Name: deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
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FG 라 검색 술 Cancro (IG 2016Id.18842) 당 예술 슈퍼컵, Cariplo 재단 (그랜트 2014-0655), 그리고 피코 가정과 라 검색 Biomedica (FRRB) 당에 의해 지원 됩니다. 어제는 NIH 그랜트 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 그랜트, 하버드 의료 학교 밀 튼 발견 CCFA 수석 연구 상 (412708), 엘 레 노어, 마일 해안 지원 50 주년 친목 프로그램, 및 Cariplo 재단 ( 2014-0859).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고.
1. C. albicans 준비
<ol><li>문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-113, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매체 (효 모 추출 물 펩 포도 당 (YEPD), 1% (w/v) 효 모 추출 물, Bacto 펩, 포도 당 2% (w/v)의 2% (w/v))를 포함 하는 튜브에 이러한 조건에서 C. albicans 는 효 모로 자 랍니다. 참고: 다른 C. albicans 변종 사용할 수 있습니다, 같은 임상 분리 C. albicans 스트레인 SC531413. 이후 우리는 최근 궤 양성 과정은 타고 난 면역 계통14, 이론적으로 세포 벽 구성 요소와 구조를 유지 하는 모든 C. albicans 스트레인의 활성화에 의해 유도 된 증명 하고있다 뿐만 아니라 hyphal 계획을 시작 하는 기능을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 카운터 분석기를 사용 하 여 세포 농도 계산 하 여 문화를 모니터링 합니다.</li>
	<li>약 8 x 106 셀/mL의 농도 도달 하면 문화를 수확. 또는, OD600을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 참고: 일반적으로, OD600 의 값 = 1 ml/3 x 107 세포, 효 모 농도에 해당 하지만 적정 권장.</li>
	<li>HEPES (50 m m, pH 7.5)를 사용 하 여 버퍼 에이전트로 YEPD uridine 매체에 문화를 resuspend 하 고 균의 형성을 유발 하는 37 ° C에서 문화를 품 어. 100 배 확대에 현미경 hyphal 형성을 확인 하십시오. 37 ° C에서 배양 후 hyphal 형성은 보이는 5 h 그러나, 사용 하 여 셀을 16 h 37 ° C에 외피 후 hyphal 비율 총 문화의 거의 95%에 도달 하면.</li>
	<li>더 풍요롭게 hyphal 농도에서 준비, 5 분을 위한 3300 x g에서 문화 원심 분리기 aliquots 삭제는 상쾌한 고을 1 x 108 균/mL의 농도에서 살 균 PBS에 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>2. 깊은 피부 주입
<ol><li>24 시간 사전 감염 절차 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 전기 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 측면을 면도. 참고: 후 마 취를 포함 하는 모든 프로시저를 놓습니다 난방 램프 아래 쥐 그들은 효율적으로 복구 될 때까지.</li>
	<li>24 h 쉐이 빙 과정 어떤 염증 방지를 위한 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>면도 수술 후 24 h anesthetize 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐.</li>
	<li>쥐 취 깊이 되도록 발 반사를 확인 하십시오. 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 발 반사를 평가 합니다. 마 취를 달성 하는 경우 동물 통증을 느끼지 않습니다 하 고 이동 하지 않습니다.</li>
	<li>C. albicans 균 50 µ L/주입, 해당 5 x 106 균/주입 하의 마지막 볼륨에 30 G x 8 m m 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 깊은 더 마에 주사.<ol>
