Name: the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
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이 연구는 그랜트 2017-04559 스웨덴 연구 위원회 (VR)과 EU 지원된 프로젝트 해안가에서 앤 더 스 Blomberg에 의해 지원 되었다. 특히, 자란 시설의 설립, 년간, 지원 되었습니다 교부 금에 의해 R. 존슨은 당을 다음 자금 지원 기관에서: SSF (스웨덴 전략 연구 재단) 해양 과학 프로그램 및 기술 및 MISTRA 해양 페인트 프로그램을 통해입니다. 켄트 Berntsson는 culturingfacility를 설정 하는 초기 단계에서 쓸모 있었다. 추가 해양 진화 생물학 (www.cemeb.science.gu.se)에서 왔다 자란 시설 설립을 위한 자금, 스웨덴 연구 위원회 FORMAS와 VR에서 Linnaeus 교부 금에 의해 지원.

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저자는 선언할 수 없다.

Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)에서 따개 비 문화 20 년 이상를 실행 하 고 많은 다른 연구 분야에서 연구를 위해 사용 되었습니다. 30 과학 논문 출판 되었습니다 antifouling13,22, 유체역학23, 화학 생태학24연구를 포함 하 여 지난 년 동안 자란 시스템을 활용, 기후 변화16 ,5, 진화 생물학 및 분자 생물학2.
실험실 환경 (개인 야생 인구를 대표 하지 않을 수 있습니다)에 더 적응은 특정 개인의 선택을 방지 하려면 필드에서 매년 새로운 broodstock를 수집 하는 것이 좋습니다. 또한, 정상적인 년 동안 성인 사망률의 50-80%는 대략 이후 매년, 문화를 젊 어지게 하는 좋은 연습 이기도 합니다. 그러나, 목표는 타고 난된 라인 하거나 실험 진화의 연구를 설정 하 여, 실험실 reared 가족만 사용할 수 있습니다.
Tjärnö 해양 연구소에서 패널 B. improvisus 를 수집 하는 좋은 시간은 그 당시에 바다에서 cyprid 애벌레의 좋은 공급 6 월-8 월입니다. 따개 비 정착이 시작 될 때 참조를 수동으로 제거 하는 다른 패널 주간 정착 B. improvisus (예를 들어, 홍합, tunicates, 이끼, 또, nemerteans/tubeworms, 및 다른 따개 비 종) 보다 종에서 확인 된 패널 (예를들면, 칫 솔로). Tjärnö, 주위 3 얕은-물 따개 비 종 존재 (B. improvisus, Semibalanus balanoides, Balanus crenatus)이 있다. 그러나, B. improvisus 7 월-8 월 동안 지배적인 부드러운 하드 표면 fouler 이다. S. balanoides 의 정착 기간 이른 봄 동안 있으며 주로 자연 기판 (예:, 돌)을 좋아한다. B. crenatus 패널에 낮은 숫자는 여름 동안 발생할 수 있습니다.
그것은 또한 특정 특성으로 특정 linages를 설립 하는 경우에 필수적인 것입니다, 교양된 cyprids에서 또는 실험 진화의 연구에 새로운 성인 따개 비 세대 시작 가능. 어른 들의 새로운 세대를 시작 하는 가장 편리한 방법은 실험실에서 열가 소성 패널에 cyprids 정착 하는 것입니다. 실험적 치료 또는 노출 필드에 새로 정착된 cyprids이이 패널을 사용할 수 또한. 비상의 경우, 하나는 근처 사이트에서 (예를 들어, Tjärnö 해양 연구소의 경우 Idefjorden) B. improvisus 는 일반적인 바위에 성인을 사용할 수도 있습니다. 이러한 이미 설정 된 성인 따라서 쟁반에 배치 되는 패널에 성인으로 서 동일한 방식에서으로 처리 되며 시스템을 통해 흐름 통해 먹이. 흐름 세포 barnacles25패널 설정 또한 사용할 수 있습니다. 이들은 플랑크톤에는 cyprids 정착 하지 않는, 애벌레에 대 한 유일한 타협 표면으로 패널 측에 그물과 흐름을 통해 챔버.
장기적인 작동 따개 비 문화 등 모든 생활 단계를 설정 하기 위한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 메서드는, 훌륭한 정도, 또한 free-swimming, planktotrophic 애벌레와 다른 해양 무척 추 동물에 적용. 자란 절차 일부 종족은 이미 잘 설명 되어 있습니다 (예를 들면, 파란 홍합, 굴의 다른 종에 대 한)26, 다른 해양 무척 추 동물에는 그들의 일생에 걸친 장기 문화의 몇 가지 예만 주기. 문화 barnacles (B. amphitrite)를 최초의 성공적인 시도의 하나 Rittschof 그 외 여러분 에 의해 수행 됐다 15. 장기 재정 및 개인 자원 시설 재배는 따개 비를 설정 하기 전에 장소에 있어야 한다. 올해의이 종류의 유지 관리-따개 비의 주위 문화 적어도 한 사람 작업 하프 타임 필요 합니다. 미래 자동화 미세27의 경작 주로 생산 라인에 몇 가지 단계에 대 한 몇 가지 가능성이 있을 수 있습니다. 또한, 성공 하기 위해서는, 높은-품질 바닷물의 다량에 접근이 필수적입니다. Microalgae, Artemia, barnacles의 경작 어떤 특정 안전 절차는 포함 되지 않습니다. 그러나, 일부 antifouling 물질 또는 독성 화학 물질의 특별 한 조치를 할 수 있습니다.
패널은 오염에 대 한 주에 여러 번 체크 했다. 문화에서 사용 하는 해 수 Tjärnö 해양 연구소 밖에 서 요금 피에 40 m 깊이에서 펌핑 하 고 실험실 물 시스템에 들어가기 전에 2 개의 모래 필터를 통해 전달 했다. 경우 물 필터링 했다, 문화에 더 많은 오염 될 수 있습니다. 암 및 다른 무척 추 동물 (예를 들어, stolon 건물 또과 육 식 nemerteans)는 필드에서 바닷물의 공급을 통해 시스템을 입력 하는에서 문화에 패널을 정기적으로 청소 필수적 이다. 예를 들어 아무 애벌레도 불구 하 고 생산 하는 경우 잘 먹이 달리 문화 되었습니다 사실 있을 것 양호한 상태로, 짝짓기를 억제 하기 위해 표시 되는 nemerteans의 문제일 수 있습니다. 당연히, 많은 Tjärnö 해양 연구소에서 문화에 오염 생물의 스웨덴 서해안에 대 한 특정 되었고 오염 생물의 유행 되며 다른 지역에서 도전의 더 많은 것. 스웨덴의 서해안에는 패널에 다른 따개 비 종에 의해 오염 데 보통 아니다. 때때로, S. balanoides 의 설립 발견 되었습니다, 하지만 이것은 매우 한계 문제 (가장, 한 S. balanoides 오염 물질 10000 B. improvisus 샘플에 대 한). 종 오염의 부족 대부분 여름 동안 때 larvaefrom B. improvisus 매우 지배 했다 새로운 문화를 확립 하 정권에 의존 했다. 또한, 또한 있었다 패널에 B. improvisus 의 맑은 농축 이기 때문에이 종 부드러운 표면13에 대 한 선택적.
