Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.

모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.
1입니다. 골의 수확
<ol><li>Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.</li>
	<li>셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 중간 (단계 2.1)를 사용 하 여 세포 분화를 페 트리 접시에에서 셀.</li>
</ol>2. 골 수 유래 세포의 분화
<ol><li>미리 데워 진된 차별화 매체 (DMEM-10 완전 한의 21 mL 및 L929 세포 조절 매체 스완 손 외 에 설명 된 대로의 9 mL를 사용 하 여 18) 15 cm에서 골 수 세포를 넣어 조직 문화 취급 페 트리 접시 (1.2-1.5 x 107 셀). 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 하루 3 또는 4에 접시를 차별화 매체의 추가적인 30 mL를 추가 합니다. 참고: 그것은 중요 하다를 취급 하는 조직 문화 접시를 사용 하지 대 식 세포를 분리 하 고 수확 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>대 식 세포를 수집 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 접시를 세척 하 고 차가운 PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 20 mL를 추가 합니다. 셀 위에 PBS + EDTA를 pipetting으로 셀 10 분 수확에 대 한 4 ° C에서 접시를 품 어 하 고 PBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 두 세척을 결합 한다.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 및 페 놀 레드 무료 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 10 mL에 셀 resuspend FBS (DMEM-5)는 hemocytometer 또는 Coulter 카운터 중 하나를 사용 하 여 셀을 카운트. 계산 하는 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
	<li>2 x 105 셀/mL에 코팅 하는 조직 문화 접시에 있는 대 식 세포 씨앗 현미경 실험, coverslips 24 잘 플레이트에 셀의 1 mL 씨. LDH 방출 분석 실험, 96 잘 접시에 셀의 100 µ L 씨. LDH 분석 결과 대 한 9 웰 스 (3 웰 스 치료, 100% 세포 제어 3 우물과 실험 자극에 대 한 3 웰 스) 씨.</li>
	<li>특정 셀에 게 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기는 96 잘 접시는 동등 하 게 잘 분산.</li>
	<li>못쓰게 프로세스를 시작 하기 전에 하룻밤에서 37 ° C + 5% CO2 접시를 품 어.</li>
</ol>3입니다. 애 벌 칠
<ol><li>100 ng/mL LPS 잘 접시 24에 대 한 500 μ (잘 접시는 96에 대 한 50 μ) 포함 된 신선한 매체 (DMEM-5)와 매체를 교체 합니다. 참고: 다양 한 LPS TLR4 중재 못쓰게19를 자극 하는 능력에 영향을 미치는 구조 변화 있다. 살 모 넬 라 미네소타 R595에서 LPS (Re) 여러 공급 업체에서 제공 하 고 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO23 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
</ol>4. Nigericin와 NLRP3 Inflammasome 및 팸-YVAD-FMK로의 활성화
<ol><li>매체를 제거 하 고 290 μ DMEM-5 5 μ M nigericin 및 5mm 글리신의 바꿉니다. 글리신은 caspase-1 활성화5하는 동안 발생 하는 세포 세포의 양을 줄이기 위해 추가 됩니다. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어. 야생 유형 및 caspase-1 부족 한 대 식 세포를 사용 하 여 관찰된 변하면 caspase-1에 대 한 특정 되도록.</li>
	<li>마지막 45 분 동안 추가 30 10 μ x 팸-YVAD-FMK, 제조업체의 지침에 따라 준비.</li>
