenase의 효소 반응에 학생 수집 활동 데이터를 보여 줍니다. 여기. 데드 타임 데이터 수집 전에 시작 5 초 처음으로이 기술을 실행 하는 학생 들의 전형 이다. metalloenzyme의 강력한 활동 게시 된 분석 결과 사용 하 고 정상 상태 운동 매개 변수 게시 결과29일치를 굴복 발견 되었습니다. 정상 운동 매개 변수 피팅 그림 2에 표시 된 진행률 곡선30 에 의해 결정 되었다 그러나, 기질 농도의 시리즈를 통해 수집 하는 초기 속도의 비 선형 최소 제곱법 피팅 가능한31똑같이 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> 그림 1입니다. 폴 리 히스티딘의 SDS 페이지26 분석 하기 전에, 동안과 정화 후 단백질을 태그. 레인 1-분자량 마커, 2 순화 단백질 (20 kDa) 게시물 Ni NTA, 4-셀 무료 원유 추출 물 정화, 5 이전-세포 파편 펠 릿 게시물 세포 '를 통해 3-Ni-NTA 흐름. 샘플 샘플/로딩 버퍼 x 5를 사용 하 여 준비 하 고 프리 카스트 4-20 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법 체계를 사용 하 여에 분리 했다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> 그림 2입니다. 정상 상태 분석 결과 철 (II)의 버퍼 (인산 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8) 기판 (l 아미노산의 일종-5 µ M (빨강), 25 µ M (녹색), 50 µ M (블루))와 metalloenzyme를 (즉, l 아미노산의 일종 dioxygenase, 10µM)를 재구성 된다. 흔적 묘사 414nm에서 제품 형성. 흡 광도 데이터 지속적으로 분할 빔 스캐닝 자외선 보이는 분 광 계29에 1 mL 메타 크 릴 산 큐 벳을 사용 하 여 인수 했다. 원시 데이터는 Michaelis-Menten 정상 상태 근사 (KM 30.8 µ M ± 14.4, k고양이명백한 2.3-1 ± 0.05)30의 모델에 맞게 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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비디오: Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived phosphorescent signal when coordinated to a histidine-containing protein immobilized on the surface of a magnetic particle. Synthesis of Ir1, in high yields,is complete O/N&#160;and involves splitting of the parent cyclometalated Ir(III) chloro-bridged dimer into two equivalents of the solvated complex. To confirm specificity, several amino acids were probed for coordination activity when added to the synthesized probe, and only histidine elicited a signal response. Using BNT-II, a branched peptide mimic of the malarial biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), the iridium probe was validated as a tool for HRP-II detection. Quenching effects were noted in the BNT-II/Ir1 titration when compared to L-Histidine/Ir1, but these were attributed to steric hindrance and triplet state quenching. Biolayer interferometry was used to determine real-time kinetics of interaction of Ir1 with BNT-II. Once the system was optimized, the limit of detection of rcHRP-II using the probe was found to be 12.8 nM in solution. When this protein was immobilized on the surface of a 50 &#181;m magnetic agarose particle, the limit of detection was 14.5 nM. The robust signal response of this inorganic probe, as well as its flexibility of use in solution or immobilized on a surface, can lend itself toward a variety of applications, from diagnostic use to imaging.

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

연구

화학

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

생화학

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as many of the common di-and trivalent cations used in IMAC resins have an inhibitory effect on enzymes. However, the extent of metal leaching and the impact of various eluting and reducing reagents are poorly understood in large part due to the absence of simple and practical transition metal quantification protocols that use equipment typically available in biochemistry labs. To address this problem, we have developed a protocol to quickly quantify the amount of metal contamination in samples prepared using IMAC as a purification step. The method uses hydroxynaphthol blue (HNB) as a colorimetric indicator for metal cation content in a sample solution and UV-Vis spectroscopy as a means to quantify the amount of metal present, into the nanomolar range, based on the change in the HNB spectrum at 647 nm. While metal content in a solution has historically been determined using atomic absorption spectroscopy or inductively coupled plasma techniques, these methods require specialized equipment and training outside the scope of a typical biochemistry laboratory. The method proposed here provides a simple and fast way for biochemists to determine the metal content of samples using existing equipment and knowledge without sacrificing accuracy.

We present an assay for easy quantification of metals introduced to samples prepared using immobilized metal affinity chromatography. The method uses hydroxynaphthol blue as the colorimetric metal indicator and a UV-Vis spectrophotometer as the detector.

고정화 금속 친화성 크로마토그래피에서 금속 침출정 정량화

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Biophysical Assay를 사용한 PROTAC의 삼원 복합체 형성 특성 분석

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

저자 스포트라이트: PROTACS 삼원 복합체 특성화를 위한 생물물리학 분석 평가 

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

<meta charset="utf8"></head><body>His-tagged FEN1 단백질의 효율적인 정제를 위한 FPLC 최적화

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Optimizing Affinity Chromatography for His-Tagged FEN1 Protein

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

요약

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말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

고정화 금속 친화성 크로마토그래피에서 금속 침출정 정량화

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제