죽은 성인 barnacles 제거에 필수적 이다입니다. 빈 껍질 패널에 남아 있습니다, 그들은 모두 Artemia nauplii 뿐만 아니라 다양 한 오염 종족에 대 한 대피 소 될 수 있습니다. 또한, 그것은 죽은 개인 개인, 아마 분해 동안 독성 화합물의 출시와 함께 이웃의 영향을 발견 되었습니다. 성인 사망률의 추가적인 결과 일부 개인 남아 있을 것입니다 혼자와 너무 멀리 떨어져 (비록 barnacles의 크기에 관하여 동물의 세계에서 가장 긴 성 기를가지고) 짝짓기 있도록 다른 성인에서 이다28. 이러한 개인 생존 하지만 애벌레에 대 한 비 생산적 이다. 그러나, 이러한 고독한 성인 개인 베이스 플레이트를 해치지 않고 부드럽게 제거 될 수 있다 고 짝짓기 수 있도록 다른 사람에 가까이 수평으로 배치. Barnacles 또한 각 성인 한 패널을 배치 하 여 성관계 수 있습니다 하지만 십자가 발생할 수 있도록 충분히 가까이. 이 방법에서는, 유전 라인 생산된14될 수 있습니다.
그것은 높은 품질의 사료를 생산 하 고 피드 문화 거의 매일 중요입니다. 심지어 며칠 음식 없이 애벌레의 감소 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 식단 구성의 이전 테스트 규조류는 성장과 따개 비 nauplii의 생존을 위해 필수적으로 나타났습니다. 몇몇 규조류 종으로 적절 한 것을 먹이, 비록 작은 또는 독방 셀 (직경에서 10 μ m) nauplii의 섭취 할 수 있습니다. S. marinoi, C. 단순, T. pseudonana 종 모두 B. improvisus nauplii, 물론 육성 하기 쉬운 적절 한 피드 수를 입증 해야 합니다. 또한, 피드 품질은 기 하 급수적으로 성장 하는 조류에 대 한 일반적으로 더 높은. 그것은 또한 알려졌다 규조류 B. amphitrite15의 생산적인 문화 구축을 위한 필수적입니다. 규조류의 중요성의 이론은 그들은 독특한 지방산 프로필 있고 특히 높은 불포화 20:5 지방산29풍부 이다. 그것은 보였다 그 특정 지방산 굴 애벌레30의 성공적인 개발을 위해 중요 하다.
년 동안, 따개 비 문화에 해로운 질병의 아무 incidences 되었습니다. 굴과 홍합, 같은 많은 상업적인 무척 추 동물 강포한에서 질병 보다 일반적 이며 매우 해로울 수 있습니다. 바이러스의 해로운 효과 또한 강포한 인구에서 보고 되었습니다. 프랑스에서 네이티브 굴 포르투갈 굴 Crassostrea angulata 1925 년에 대체 되었다 그러나이 종 197031주위는 iridovirus에 의해 전 멸 했다. 더 최근에, 태평양 굴 Crassostrea giga 문화, 전세계에 ostreid herpesvirus 132연관 될 것으로 보인다에서 대규모 사망 이벤트 되었습니다. 병원 균, 박테리아, 또는 바이러스 barnacles에 보고 지금까지 출판 되었습니다. 그러나, B. improvisus에 지속적인 게놈 프로젝트, 바이러스 시퀀스에 발견 했다 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 하지만 질병의 증 후에 아무 명백한 링크와 함께. 항생제의 혼합물; 세균 감염의 위험을 최소화 하기 위해 문화에 적용 된 이전 그러나,이 절차는 현재 중단 하 고 지금까지,이 모든 오염 문제를 발생 했습니다.
해 수 (위에서 설명한)로 열을 하는 경우 과열 문화 생산 라인에서 가장 심각한 위험이 있을 수 있습니다. 그것은, 물론, 센서 및 적절 한 경고 시스템 사용 (예를 들어, 책임 있는 사람에 게 전자 메일 이나 텍스트 메시지를 보내는) 될 수 있지만, 과열에 대하여 보호 어렵다. 과거에 이런이 종류의 성인 문화에 상당한 살인에 이어지고 있다. 이 과정의 엄청난 하 고 시간과 비용의 장기 투자를 망칠 수 있습니다. 특히, 타고 난된 유전자 라인 설립 되었습니다 경우 치명적인 것입니다. 같은 라인의 장 수를 보장, 실수로 손실 로부터 그들을 보호 하는 barnacles cryopreservation 방법론을 개발 하는 것이 좋습니다 것입니다. 그것은 태평양 굴에서 애벌레 아래로 고정 하 고 부분적인 성공33으로 부활 수 있습니다 보고 되었습니다. Cryobanking 다양 한 종34의 유전 자원 보존에 유용한 도구가 되었습니다. B. amphitrite 에서 심지어 nauplii 냉동35, 생존을 위해 보고 하 고 냉동 다운 개인의 20% 성공적으로 cyprids36로 metamorphosed 발견 됐다. 그러나, 문화의 장기적인 지속 가능성에 대 한 동결을 적용 지금까지 채택 되지 않았습니다, 하지만이 실제로 선택 된 라인;의 유지 관리를 위해 필요한 것 이 강력한 해양 modelsystem에 B. improvisus 를 단단히 구축 하는 중요 한 단계 것입니다.
여기, 프로토콜 B. improvisus (즉, cirri, 소마, 및 벽난로)의 성인에서 다양 한 조직에의 해 부에 대 한 제시 했다. 그러나, 그것은 다른 조직 또한 추출 될 수 있다 강조 한다. 예를 들어, 막 베이스 종 Tetraclita japonica formosana 의 외부 및 내부 맨 틀 사이의 부드러운 조직 되어 신중 하 게 절연과 RNA 추출 및 유전자 식37의 RNA seq 분석에 사용. 여기에 설명 된 개요 최적화 된 추출 프로토콜 시작 물자의 최소한의 금액에서 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 제공 한다. 첫째, 균질 튜브에 직접 개별 애벌레의 컬렉션 1 개의 관에서 다른 쪽으로 전송 하는 동안 손실을 최소화합니다. 또한, 여러 가지 방법 중 테스트, RNA의 측면에서 가장 효율적인 얻을 것을 입증 하는 세라믹 구슬 및 무결성, 쥡니다 또는 유 봉 균질에 비해 균질. 유전자 발현 또는 게놈 실험 계획, 하나는 명심 barnacles에 높은 유전 변이의 도전 이상 B. improvisus에 대 한 있다. 따개 비 범위에서 3-5%, 지역 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 코딩에 유전적 다양성이 있다. 이것, 물론, 정량 분석에 대 한 프라이 머의 디자인에 특정 요구를 두고, 지역을 식별 및 사용 뇌관에 대 한 일관 된 식 결과 betweenbatches를 얻기 위하여 어디에 더 보존. 대상 유전자에 대 한 보존된 지역 처럼 aquaporins Na + K + ATPases, 개인의 수백을 포함 하는 cyprids의 인구에서 가져온 RNA-seq 데이터에서이 유전자의 순서 가변성을 공부 하 여 확인할 수 있습니다. 게놈 분석 DNA 샘플링 됩니다. 그러나, B. improvisus 에서 양질의 DNA를 얻는 전하실 수 있습니다21.