	<li>60 분 후에 매체를 제거 하 고 씻어 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 셀.</li>
	<li>각 음을 2 %paraformaldehyde 250 μ를 추가 하 고 30 분 동안 알루미늄 호 일로 덮여 얼음에 품 어.</li>
	<li>마지막 5 분 동안 4 μ의 핵을 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩을 추가 합니다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 다른 염료 상표 DNA 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>세 번 차가운 PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips를 탑재. 장착 매체 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 대 식 세포를 이미지. 예 스 / 팸-YVAD-FMK에 대 한 Em 492/520nm 642/661 빨강 형광 핵 산 얼룩에 대 한. 현미경 치료 셀 488 채널에 얼룩 어떤 배경 표시 안 되도록 설정 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 배경 식구 들-YVAD-FMK 얼룩 감지 하 고 실제 활성 caspase-1 될 것입니다. 참고: 현미경 설정 섹션 6에서에서 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>5. 항 체 얼룩이 지기
참고: ASC를 검출 하기 위하여 항 체와 함께 셀 라벨, 씨앗, 프라임 고 노출 셀 nigericin 이전 섹션에 동일 하. 처리 후는 다음과 같습니다:
<ol><li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 세포를 씻어. 고정 및 permeabilization 솔루션의 250 μ를 추가 합니다. 얼음에 셀을 품 어 그리고 30 분 동안.</li>
	<li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 워시 버퍼의 대 식 세포를 씻어.</li>
	<li>ASC에 대 한 1 차적인 항 체의 250 μ 희석 1: 500 워시 버퍼에 추가 하 고 얼음에 1 시간에 품 어. 포함 한 coverslip 어떤 1 차 항 체에 영향을 받지 않는 하지만 보조를 받을 것 이다. 이 coverslip 올바른 오프셋을 설정 하는 현미경 설치 하는 동안 사용 됩니다.</li>
	<li>셀 5 분 각 1 mL 워시 버퍼에 대 한 세 번 씻는 다.</li>
	<li>이차 항 체 (형광 색소 활용 된 염소-안티-마우스)의 250 μ 워시 버퍼에서 1: 500을 희석 하 고 얼음에 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다. 레이블 핵에 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩이이 외피의 마지막 5 분의 4 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>3 세포를 씻어 감기 워시 버퍼 및 현미경에 coverslips 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드 마운트의 1 mL x. 장착 매체 투명 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지 세포입니다. 전 이차 항 체에 대 한 Em은 555/580 / nm와 642/661 빨강 형광 핵 산에 대 한 얼룩 (아래와 같이). 참고: FAM-YVAD-FMK와 항 체 라벨로 표시 활성 caspase-1 및 ASC 공동 현지화를 결합 수 있습니다. 이 위해 식구 들-YVAD-FMK 라벨에 대 한 조건에 따라 하 고 추가 처리를 위해 프로토콜 라벨 항 체로 전환.</li>
</ol>6. Confocal 현미경 검사 법에 의해 레이블이 세포 이미징
참고: 후에 coverslips 하룻밤 치료와 매니큐어와 현미경 슬라이드에 밀폐 되어 허용 된 스테인드 세포를 볼 수 있습니다. 여기, 이미징 confocal 현미경을 사용 하 여 설명 합니다. 세포는 또한 표준 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
<ol><li>현미경 단계에 치료 제어 셀과 슬라이드를 놓고 셀에 현미경을 집중 합니다.</li>
