이 방법은 마우스에서 빠른 생체 내 스크리닝을 허용하고, 변형유전자의 효과, 특히 기능 연구의 이득 또는 손실을 수행하기 위해 특별히 적응, 뿐만 아니라 대답과 DNA 동기 매핑. 이 기술의 주요 장점은, 형질 전환 동물의 예측 사용이 신생아의 70 % 이상이며 형질 전환 동물을 포함한 모든 마우스 균주에 적용 될 수 있다는 것입니다. 마우스를 안락사한 후, 배관을 수집합니다.
수술을 시작하려면 가위를 사용하여 복강으로 큰 수평 절개를 하십시오. 그런 다음 자궁과 난소 사이의 oviduct를 찾습니다. 다음으로, 구부러진 집게를 사용하여 저명한 혈관을 가진 심술과 막을 제거하십시오.
그런 다음 난소에서 oviduct를 분리하고 난소에서 oviduct를 해부합니다. 그런 다음, oviduct에 잡아 당기고 자궁에서 잘라. 수집된 모든 oviducts를 실온에서 M2 배지로 전송합니다.
oviducts를 취급할 때, 기름지게 한 계란으로 가득 찬 부은 암풀라를 만지지 않도록 주의하십시오. 다음으로 10cm 접시에 히알루로니다제 작동 용액 100 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 그런 다음 두 개의 배관을 전달하여 계란에서 적수 세포를 제거합니다.
스테레오 현미경으로, 암풀라를 찢고 수정란을 분산하는 동안 oviduct를 확보하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 그런 다음 튜빙과 마우스피스가 있는 준비된 유리 파이펫을 사용하여 모든 계란을 흡입합니다. 이 도구를 사용하여, 주변 적혈구세포를 씻어 M2 배지의 6 방울 사이에 전송.
그런 다음, 씻은 계란을 M16로 예열 된 4 개의 우물 접시에 10 밀리미터로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 접시를 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터로 옮기습니다. 준비과정에서, 제조된 렌티바이러스 벡터 서스펜션을 2분 동안 160g에서 원심분리하여 렌티바이러스 스톡에 종종 존재하는 잔해를 펠렛한다.
클래스 2 안전 캐비닛에서, 새로운 0.5 밀리리터 튜브에 슈퍼 네이티퍼를 전송합니다. 다음으로, 1개의 마이크로리터의 상피리터를 주입 파이펫에 넣습니다. 그런 다음, 사출 파이펫을 오른쪽 미세 조작기에 부착합니다.
그리고 좌측 마이크로 조작기에 홀딩 파이펫을 부착합니다. 지금, 우울증 슬라이드의 중심에 M2 배지의 8 마이크로 리터를 분배. 그리고 증발을 피하기 위해 가벼운 파라핀 오일로 덮습니다.
그런 다음 거품을 만들지 않고 20 개의 계란을 방울의 얕은 위치에 놓습니다. 다음으로, 사출 파이펫의 끝이 열려 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그것을 열 지 주 파이펫주사 파이펫을 누릅니다.
그런 다음 20 초 주사에 대한 마이크로 인젝터를 설정합니다. 이제, 지주 파이펫과 수동 압력을 사용하여 두 개의 프로핵과 두 개의 극성 몸을 포함하는 수정란을 흡습합니다. 이어서, 주사 피펫을 사용하여 계란의 계각 공간을 주입한다.
플라즈마 멤브레인을 만지지 마십시오. 인식 공간이 용액으로 채워지되도록 압력을 조정합니다. 압력은 600 헤토 파스칼을 초과해서는 안됩니다.
20개의 계란을 주입한 직후, 예열된 M16 배지의 목욕으로 배치를 옮기. 그리고 이식하기 전에 적어도 30 분 동안 배양하십시오. 16 정절과 남성에 일반 여성을 짝짓기 후, 교합 플러그를 확인합니다.
이식을 위해 이 암컷을 사용하십시오. 다음으로, 약 150 미크론의 내부 직경이식 파이펫을 확인합니다. 그리고 약 4 ~ 5 밀리미터 길이의 불꽃 광택 팁.