결론적으로, 설립된 따개 비 문화 다양 한 실험 연구에에서 도움이 될 입증 되었습니다. 특히, 모든 년 주위 애벌레 생산 수를 자연스럽 게 발생 산란 기간에 제한 되지 않고 실험을 실시 ( B. improvisus, 이것은 여름 동안). 취득된 애벌레는 실험 연구, 게놈 전체 transcriptome 연구 뿐만 아니라 정착 분석, 동작 분석, 특정 유전자에 대 한 표현 연구 등의 다양 한 세트를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 대부분 1, 200 종의 barnacles의 얕은 물에 서식 하 고 많은 종종 낮은 염 분에 노출 되는. 1 종, (B. improvisus), Balanus (Amphibalanus) improvises 베이 따개 비 거의 민물 용납 수 고 찰스 다윈 우루과이1리오 데 라 플라타의 강어귀에서 작은 개울에서이 종 설명. 극단적인 관용 tolow 염 분은 B. improvisus osmoregulatory 메커니즘2,3의 연구에 대 한 특히 적합 모델. 이 따개 비 소금기 조건을 선호 하지만 약 1.6 psu에서 salinities와 함께 바다에 살고 있는 수 40 psu4로 높은. 그것은 소금기 있는 발트 해에서 발견 하는 유일한 따개 비 종입니다. B. improvisus 은 미국 대륙의 동해에서 발생 한 것으로 생각 하지만 오늘 발견 된다 분산으로 인해 전세계 배송5. 그것 주요 오염 유기 체와 바위, jetties와 보트 선체에 일반적으로 발견 되 고 따라서 해양 고 소금기 있는 물6,7건축에 미생물 파울 링의 메커니즘을 이해 하기 위한 일반적인 관심의.
마찬가지로 다른 대부분 barnacles, B. improvisus 는 십자가;와 자웅 동체 복제는 길쭉한 성 기 및 내부 수정을 사용 하 여 인접 개인 사이 짝짓기를 통해 발생 합니다. 생식 기간은 주로 5 월에서 9 월입니다. B. improvisus 는 7 원양 애벌레 단계 (6 nauplii 한 cyprid 단계8다음). Nauplius 애벌레 free-swimming 이며 비 먹이 cyprid 유 충으로 탈피 하기 전에 몇 주까지 물 열에 피드로 수정 란 해치. cyprid 정착에 적합 한 사이트를 찾을 수 여러 단서를 사용 하 고 무 청소년 따개 비9로 변 태를 겪 습. 종은 실험실에서 경작 될 수 있으며 바다 (실험실 문화에서 2-3 년)에 1-2 년의 수명이 있다. 평균, B. improvisus (최대 약 20 m m)로 지름 10 m m를 성장 하 고 (비록 그것은 붐비는 조건 하에서 키가 성장할 수 있는) 약 6 mm의 최대 높이 도달. 종 수 쉘 접시의 방사형 패턴된 석탄 기지와 tergal 접시1,10의 모양 부드러운 석도 껍질 (흰색 또는 회색 빛이 나)으로 식별.
따개 비 B. improvisus 를 위한 osmoregulation, 분자 및 생리 적 메커니즘 뿐 아니라 생태 상호 작용 및 진화 결과에 초점을 맞춘 연구 모델로 여러 유리한 특징 있다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구과 메커니즘 관련된7,11,,1213특히 생물학, 정착의 조사에 대 한 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 1 년 내내 그것의 전체 수명 주기를 통해이 따개 비를 문화 능력은, 그러므로, 분자와 기계 론 적인 연구의 다양 한 형식을 사용할 수 있도록 하는 주요 자산. 또한, 전세계 해양/소금기 있는 바닷물의 존재 필드와 실험 연구의 조합 수 있습니다. 제어 번 식도 장기 자란14, 알려진된 혈통의 가족을 만들 수 있습니다 그리고 몇 개월의 세대 시간 장기 실험적인 발전을 허용할 수 있습니다. 또한 있다 초안 게놈 및 여러 transcriptomes 사용할 수 있는, 그리고 이러한 리소스 여러 유전자 (예를들면, osmoregulation에 있는 중요성의 유전자)2,3의 복제에 대 한 사용 되었습니다.
이 프로토콜의 목표 고 성인 또는 애벌레의이 유기 체에 유전자 표현 연구를 수행 하기 위해 연중 따개 비 B. improvisus 의 문화를 유지 하는 방법을 설명 하는 것입니다. Rittschof 외. 15 는 짧게 barnacles nauplii의 출시에서 Balanus amphitrite종족에 대 한 cyprids의 타협을 경작 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 B. improvisus Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 적응 되었습니다 및 생산 라인의 모든 단계에 대 한 자세한 설명이 나와 있는, 따개 비의 양육 및 생산을 포함 하 여 애벌레, 뿐만 아니라 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리. 완전 한 절차의 개요 그림 1을 참조 하십시오. 자란 시스템을 사용 하 여 몇 가지 일반적인 실험 설정 함께 exemplified 이며 나+의 기능 유전체학 연구에 /K+ ATPase 그리고 aquaporins elucidating osmoregulation2, 그들의 가능한 기능 3. 그것은 때로는 필수적인 특정 조직에서 유전자 발현을 검토 하 고 따개 비 해 부의 기초의 일부 적용 됩니다. 높은-품질 바닷물의 좋은 공급, B. improvisus, 따개 비 그리고 다른 잠재적으로 많은 종의 경작 가능 해야 세계 해양 연구소.