<li>면도 측면의 피부를 당겨 긴장 된 손가락 두 개를 사용 하 여 깊은 더 마에서 직접 볼륨을 주입 합니다. 향하도록 하는 바늘의 경사와 10-15 °의 각도와 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>이 각도와 약 300-500 µ m의 깊이와 병원 체를 주입 됩니다. 주사는 잘 수행 되도록 확인 주입 된 볼륨은 범프 형성 흡수 몇 분 주사 후. 참고: 범프 형성 후 주사 약 1 c m2의 있을 것입니다. 이것은 분자 또는 조직학 분석을 위해 지정 된 시간 지점에서 제거 될 것 이다 지역입니다.</li>
		<li>범프는 사출 형성 후 흡수, 몇 분 동안 지속 되 고 있기 때문에, 시간 점이 24 시간 보다는 더 적은 (권장)의 마커 펜으로 감염의 영역을 표시 합니다. 24 시간 이상의 시간 포인트, 위 궤 양 또는 낭종은 명확 하 게 볼 수 있기 때문에이 단계, 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 수집 및 조직학 얼룩을 위한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사</li>
	<li>수술 용 집게를 사용 하 여 이전 마커 펜으로 표시 된 삽입 된 사이트의 테두리에서 피부를 당겨. 수술가 위를 사용 하 여 표시 된 라인을 따라 피부를 절단 하 여 감염 된 사이트를 삭제할. 참고: 라운드 팁이 위를 사용 하 여 복 막에서 피부를 분리 하는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>일회용 기본 몰드 향하도록 피부의 내부 측면으로 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물, 가득한 피부에 젖어. 화합물 흰색 될 때까지 액체 질소에 샘플을 동결. 이 샘플을 손상 것으로 완전히 고정 하기 전에 샘플을 커버 하는 액체 질소 하 게 하지 마십시오 . 참고: 주의! 3.3 단계 동안 액체 질소에서 보호를 위해 얼굴 방패를 착용.</li>
	<li>샘플 슬라이드 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우 빠르게-80 ° c.에 저장 참고: 샘플을 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.</li>
</ol>4입니다. 슬라이드의 준비
<ol><li>샘플 샘플의 센터에서 출발 하는 조직학에 대 한 슬라이스를 준비 하는 반으로 잘라.</li>
	<li>잘라 5 µ m는 cryostat와 두꺼운 조각. 참고: 피부 샘플는 cryostat의 온도 하지 보다 클 수-25 ° c. 더 높은 온도 H-10 월의 부분적인 녹는 원인과 따라서 샘플 것 유지 되지 않을 올바른 위치에 절단 절차 동안.</li>
	<li>충전 된 현미경 슬라이드를 사용 하 여 슬라이스를 수집.</li>
	<li>준비 후 곧 수집 된 분할 영역을 사용 하지 않는 경우-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 이 시점에서, 조각은 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.</li>
</ol>5. 되며 & 오신 얼룩
<ol><li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 4 분 세척에 대 한 길의 hematoxylin에 침수에 의해 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>1 분에 오신 Y 솔루션에 집중 하 여 슬라이드 실행 5 분 린스에 대 한 수돗물 사용 하 여 슬라이드에 슬라이드 세척 얼룩 프로토콜을 계속 하기 전에 증류수.</li>
	<li>순차적으로 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 80%, 95%, 100%)의 농도 증가에 침수에 의해 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 각 에탄올 솔루션에서 s.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>40 X 확대 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩
<ol><li>1 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 1 분 세척에 대 한 실 온에서 ≥99.5% 아세톤과 슬라이드를 수정 합니다.</li>
	<li>얼룩 슬라이드 주기 산 솔루션 (1 g/dL)에 침수에 의해 5 분 세척에 대 한 증류수 3 변경에서 슬라이드.</li>
	<li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드에 Schiff의 시 약 15 분 세척에 대 한 침수로 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>5 분 씻어 30 수돗물 실행에 슬라이드에 슬라이드 길의 hematoxylin에 침수에 의해 얼룩 s.</li>