	<li>치료 되지 않는 셀에 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 지는 그런 현미경 볼을 테이블 (LUT) 설정을 사용 하 여, 오프셋을 조정 합니다. 이 과정 또한 caspase-1 부족 한 세포를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 참고: 오프셋, 실험에 사용 되는 각 채널에 대 한 조정 해야 하지만 올바른 오프셋을 설정 하는 것이 식구 들-YVAD-FMK 채널 및 형광 항 체 채널에 대 한 가장 중요 한. DNA 채널에 대 한 오프셋은 덜 중요 합니다. 오프셋을 설정 실험의 나머지 부분에 대 한이 설정을 조정 하지 않습니다.</li>
	<li>취급 하는 nigericin 샘플 슬라이드를 전환 합니다. 긍정적이 고 식구 들-YVAD-FMK 얼룩에 대 한 부정적인 두 셀을 포함 하는 필드를 찾아. 긍정적인 얼룩이 지기의 가장 높은 강도 가진 비행기로 팸-YVAD-FMK 채널의 영상 평면을 조정 합니다. 이것은 일반적으로 비행기 inflammasome 초점의 센터 몇 군데 됩니다.</li>
	<li>그런 foci 응축된 핵이 있는 셀에 표시 되는 이득을 조정 합니다. 이득 및 오프셋을 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분에 대 한 이러한 설정을 둡니다. 참고: 셀 pyroptotic 인지 확인 하는 쉬운 편도 핵 형태를 보고는. 활성 caspase-1 셀 둥근 이며 응축된 핵, nucleoli caspase-1 활성화 및 핵 형태학 없이 세포에서 볼 수 있습니다 하는 동안 치료 세포의 것과 유사 합니다.</li>
	<li>총 배율 X 100에 5 무작위로 선택 된 필드의 이미지를 수집 합니다. 이 이미지 당 약 40 셀 일반적으로 발생 합니다. 각 샘플에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 이미지에는 셀의 수를 계산 합니다. 다음 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 있는 셀의 개수를 계산 합니다. 팸-YVAD-FMK 긍정적인 세포의 백분율로 caspase-1 활성화의 수준을 나타냅니다.</li>
</ol>7. LDH 자료 분석 결과
참고: LDH 자료 분석 결과 대 한 씨앗과 프라임 셀 이전 섹션에 설명 된 대로 제외 하 고 사용 하 여 96 잘 접시. 못쓰게 후 매체를 제거 하지 마십시오.
<ol><li>DMEM-5 실험 웰 스에 10 μ M nigericin 및 50 μ의 50 μ 추가 자연과 100% 세포 제어 웰 스 DMEM-5. 때문에 목표 셀 세포를 측정 하는이 실험에서 글리신을 추가 하지 마십시오. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어.</li>
	<li>30 분 후 100% 세포 제어 웰 스에 10 x 세포의 용 해 버퍼의 10 μ를 추가 하 고 다른 우물에 DMEM 5 10 μ를 추가 합니다. 이 부 화 하는 동안 냉장고에서 기판 믹스 (동결된 기판의 1.5 mL)의 1 유리병과 분석 결과 버퍼 (~ 12 mL) 1 약 수를 제거 하 고 실내 온도에 빛에서 보호 해 동 그들. 참고: 기판 믹스 빨간색 formazan 제품으로 변환 되는 tetrazolium 소금 (iodonitro tetrazolium 바이올렛), 포함 합니다.</li>
	<li>60 분 총 부 화 후 10 ° c.에 x 500g에 5 분 동안 접시를 원심 분명 평면 하단 플레이트에는 상쾌한의 50 μ를 전송 합니다. 이 시간 동안 기판 믹스의 유리병에 분석 결과 버퍼의 12 mL을 추가 하 고 사용 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>50 μ 기판의 각 음을 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 중간만 웰 스 빈 값을 포함 합니다. 신호 플레이트 리더의 검출 한계를 초과 하지 것입니다 되도록 15 분 후 접시를 확인 합니다.</li>
	<li>30 분 후 정지 솔루션 (1 M 초 산)의 50 μ를 추가 하 고 OD490 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 세포 세포의 용 해의 비율을 계산: %Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (최대-자발적인)) × 100 실험: 취급 하는 nigericin 세포; 자연: 치료 세포; 최대: 세포 세포의 용 해 버퍼에 노출</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 충돌의 관심을가지고