<table><tbody><tr><td>Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels</td><td>Plastic produkter, Bromma, Sweden</td><td></td><td>transparent glas</td></tr><tr><td>1.5 L PET bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, Belgium</td><td></td><td>We have tested different companies; this is really the best one</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Skeletonema marinoi&lt;/em&gt; (CCAP strain 1077/5)</td><td>CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&amp;nbsp;</td><td>strain 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chaetoceros simplex&lt;/em&gt; var. &lt;em&gt;gracilis&lt;/em&gt; (CCAP strain 1085/3)</td><td>CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland&amp;nbsp;</td><td>strain 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Millipore cartridge filter system</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartridge with a nominal pore size of 0.2 &amp;micro;m</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>cartridge CWSS01S03</td><td>High capacity for large volumes</td></tr><tr><td>polycarbonate bottle</td><td>Nalgene</td><td></td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>RNA later</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&amp;nbsp;Fixation solution to preserve RNA</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AM1907</td><td>DNAse kit to remove DNA from prepared RNA</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>cDNA synthesis kit</td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye for QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA extraction of adults or many cyprids</td></tr><tr><td>Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Ceramic beads for homogenisation</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA extraction of few cyprids</td></tr></tbody></table>

the barnacle balanus improvisus as a marine model - culturing and gene expression

Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 따개 비 Balanus (Amphibalanus) improvisus 낮은 염 분에 극단적인 관용 때문에 특히 관련 osmoregulatory 메커니즘의 연구에 대 한 모델 이다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구에 관하여 특히 생물학, 정착의 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 프로토콜 개발 되었습니다 B. improvisus 의 모든 연중 재배 및 모든 상세한 설명 단계 생산 라인에 대 한 설명입니다 (즉, 패널, 컬렉션의 양육에 성인 문화의 설립 따개 비 애벌레, 그리고 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리). 설명 또한 문제 해결에 제공 하 고 중요 한 매개 변수 (예를 들어, 오염 제거, 양질의 사료 생산, 필요한 인력 및 높은-품질 바닷물의 중요성)에 대해 설명 합니다. 자란 시스템에서 각 일괄 처리 극대로 대략 12000 nauplii 있고 주 당 거의 50000 애벌레까지 생성 될 수 있다 그래서 일주일에 4 개의 일괄 처리를 제공할 수 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 방법, 아마, 대부분은 또한 무료 swimminglarvae와 다른 해양 무척 추 동물에 적용입니다. 프로토콜은 다양 한 조직의 해 부에 대 한 유전자 발현에 대 한 연구에 대 한 높은-품질 RNA의 생산 뿐만 아니라 성인에서 되 게 됩니다. 그것은 또한 설명된 어떻게 교양된 성인 그리고 reared cyprids 다양 한 외부 요인에 관하여 유전자 발현을 조사 하기 위한 실험 설계에에서 이용 될 수 있다. 유전자 발현에서 교양된 barnacles의 사용은 나+의 가능한 osmoregulatory 역할의 연구와 함께 삽화가 /K+ ATPase 그리고 aquaporins.