	<li>100% 에탄올의 3 변화에 집중 하 여 슬라이드를 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 s 각 시간.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>7. 샘플 수집 및 RNA 추출에 대 한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사 3.2 단계에서 피부 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 1 mL 2 mL 스냅 캡 튜브에 샘플을 담가. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>약 0.2 c m2 외과 집게를 사용 하 여 조각으로 샘플을 잘라. 참고: 주의! RNA 분리 시 약의 대부분은 독성 및 돌연변이. 증기 두건에서 수행 되어야 7.3 및 7.4 단계 해야 합니다 .</li>
	<li>또는 20 분에 대 한 20 진동/s의 속도로 비드 밀와 함께 샘플을 부 술, 기계적 포터를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플의 효과적인 균질 피부 그대로의 존재를 찾아 확인 합니다. 샘플은 완전 하 게 균질 하지 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>원심에서 16000 x g 1 분 유지에 대 한 샘플 RNA 추출 supernatants 고 펠 릿을 삭제. 이 단계는 머리와 추출 열을 차단할 수 있는 파편을 제거 하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>RNA 추출 RNA 정화 열14를 사용 하 여 계속 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 정화 및 농도 평가. RNA 추출 cDNA 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우-80 ° c.에 샘플 저장</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
피부 농 양 형성 C. albicans 감염15시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방법으로 그것은 기계적 손상이 나 상처에 어떤 선 동적인 응답을 피하 면 서 곰 팡이 확산을 제어 하는 중요 한 면역 세포의 채용 뿐 아니라 면역 세포, 사이 상호 작용을 공부 하 형성입니다. 실제로, 상피 구조를 그대로 유지 가능성은 마모와 같은 기계적 자극에 의해 발생 하는 염증 성 환경 개발을 피하기 위해 중요 하다. 199416폴 리 Matzinger에 의해 처음으로 이론로 손상 신호 수 있습니다, 그리고 사실, 면역 반응을 활성화 하 고, 따라서 potently elicited 병원 체에 의해 면역 반응에 영향을 미칠.
피해 관련 된 분자 패턴 (DAMPs) 죽은 세포에서 발생 한 수 있습니다 하지만 그들은 또한 스트레스 조건 하에서 발표 하실 수 있습니다. 조직 손상의 상황에서 이러한 신호를 생성할 수 있다, 이후 상처의 감염의 맥락도 전에 선 동적인 하이퍼 환경을 발생할 것 이다. 우리가 설명 하는 방법을 DAMPs의 릴리스를 제한 하 고 따라서 요소를 혼동의 존재를 감소 시킨다.
또한, 깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주입은 곰 팡이 감염에 대 한 뿐만 아니라 세균도 전에 대 한 사용할 수 있는 방법입니다. 또 다른 병원 체의 피부 모두의 경우 높은 번호에 대 한 책임 그리고 혈 류 감염 포도 상 구 균4. 우리는 최근에 어떻게이 프로토콜은 또한 S. 구 균 감염14를 공부 하는 중요 한 도구입니다 나타났습니다. 특히, S. 구 균 신체17의 여러 지역 농 양 형성 하는 기능에 대 한 클리닉에서 알려져 있다. S. 구 균 주사 깊은 더 마에 농 양, S. 구 균 에 의해 구동 하는 매우 초기 이벤트의 연구는 치유 하는 면역 반응의 참여 뿐만 아니라 발생 하는 동시에 활성화의 형성에 이르게 단계입니다.
마지막으로, 여기에 설명 된 방법론의 또 다른 중요 한 특징은 상피 구조는 유지 면역 세포의 지역화 될 수 있는 다른 통로의 활성화에 조직학 분석을 가능성을 제공 합니다. 공간 들 에게만. 이러한 실험 조건 하에서 사실, 피부의 다른 해 부 구조는 변경 되지 않습니다 하 고 면역 세포와 염증 성 중재자는 정확한 위치에 구상 될 수 있다.
면역 세포의 공간 배급을 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 따라서 곰 팡이 및 세균성 피부 감염 시 각 세포 유형의 역할 이해 하기 이상적입니다.