배아 테스트, 가벼운 파라핀 오일을 어깨 지점 바로 위에 로드합니다. 그런 다음, 작은 기포를 흡인하고 M2 매체로 파이펫을 추가로 적재한다. 다음으로, 두 번째 기포를 흡인.
지금, 배아를 다른 뒤에 파이펫으로 그려 배아 사이 매체의 양을 최소화합니다. 마무리, 파라핀 오일의 매우 작은 방울을 흡입하여 단지 하나의 배아 폭. 재이식 파이펫의 준비는 핵심이며 많은 연습이 필요합니다.
파이펫에 있는 계란은 그들 사이에 있는 실질적으로 어떤 매체와도 정렬되어야 합니다. 다음으로, 마우스를 마취하고 발가락 핀치로 마취를 확인한 후 마지막 갈비뼈 수준에서 척수를 따라 두 센티미터의 머리카락을 면도합니다. 이제, 멸균 필드에 가열 패드에 마우스를 놓고 노출 된 피부에 창을 떠나, 그것을 드레이프.
다음으로, 이오도프로비돈의 번갈아 스크럽과 70%의 에탄올로 노출된 피부를 살균합니다. 이식의 경우 먼저 1센티미터의 횡반 절개를 한 다음 주황색 난소가 바디 벽을 통해 볼 때까지 피부를 측면으로 밀어 내십시오. 다음으로, 미세 한 가위로 5 밀리미터 절개를하고 외상성 불독 클램프로 지방 패드를 집어 들십시오.
패드가 잡히면 난소, oviduct 및 자궁 상단을 당깁니다. 다음으로, 암풀라를 찾아 난소와 암풀라를 연결하는 oviduct 세그먼트에 반나스 가위를 가진 중간 을 만듭니다. 그런 다음, 전달 배아 파이펫을 소개하고 계란을 배출한다.
계란이 방출 된 후 첫 번째 기포에서 중지합니다. 두 번째 oviduct에 절차를 반복하기 위해 필요한 재료를 준비해야합니다. 그리고 완료되면 상처 클립으로 피부를 닫습니다.
피부를 닫은 직후, 복막증을 주입하고 39섭씨 가열 요소로 동물을 회복실에 놓습니다. 완전히 깨어날 때까지 모니터링합니다. 형질전환동물은 제시된 방법을 사용하여 생성되었다.
높은 티터 렌티바이러스 벡터는 eGFP를 구동하는 Neurogenin-3에 대한 2.3 킬로 베이스 증강을 사용하여 생산되었다. 또는 대조군으로서, eGFP를 구동하기 위해 염색체 6의 조각. 배아에 대한 통합은 상당히 성공적이었습니다.
배아에서 췌장 싹은 eGFP의 국소적 발현을 찾기 위해 단면화되고 면역 염색되었다. 뉴로인-3 증강제와 벡터의 90% 이상, Neurog3 발현 세포에 eGFP를 표현했다. 그러나, 췌장 싹에서 eGFP를 발현하는 통합 제어 벡터는 없다.
트랜스진 통합 부위는 CDX2 유전자를 대조군으로 사용하여 정량적 PCR에 의해 평가되었다. 통합 부위의 평균 수는 Neurogenin-3 구조를 사용하여 약 20개, 또는 대조군 구조를 이용하여 10개였다. 호기심, Neurogenin-3 구조에 사용되는 바이러스 성 트랜스유도 티터는 대조군 벡터의 약 2배였다.
변환 티터와 통합 수 사이의 관계를 제안합니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 높은 효능을 가진 렌즈 바이러스 벡터의 인식 주입을 사용하여 설립자 형질 성 배아의 큰 숫자를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 일단 마스터되면,이 기술은 제대로 수행되는 경우, 미세 주입의 하루 이내에 최대 50 설립자 동물을 생산할 수 있습니다.
이 절차에 따라, titer 프로핵 DNA 주입 같은 다른 방법은 형질전환 마우스 라인을 설정하기 위해 수행 될 수있다. 렌즈피바이러스 벡터로 작업하는 것은 해당 지역의 GMO 위원회의 승인을 받는다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 벡터는 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.