B. improvisus의 성인 barnacles의 경작에 대 한 설명 절차 nauplius의 4 개의 일괄까지 애벌레 생산 수 있습니다 주당. 그것은 거의 매일 밤 nauplius 애벌레를 수집 가능한 것 하지만이 더 많은 사람과 인프라 필요 (는 broodstock에 많은 barnacles, 문화 것입니다 릴리스 애벌레 지속적으로). 애벌레 생산에 대 한 추가 제한 요소가 특히 규조류 Skeletonema에 관한 높은 품질의 공급 여부를 것 처럼 보인다. 극대, 자란 시스템에서 각 일괄 처리 약 12000 nauplii, 주 당 50000 nauplii까지 경작 될 수 있도록 구성 되어 있습니다. 그러나, 몇 주 수 있습니다 생산 10 배 적은 애벌레까지. 단일 성인 하루14, 1-2 성인 애벌레 각 일괄 처리에 대 한 발표는 즉 당 최대 7000 애벌레를 생성할 수 있습니다. 일주일, 내 수집된 nauplii의 약 70-90% 정착 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있는 cyprids (극대로 대략 30000 cyprids / 주, 저조한)으로 개발할 것입니다.
그것은 배치, 사이 cyprid 기능에 변화가 있다는 것을 강조 했다 한다 그리고 일반적으로, 더 큰 변이 사이 일괄 처리 내에서 일괄 처리 보다 있다. 예를 들어 정착 성공 정착 분석 실험에서 30와 다른 일괄 처리에 대 한 70% 사이 다릅니다. 대부분, 이것은 다른 샘플링 기간 동안 애벌레를 방출 하는 성인의 특정 쌍 사이의 개별 유전자 변이 의해 발생 합니다. 그것은, 물론, 반복된 실험 (생물 복제) 결과 대 한 보다 일반적인 진술을 만들 수 있다면 다양 한 일괄 처리에서에서 cyprids를 포함 해야 것이 좋습니다. 일괄 배치 변화 적절 한 컨트롤과 유전자 표현 연구에 정규화를 적용 한다 실험적인 디자인에 요구를 넣습니다. 그러나, 몇 가지 통계 표준화 절차 구현 된 후에는 상당히 배치 사이 변이 감소, 일괄 처리의 일부 효과 일반적으로 여전히 명백한 (되지 않은 데이터).
제공 된 프로토콜에 따라 그것은, 평균, 500을 얻을 수 따개 비 (표 1)의 단계에 관계 없이 작은 20 cyprids에서 높은-품질 RNA의 ng. RNA의 품질은 일반적으로 (두 봉우리의 예상된 위치는 그림 4에 표시 된) 18와 28S 봉우리 사이의 비로 측정 됩니다. 그러나, barnacles 및 다른 많은 절지동물, 28S rRNA (분석 방법의 일환)으로 열 하면 분해 하 고 18 피크20함께 마이그레이션합니다. 이 때문에 거기에, 원칙, 하나 하나의 rRNA 피크 barnacles에 대 한 분석의이 종류에서. 이 테스트 (그림 4) 세라믹 구슬에 의해 균질 높은 무결성으로 RNA를 제공 하 고는, 따라서, 방법의 선택에서에서 분명 하다. RNA 샘플 (읽기, 수가,는 시퀀싱 하는 동안 멀티플렉싱의 수준에 따라) 당 70 백만 읽기의 평균 발생 금액 및 시퀀싱에 대 한 높은-품질 시퀀싱 라이브러리를 생성 하는 품질에 충분 하다. RNA의 금액 또한 많은 유전자의 cDNA 합성 및 정량 식 분석을 위해 충분 하다.
그림 5 에서는 aquaporins 나+의 정량 분석에서 결과 /K+ ATPase (NAK1) 결합 이체, 식 변화 변화 환경 단서2,3에 대 한 응답에서 조사 되었다. 긴 및 짧은 상대 식의 비교는 두 가지 짧은 NAK (그림 5A)에 관하여 낮은 염 분에 긴 NAK1 mRNA에 대 한 증가 하는 NAK1 쇼의 변종 결합. 따라서, 데이터 대체 접합는 긴 양식 낮은 염 분 조건에서 우위를 나타냅니다. Aquaporins, 경우 그것은 명백한 두 물 수송 paralogs AQP1 및 AQP2 차동 식 (그림 5B) 표시. 특히, 맨 틀 직물에서 그것은 명백한는 AQP1는 실질적으로 다운 낮은 salinities에 통제는 AQP2에 나타나지 않습니다. 대신, AQP2는 낮은 salinities, 그러나 soma에 약간 증가 식을 보여 줍니다. 이러한 결과 다른의 기능 역할의 조사에 대 한 기반을 제공 B. improvisus 이온 운송업 자 및 aquaporins 따개 비 osmoregulation에.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> 그림 1 : 전체 절차 및 성인 유전자 표현 연구에 대 한 RNA 추출 배양의 개요. 시작 하려면 새로운 문화, 위원회는 프레임에 연결 하 고 1-3 m 깊이에서 바다에 배포. 몇 주 후, 성인/청소년 패널 실험실에 쟁반에서 선반에 수직으로 배치 됩니다. 각 트레이 성인 약 40 패널을 보유 하고있다. 패널 당 약 100 성인, 총 ≈에 4000 성인 개인은 트레이 당 경작. 성인 barnacles Artemia 를 품고 고 지켜질 수 년-주위. Nauplius 애벌레는은 쟁반 을 통해 체질 필터링에서 일주일에 여러 번 수집. 수집 된 nauplii 양동이 물 욕조에 26 ° C에서 보관 하 고 먹이 microalgae로 전송 됩니다. 그들이 먹이 비 cyprids, 필터링 의해 수집으로 털 갈이 때까지 nauplii reared 있습니다. 