인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면1평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨2에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.
최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식3후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종4에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.
C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,5환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피6을 관통 하는 기능이 있다.
C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모7의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델8, Gaspari 외. 19989에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장10 및 호흡기 책자11 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.
(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,12치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.
여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>warm in 37 &amp;deg;C bath before use</td></tr><tr><td>H-OCT compound</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill&#039;s Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, mounting medium</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>PAS staining system</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tubes 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>Wear eye protection</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Particle Count</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Surgical forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base mould disposable</td><td>histo-line laboratories</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged bio microscope slides</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 50 mm</td><td>thermo scientific</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.

깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다.
피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금으로 병원 체의 확산을 포함 하는 polymorphonuclear 백혈구 (PMCs)의 주로 구성 되어있다. PMCs, 호 중구, 등 모집 조직14내 곰 팡이의 확산 따라서 피하 농 양 형성을 허용 한다. 높은 배율 (그림 1 c, D) 농 양의 주변 지역 또한 PMCs에 농축 방법을 보여줍니다.
구조적 무결성을 유지 하 여 감염 동안 병원 체의 지역화를 확인할 수 있습니다. C. albicans, 병원 체의 식별의 세포 벽 다 당 류의 높은 콘텐츠의 활용 수행 되었다 우선권 얼룩, 사용 하는 곰 팡이 게 보라색-마젠타 색상. 그림 2A같이 우선권 얼룩이 명확 하 게 병원 체 granulocytes14의 채용에 의해 형성 된 농 양 안에 국한 됩니다 보여 줍니다. C. albicans (그림 2B), 더 높은 확대에 명확 하 게 표시 되 고 괴 사 성 및 면역 세포에 의해 포위 될 것.
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 시간이 지남에 따른 염증과 감염 과정을 다음 수 있습니다. 매우 시작, 면역 세포에서 모집 (그림 1A 및 그림 3A)는 농 양 형성으로 이어집니다. 피부 조직의 분석까지 연장 했다 때 48-72 h, 피부 구조의 파괴, 흉터의 형성을 가시화 했다 (그림 3B, C). 이 구조 형성은 병원 체14의 퇴 학에 나오는 치유 단계 때문입니다.
궤 양 형성에 이르게 하는 프로세스는 감염 후 몇 일 동안 다음 수 있습니다. 그림 4A같이 야생-타입 마우스 C57BL/6 시간이 지남에 따라 증가 하는 궤 양성 프로세스를 표시 합니다. 약 70-80%는 쥐의 감염 후 궤 양이 72 h의 형성 표시. 실험적인 다양성으로 인해 적어도 8 쥐 모든 실험에 사용 되어야 한다. 통계 분석을 위해 다른 genotypes 또는 치료를 비교 하는 경우 각 궤 점수에 대 한 8-10 쥐의 최소 사용 하는 것이 좋습니다. 이 경우에 작은 차이 표시 되어야 합니다. 궤 양성 과정의 설명을 그림 그림 4B에 표시 됩니다. 특정 치료 또는 유전자 결함, 궤 양 형성 감소 될 수 있다/또는14폐지. 경우에 따라 궤 양, 대신 낭종 형성 된다, 그림 4C에서 볼 수 있듯이.
되며 & 오신 및 우선권 얼룩, 슬라이드 얼룩이 질 수 있다 어느 특정 세포 마커 또는 다른 immunohistochemical stainings 더 나은 시각화와: 콜라겐 섬유; cytokine/발산 위치 조직; 면역 세포 정체성 그리고 공간 배급입니다.
조직학 준비 뿐만 아니라 샘플 분자 분석에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 전체 주입 사이트 excised 조직학 준비에 관해서는 하 고 RNA 추출에 대 한 처리 수 있습니다. 조직에서 RNA 추출 연구 및 병원 체와 감염 하는 동안 그 유전자 upregulated의 식별 수 있습니다. 분자 분석에 대 한 샘플을 처리 하는 데 가능성은 조직학 분석을 하기 위해서는 더 나은는 중요 한 도구를 특성화 elicited 병원 체와 초기와 후반 단계 동안에 그것의 규칙에 대 한 면역 반응의 종류 후에 도전14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig1.jpg"> 그림 1: 피부 형태학 및 세포질 지 방화의 유지 보수. (A) 모든 레이어가 유지 됩니다. 상피, adipocytes, 및 근육 세포를 쉽게 인식할 수 있습니다. (화살표가 강조) (B) Polymorphonuclear 백혈구 농 양 내에서 확인할 수 있습니다. (C, D) 높은 배율 농 양 주변 지역에서 polymorphonuclear 백혈구 (화살표)의 존재를 보여줍니다. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig2.jpg"> C. albicans의 그림 2: 식별. (A) C. albicans 파스 얼룩과 조직 내에서 검출 될 수 있다. 더 나은 자주색, 얼룩 곰 팡이 시각화 (B) 높은 확대 농 양 안에 국한. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig3.jpg"> 그림 3: 염증 과정의 후속. (A) C. albicans 주입 하 여 elicited 염증 과정의 처음에서 granulocytes 병원 체를 제한 하려면 농 양을 형성 하기 위하여 모집. (B, C) 궤 양이 형성은 곰 팡이의 퇴 학에 대 한 필요 합니다. 치유 조직 그리고 피부 구조 무결성에 변경 특징은 흉터의 형성으로 이어질 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig4.jpg"> 그림 4: 궤의 활동. (A) 궤 양성 과정 감염 후 첫 번째 일 동안 증가의 추세는 다음과 같습니다. 감염 후 72 h, 쥐의 70-80%는 감염의 사이트에 궤 양이 보여 줍니다. 16 C57BL/6 야생 타입 동물 사용 되었다. (B) 궤 양 감염 후 48 h 개발의 설명 사진. (C) 감염 후 낭종 형성의 설명 사진. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.7K 조회수.  University of Milano-Bicocca. 여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

