이 연구는 선충에서 개발 권리의 분석과 같은 생체 화학 수 및 방법론 분야에서 어떤 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 벌레의 외과 및 음료 및 균질화의 단백질 강수량입니다. 하룻밤 사이에 37°C에서 LB 국물 액체 배지의 300 밀리리터에서 E.coli OP50 균주를 성장시킴으로써이 실험을 시작합니다.
성공적인 OP50을 섭씨 4도에 저장합니다. 이전에 준비된 최소 3개의 NGM 또는 선충 성장 미디어 아가 플레이트에 배양된 OP50의 파이펫 2밀리리터가 플레이트를 손으로 소용돌이치게 한다. 밤새 실온에서 플레이트를 배양하여 OP50의 얇은 층을 만듭니다.
다음으로, 멸균 이쑤시개를 사용하여 벌레가 있는 접시에서 한 조각을 고르고 각 OP50 NGM 플레이트에 최소 100개의 웜을 추가합니다. 벌레가 입체 현미경으로 확인되는 성인 단계에 도달할 때까지 20°C에서 벌레가 있는 적어도 3개의 판을 배양합니다. 입체 현미경을 사용하여 계란으로 채워진 중력 헤르마프로디트를 찾습니다.
플레이트에 5밀리리터의 S 버퍼를 추가한 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 3개의 플레이트에서 15밀리리터 원컬튜브로 웜을 전송합니다. S 버퍼 15 밀리리터를 추가한 다음 실온에서 300배 G에서 30초 동안 원심분리를 하여 웜을 세 번 세척합니다. S 버퍼의 부피가 5밀리리터를 초과하는 경우 원심 분리 후 초과 버퍼를 제거합니다.
성공적인 엑소시화 및 대량 계란 절연을 위해, 알칼리성 hypo 염소염용 0.5 밀리리터에 벌레를 녹입니다. 반역하여 10-15분 동안 실온에서 배양합니다. 1, 400 RPM에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 용액을 제거합니다.
계란 펠릿을 세척하기 위해 S 버퍼 15 밀리리터를 사용합니다. 원심 분리 후 상체를 제거하고 이 세척을 적어도 세 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 우리는 대장균없이 S 버퍼의 5 ~ 6 밀리리터에 펠릿을 중단하고 그들을 부화하고 L1 단계 애벌레의 H 동기 문화를 달성하기 위해 섭씨 20도에서 밤새 계란을 배양.
3개의 커버 슬립에 L1 웜을 함유한 S 버퍼의 파이펫 10 마이크로리터. 입체 현미경으로 애벌레를 계산하고 L1 단계 애벌레의 대략적인 수를 결정하기 위해 평균을 계산합니다. 마지막으로, L1 단계 애벌레를 OP50로 NGM 아가 플레이트 5개에 옮기고, 자가 수정이 발생하고 계란 몇 개가 놓인 젊은 성인 단계까지 섭씨 20도에서 재배합니다.
현미경의 밑에 매일 벌레를 관찰하고 젊은 성인, 또는 5 일 오래된 벌레를 수집합니다. 살아있는 벌레만 선택하려면 S 버퍼의 3~4밀리리터에 매달린 웜을 15밀리리터 원컬 튜브에 추가합니다. 그런 다음 얼음 차가운 60 % 자당과 혼합의 동일한 볼륨을 추가합니다.
15초 동안 4도에서 1, 500배 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫을 사용하여 벌레를 조심스럽게 튜브 벽에서 옮은 다음 부동 벌레를 신선한 튜브로 제거합니다. 튜브를 S 버퍼로 채우고 벌레를 씻고 원심분리기는 섭씨 4도에서 1500배G로 30초 간 세척합니다.
버퍼를 제거하고 세척을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척 후, 조심스럽게 어떤 벌레를 제거하지 않도록, 슈퍼 나탄을 제거하고, 세척 된 벌레의 젖은 볼륨을 측정하기 위해 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용합니다. 단백질 강수량의 경우 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세척된 웜을 얼음 위에 놓는 균질화균제에 얼음냉이 10%트리클로로아세트산을 동일한 부피에 추가합니다.
최대 1, 300 RPM의 회전패스 40스트로크를 사용하여 균질화합니다. 20%의 듀티 사이클이 있는 초음파 균질화제를 사용하여 균질화를 초음파처리합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 동형균을 얼음 위에 놓인 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.
균동화를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후, 원심분리기는 섭씨 4도에서 8, 000시간 G에서 10분 동안 이를 명확히 한다. 상체를 신선한 튜브로 옮기고 4개의 어금니 칼륨을 넣고 얼음에 20분 간 배양하여 중화합니다. 그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 8, 000 배 G에서 10 분 동안 분리합니다.
상체를 신선한 튜브로 옮기고 추가 시도에 필요할 때까지 섭씨 80도에 보관하십시오. 젖산의 농도를 측정하려면 색분석 키트를 사용하여 테스트 샘플에 대한 중복 분석을 수행하십시오. 96웰 플레이트의 각 웰에 테스트 샘플 10마이크로리터를 추가한 다음 각 샘플에 젖산 분석 버퍼를 추가하여 15마이크로리터로 볼륨을 조정합니다.
젖산 분석 버퍼로 100 밀리머 L+락테이트 스탠다드를 1밀리머로 희석합니다. 그런 다음 일련의 우물에 희석 된 L + 락테이트 표준의 0, 2, 4, 6, 8 및 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 각 웰에 50 마이크로리터의 반응 믹스를 추가하고, 색상이 발달하기 위해 적어도 30 분 동안 빛으로부터 보호 되는 실온에서 배양하십시오.
마지막으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 570 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 반응 믹스의 흡광도로부터 배경 제어 믹스의 흡광도를 빼는다. 그런 다음 젖산 표준 곡선을 플롯하고 각 농도를 2.25로 곱하여 곡선으로부터 젖산 농도를 계산합니다.
컬러메트릭 분석 키트를 사용하여 시험 샘플에서 피루바테의 농도를 측정하고 이중 검사를 수행합니다. 96웰 플레이트의 다른 우물에 테스트 샘플 10마이크로리터를 추가하고 각 샘플에 90 마이크로리터의 작업 시약을 추가합니다. 실내 온도에서 30 분 동안 덮여 인큐베이션.
그런 다음 570 나노미터에서 각 웰의 흡수도를 측정하기 위해 마이크로 플레이트 판독기에 플레이트를 배치합니다. 피루바테 표준 곡선을 플롯하고 각 농도를 2.25로 곱하여 표준 곡선으로부터 피루바테 농도를 계산합니다. 그리고 마지막으로, 시험 샘플에서 단백질 농도를 측정하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 색분석 키트를 사용한다.
단백질 강수량 후, 착색 분석은 젖산 및 피루바테 농도의 정량적 결정에 사용될 수 있다. 이 실험은 C.Elegans의 이전 보고서와 는 반대로 색분석 분석의 정확성을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 소하는 짧은 기간에 작은 규모의 샘플에서도 젖산 및 피루바테 농도를 측정하기에 충분히 민감하다.
C.elegans에서 젖산과 피루바테를 정확하게 검출하려면 벌레의 균질화 시 단백질 강수량을 수행하는 것이 중요합니다. 검출된 젖산과 피루바테의 양은 균질화 시 단백질이 침전될 때, 손상되지 않은 세포균 분획또는 균질화 후와 비교하여 젖산이나 피루바테가 전혀 검출되지 않은 경우 더 높다.