새로운 패널의 정착 cyprids 패널, 중 년에 대 한 새로운 패널을 제공 하 여 실험실에서 설정할 수 있습니다-주변 문화 또는 변경 된 외부 조건 특정 실험 설정에 대 한 사용 될. RNA는 청소년/성인 실험의 끝에 또는 특정 시간 시점에서 다음 추출 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> 그림 2 : 이미지의 자란 절차에서 몇 가지 중요 한 단계. (A)이이 이미지 패널 분야에서 새로운 인구를 수집 하기 위한 프레임을 보여 줍니다. (B)이이 이미지 랙 트레이에 배치 됩니다에 B. improvisus 의 성인 barnacles와 패널을 보여 줍니다. 패널 약 2 cm 떨어져 배치 됩니다. (C)이이 이미지 패널과 왼쪽 먹이 탱크는 따개 비와 쟁반을 보여 줍니다. 각 트레이 체 nauplius 애벌레의 컬렉션에 대 한 배치는 콘센트가입니다. (D)이이 이미지 Artemia 생산 피드 성인 barnacles를 보여줍니다. (E)이 화면은 nauplii에 26 ° c 설정 물 욕조에 배치 하는 양동이의 양육 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> 그림 3 : 성인 barnacles의 해 부에 초기 단계의 설명: 그것의 포탄에서 시체를 제거. 부드럽게 조리개를 통해 포 셉을 삽입 하 여 opercular 접시 중 하나는 (A) 잡아. 접시를 제거 하 고 동물을 노출 부드럽게 당겨. (B) 바로 아래는 cirri 소마 부분을 잡아서 동물 밖으로 당겨. (C)이이 패널 도토리 barnacles의 전반적인 구조를 보여 줍니다. 시체를 꺼내은 맨 틀 및 (난소)에서 잠재적으로 수정된 계란 포탄 구멍에 있어. 따개 비 해부학에 대 한 참고 (자세한 계정 참조 앤더슨)9: 벽 격판덮개는 따개 비의 안쪽, 경사와 함께, 그들은 형성 한다 화산 모양의 원추형. 개방, 조리개, 문, 또는 operculum, 조리개를 형성 두 opercular 판으로 덮여 있다. 도토리 barnacles 일반적으로 있다 층;에 단단히 붙어 석 기저 판 그러나, 일부 종의 barnacles이 석 플레이트 (예를 들면, S. balanoides) 부족합니다. Barnacles 음울 안료 맨 틀 (등 딱지)에서 외 골격을 분 비. 두 계층 맨 틀의 외부 표면은 석 회 질 맨 틀의 안쪽 표면은 하지 석 회화 되며 따라서 유연 하면서 엄격한 될. 조리개, 내부는 cirri은 끌어 넣어진된 위치에 존재 한다. 이들은 흉부 부속 barnacles 정지 먹이 기를 위해 사용 하는. 난소는 testes soma에 거짓말을 하는 동안에 따개 비의 기지에 가깝습니다. 이 수치는 Panova 그 외 여러분 에서 채택 되었습니다. 21 스프링 거에서 허가 함께 게시 되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> 그림 4 : 모 세관 젤 전기 이동 법에 의해 rRNA 무결성의 결정. RNA는 두 개의 서로 다른 균질 화 방법에 의해 준비 되었다: (A) 쥡니다 및 (B) 세라믹 구슬. 푸, y 축에 단위 형광 단위를 의미합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> 그림 5 : 유전자 발현에서 osmoregulation에 대 한 중요 한 유전자의 2 개의 다른 연구에서 결과 B. improvisus. (A)이이 패널 표시 차동 식 나+의 결합 이체의 정량에 의해 측정으로 /K+ ATPase NAK1 다양 한 salinities 및 pCO2 레벨3. 낮은 염 분 치료에 긴 isoform (NAK1 L)의 식 짧은 상대적인 증가 (ANOVA, P < 0.001). (B)이이 패널 B. improvisus 의 성인 다양 한 salinities2에 그들의 노출 동안 aquaporins의 식을 보여줍니다. 정량은 말라 상대적인 aquaporin 식 수준을 결정 하 사용 되었다. 성인 개인 14 일 동안 3 다른 salinities (3, 20, 및 33 PSU)에서 인 큐베이 팅 했다. RNA 준비에 대 한 소마, cirri, 및 성인의 분리 되었다. 두 인물에서 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. * *과 * * * 표시 레벨의 중요성 (ANOVA), 0.01, 0.001, 각각. 이러한 수치 린드 외 에서 수정 된 2 , 3. 두 인물 PLoS 하나에서 허가 함께 게시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>정착 단계</td>
			<td>RNA (ng)의 총 금액</td>
		</tr>
<tr>
<td>자유 수영</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>탐색: 주변 검색</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>연결 된 cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>새로 metamorphosed 청소년</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: RNA의 생산량. 이 표에서 RNA 준비 키트 20 cyprid 개인 합의 과정 중 여러 단계에서 수집 된의 풀에서 추출한 RNA 수량을 보여줍니다.