비디오: Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

연구

면역학 및 감염병학

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

의학

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

마우스의 구강 칸디다증에 대한 커큐미노이드를 사용한 효과적인 aPDT

Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis

Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) has been extensively investigated in vitro, and preclinical animal models of infections are suitable for evaluating alternative treatments prior to clinical trials. This study describes the efficacy of aPDT in a murine model of oral candidiasis. Forty mice were immunosuppressed with subcutaneous injections of prednisolone, and their tongues were inoculated using an oral swab previously soaked in a C. albicans cell suspension. Tetracycline was administered via drinking water during the course of the experiment. Five days after fungal inoculation, mice were randomly distributed into eight groups; a ninth group of untreated uninfected mice was included as a negative control (n = 5). Three concentrations (20 &#181;M, 40 &#181;M, and 80 &#181;M) of a mixture of curcuminoids were tested with a blue LED light (89.2 mW/cm2; ~455 nm) and without light (C+L+ and C+L- groups, respectively). Light alone (C-L+), no treatment (C-L-), and animals without infection were evaluated as controls. Data were analyzed using Welch&#39;s ANOVA and Games-Howell tests (&#945; = 0.05). Oral candidiasis was established in all infected animals and visualized macroscopically through the presence of characteristic white patches or pseudomembranes on the dorsum of the tongues. Histopathological sections confirmed a large presence of yeast and filaments limited to the keratinized layer of the epithelium in the C-L- group, and the presence of fungal cells was visually decreased in the images obtained from mice subjected to aPDT with either 40 &#181;M or 80 &#181;M curcuminoids. aPDT mediated by 80 &#181;M curcuminoids promoted a 2.47 log10 reduction in colony counts in comparison to those in the C-L- group (p = 0.008). All other groups showed no statistically significant reduction in the number of colonies, including photosensitizer (C+L-) or light alone (C-L+) groups. Curcuminoid-mediated aPDT reduced the fungal load from the tongues of mice.

저자 스포트라이트: 구강 칸디다증을 위한 쥐 모델에서 커큐민을 사용한 광역학 요법 탐색

This protocol describes the application of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) in a murine model of oral candidiasis. aPDT was performed using a water-soluble mixture of curcuminoids and blue LED light.

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

요약

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구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

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