Name: computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton at JoVE.com

우리는 그들의 기술 지원에 대 한 모나 쉬 Microimaging 감사합니다. 일부 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 작품 모나 쉬 대학 의학 발견 친목, NHMRC 프로젝트 그랜트 (GNT1105374), NHMRC 수석 연구 친교 (GNT1137645)와 veski 혁신 친교에 의해 지원 되었다: 로저 Pocock VIF 23.

1. 준비 및 웜 농업
참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.</li>
	<li>선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl2, 에탄올, 1 M MgSO4 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO4 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.</li>
	<li>시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어<ol>
<li>성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.</li>
</ol>2. 생식 해 부와 얼룩6,13
<ol><li>10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.</li>
	<li>(5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다. 주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다.</li>
	<li>폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO4, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.</li>
	<li>1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.</li>
	<li>차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조2O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.</li>
	<li>REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.</li>
	<li>30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.</li>
	<li>고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m2 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.</li>
</ol>3. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.</li>
	<li>0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.</li>
</ol>4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포
참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.</li>
	<li>소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.</li>
	<li>만들기 화면을 클릭 합니다. 참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다.</li>
	<li>DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다. 참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다.</li>
	<li>최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상
<ol><li>관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여. 참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다.</li>
	<li>Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상
<ol><li>생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다. 참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.</li>
	<li>분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+a+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress.">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).</li><li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+control+of+germline+development.">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li><li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. 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R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLD-1,+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation,+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development.">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li><li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development.">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li><li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans.">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li><li>Berry, L. 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M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li><li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction.">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li><li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li><li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S6K+links+cell+fate,+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li><li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes.">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).</li></ol>

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이...

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.
핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.
1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵12보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; strains: wild type (N2, Bristol), &lt;em&gt;rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; bacteria</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM) plates</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyclonal rabbit anti-REC-8&amp;nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 conjugated antibody raised in goat</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Cytoskeletal dye phalloidin&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES buffer, pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% Paraformaldehyde solution</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield fixing reagent&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;deg;C &amp;amp; 25&amp;deg;CIncubator&amp;nbsp;</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Any brand (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho buffered saline, pH 7.4</td><td>Homemade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Tekdon&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

computational analysis of the caenorhabditis elegans germline to study the distribution of nuclei, proteins, and the cytoskeleton

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조?...

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

6.2K 조회수.  Monash University. 우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

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The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

연구

발생학

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

유전학

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

생물학

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

의 자동 분석<em&gt; C. 엘레</emCeleST 소프트웨어를 사용&gt; 수영 동작

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

신경과학

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

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