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

14.6K 조회수.  University of Gothenburg. 따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

연구

발생학

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

유전학

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindication 영 민물 진주 홍합에 현장 노출 방법을 사용 하 여에 대 한 스트림 환경 적합성의 테스트

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

환경과학

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

제자리에서 파라핀 포함 성인 산호 샘플에 대 한 교 잡 기술

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Design and Use of an Apparatus for Quantifying Bivalve Suspension Feeding at Sea

As shellfish aquaculture moves from coastal embayments and estuaries to offshore locations, the need to quantify ecosystem interactions of farmed bivalves (i.e., mussels, oysters, and clams) presents new challenges. Quantitative data on the feeding behavior of suspension-feeding mollusks is necessary to determine important ecosystem interactions of offshore shellfish farms, including their carrying capacity, the competition with the zooplankton community, the availability of trophic resources at different depths, and the deposition to the benthos. The biodeposition method is used to quantify feeding variables in suspension-feeding bivalves in a natural setting and represents a more realistic proxy than laboratory experiments. This method, however, relies upon a stable platform to satisfy the requirements that water flow rates supplied to the shellfish remain constant and the bivalves are undisturbed. A flow-through device and process for using the biodeposition method to quantify the feeding of bivalve mollusks were modified from a land-based format for shipboard use by building a two-dimensional gimbal table around the device. Planimeter data reveal a minimal pitch and yaw of the chambers containing the test shellfish despite boat motion, the flow rates within the chambers remain constant, and operators are able to collect the biodeposits (feces and pseudofeces) with sufficient consistency to obtain accurate measurements of the bivalve clearance, filtration, selection, ingestion, rejection, and absorption at offshore shellfish aquaculture sites.

A flow-through device for using the biodeposition method to quantify filtration and feeding behavior of bivalve mollusks was modified for shipboard use. A two-dimensional gimbal table built around the device isolates the apparatus from boat motion, thereby allowing the accurate quantification of bivalve filtration variables at offshore shellfish aquaculture sites.

디자인 및 쌍 각 조개 서 스 펜 션 바다에서 먹이 측정 기구 사용

As shellfish aquaculture moves from coastal embayments and estuaries to offshore locations, the need to quantify ecosystem interactions of farmed bivalves ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

생물학

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

면역학 및 감염병학

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a promising model organism for laboratory studies of development, providing a useful outgroup comparison to the well studied arthropod model organism Drosophila melanogaster. In contrast to the syncytial cleavages of Drosophila, the early cleavages of Parhyale are holoblastic. Fate mapping using tracer dyes injected into early blastomeres have shown that all three germ layers and the germ line are established by the eight-cell stage. At this stage, three blastomeres are fated to give rise to the ectoderm, three are fated to give rise to the mesoderm, and the remaining two blastomeres are the precursors of the endoderm and germ line respectively. However, blastomere ablation experiments have shown that Parhyale embryos also possess significant regulatory capabilities, such that the fates of blastomeres ablated at the eight-cell stage can be taken over by the descendants of some of the remaining blastomeres. Blastomere ablation has previously been described by one of two methods: injection and subsequent activation of phototoxic dyes or manual ablation. However, photoablation kills blastomeres but does not remove the dead cell body from the embryo. Complete physical removal of specific blastomeres may therefore be a preferred method of ablation for some applications. Here we present a protocol for manual removal of single blastomeres from the eight-cell stage of Parhyale embryos, illustrating the instruments and manual procedures necessary for complete removal of the cell body while keeping the remaining blastomeres alive and intact. This protocol can be applied to any Parhyale cell at the eight-cell stage, or to blastomeres of other early cleavage stages. In addition, in principle this protocol could be applicable to early cleavage stage embryos of other holoblastically cleaving marine invertebrates.

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a promising model organism for studies of crustacean embryology and comparative arthropod development and evolution. This protocol describes a method for manual removal of single blastomeres from early cleavage stage embryos of Parhyale.

Amphipod 갑각류의 여덟 세포 배아에서 단일 셀의 절제<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

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