이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.
어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 우선, 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포를 사용 하는 것이 필수적입니다. 이러한 두 셀 형식 사용 하 여 일반적인 얼룩 이어질 조건 추가 분석에서 제외할 수 있습니다. 둘째, 어떤 항 체 또는 활동 조사 분석 결과 라벨와 마찬가지로 셀 식구 들-YVAD-FMK와 얼룩을 씻고 철저 하 게 중요 하다. 3 5 분 세척을 사용 하 여 배경 신호 수준의 크게 감소 된다. 세 번째 중요 한 단계는 confocal 현미경의 설치 하는 동안 발생합니다. 여기, 그것은 중요 한 치료 셀 식구 들-YVAD-FMK 표시 긍정적인 세포질 얼룩이 지는 치료 셀에서 관찰 하는 방식에 confocal 현미경의 오프셋을 설정 하는 데 사용 됩니다. 때 이러한 단계를 따라이 기술은 셀룰러 기준 caspase-1의 활성화를 평가 하는 유용한 도구 이다.
이 프로토콜 연구원 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어 셀 전체 과정 중 여러 단계에서 작은 분자량 화합물으로 처리할 수 있습니다. 이것은 경로 NLR, ASC 또는 프로-caspase-1의 채용의 oligomerization 변조 식별에 대 한 허용 또는 caspase-1 자체의 활성화. 이 프로토콜에 대 한 수정 필요 그런 그들 자체로 caspase-1을 활성화 하지 않습니다. 이 경우에 약물의 복용량 응답 곡선이 필요 합니다. 비록 우리가 NLRP3 inflammasome의 활성화에 초점을 맞춘,이 프로토콜은 다른 호흡기에 의해 발생 하는 inflammasomes를 검사 하도 사용할 수 있습니다. 우리는이 원고에 포함 하는 다른 수정 식구 들-YVAD-FMK 항 체 라벨 inflammasome 구성 요소와 얼룩의 조합 이다. 우리는 활성 caspase-1 inflammasome 어댑터 ASC의 공동 지역화는 보여줍니다. 이 방법의 한계 설명, confocal 현미경에 접근을 요구 한다 이다. 그러나, cytometry에 의해 ASC 초점 형성을 검출 하는 관련된 전략 보고20,21되었습니다.
두 번째 기술은 우리가 논의 LDH 자료 분석 결과 사용 하 여 셀 세포의 급속 한 탐지 할 수 있습니다. LDH 릴리스는 또한 많은 다른 형태의 세포 죽음 동안 발생 하 고 pyroptosis에는 원형질 막 세포 무결성 및 셀의 손실을 나타냅니다 중요 하다. 그러나, caspase-1 부족 한 셀의 사용 caspase-1-종속 세포 세포의 용 해, pyroptosis의 정의 기능을 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜 (특히 사용 하는 경우는 전염성이 에이전트)에서 중요 한 단계는 96 잘 접시에 셀 시드 후 접시를 원심. 원심 분리 격판덮개의 우물의 전체 표면에 걸쳐 세포의 동등한 배급에 대 한 수 있습니다. 동등 하 게 분배와 각 대 식 세포는 박테리아의 동일한 수에 노출 됩니다. 원심 분리, 없이 우물에 있는 액체의 초승달 모양 효과 우물의 가장자리에 축적 하는 더 많은 세포를 이어질 것입니다. 이 우물의 센터에서 (나) 잘 벽 가까이 하 고 의도 한 것 보다 더 높은 나 감염의 의도 다양성 보다 낮은 이어질 것 이다.
LDH 자료 분석 결과의 잠재적인 단점은 세포 인구 수준에 및 분석 결과 당 한 시간 점에서 측정입니다. 대체 방법은 현미경 검사 법, 식별 하는 단일 셀 기준 막 무결성의 손실에 의해 셀 impermeant 염료의 통풍 관을 정할 것입니다. 라이브 셀 이미징 플랫폼을 결합해,이 방법은 pyroptosis22의 일시적인 평가 제공할 수도 있습니다. Propidium 요오드 화물과 같은 작은 DNA 바인딩 형광 염료 또는 ethidium 평범한 사람 수 통과 gasdermin D 기 공, 세포 핵 산, 바인딩할5,,2223형광. 기 공 형성 하 고 이러한 작은 염료의 일시적으로 앞 터미널 세포 세포의 용 해. 세포는 더 큰 염료의 통풍 관 및 LDH 등 큰 세포질 단백질의 손실 수 있습니다. 글리신의 사용 수 있다 실험적으로 연결을 푸십시오 기 공 형성을에서 세포, 글리신 gasdermin D 중재 기 공 형성, 작은 염료의 통풍 관 또는, IL 1β의 분 비를 차단 하지 않습니다 하지만 급속 한 세포 및 LDH 릴리스5,22 글리신 방지는 , 23 , 24. 막 무결성의 완전 한 손실을 방지 하기 위해 팸-YAVD-FMK 착 실험에 글리신을 포함 하는 것이 좋습니다 하지만 글리신 pyroptotic LDH 릴리스를 측정할 때 생략 해야 합니다.

Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.
여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. "프라이 밍"의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.
NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 "반점"를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.
모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.
두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.
이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>For growing L929 cells</td></tr><tr><td>NCRC clone 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS, no calcium, no magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Heat inactivated at 55&amp;deg;C for 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td></tr><tr><td>goat anti-mouse ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>far-red fluorescent nucleic acid stain</td></tr><tr><td>C57BL/6J mouse</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspase-1/11-/- mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>anti-ASC clone 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.

검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구 들-YVAD-FMK 얼룩이 지기의 부재와 같이 보여 줍니다. 이 세포의 핵은 하지 집 광, 아무 pyroptotic 나타내는 세포 죽음 발생. 이미지는 기름 침수 목표 X 63와 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 촬영 했다. 이미지는 어떤 추가 처리 없이 TIFF 파일으로 저장 되었다.
연결 nigericin에 노출 된 세포 죽음의 수준을 결정 하기 위하여 우리는 표면에 뜨는 문화에 LDH 자료 분석 결과 수행 합니다. 그림 2 는 야생 타입 세포 nigericin에 노출 된 후 세포 죽음을 받 다. 대조적으로, 세포 결핍 caspase-1 셀은 그대로 나타내는 셀 상쾌한에 LDH를 해제 하지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig1.jpg"> 그림 1: FAM-YVAD-FMK와 안티 ASC 라벨. (A) 야생 타입 (WT)와 (B) (c 1/11-/-) caspase-1/11 불충분 한 세포 1 h 5 μ M nigericin에 노출 되었고 식구 들-YVAD-FMK를 사용 하 여 활성 caspase-1, 그리고 안티-ASC를 감지 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 활성 caspase-1에 대 한 분석 ASC를 감지 하는 기본 및 염소-안티-마우스 보조 항 체 형성 초점. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig2.jpg"> 그림 2: LDH 자료 분석 결과 결과. 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포는 1 시간에 5 μ M nigericin에 노출 됐다 고 셀 표면에 뜨는 LDH의 존재에 대 한 분석 했다. 데이터는 3 개의 복제의 수단 ± SD. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K 조회수.  University of Washington. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

연구

면역학 및 감염병학

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development and implementation of biomedical devices and tissue engineering constructs. Macrophages, an innate immune cell, are key players in the foreign body reaction because they remain at the implant site for the lifetime of the device, and are commonly studied to gain an understanding of this detrimental host response. Many biomaterials researchers have shown that adsorbed protein layers on implanted materials influence macrophage behavior, and subsequently impact the host response. The methods in this paper describe an in vitro model using adsorbed protein layers containing cellular damage molecules on polymer biomaterial surfaces to assess macrophage responses. An NF-&#1082;B/AP-1 reporter macrophage cell line and the associated colorimetric alkaline phosphatase assay were used as a rapid method to indirectly examine NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in response to complex adsorbed protein layers containing blood proteins and damage-associated molecular patterns, as a model of the complex adsorbed protein layers formed on biomaterial surfaces in vivo.

This protocol provides researchers with a rapid, indirect method of measuring TLR-dependent NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in a murine macrophage cell line in response to a variety of polymeric surfaces and adsorbed protein layers that model the biomaterial implant microenvironment.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

생체공학

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host Defense Mechanism

Detection of Inflammasome Activation via Fluorescence Microscopy

Source: den Hartigh, A. B. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video demonstrates a method to detect NLRP3 inflammasome activation in macrophages using fluorescent reporter probes. The cells are treated with potassium ionophores and glycine to induce inflammasome assembly and caspase-1 activation. Fluorescent reporter probes visualize activated caspase-1, and cells are stained with a fluorescent dye for nuclei visualization.

Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages

Source: den Hartigh, A. B., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to study NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome formation in primary macrophages via immunofluorescence. The macrophages are first primed with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to upregulate NLRP3 protein expression. Exposing the macrophages to nigericin&#8212;a potassium ionophore&#8212;leads to the activation of NLRP3 and the formation of inflammasomes, which are visualized via immunofluorescence.

대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

A Lactate Dehydrogenase Release Assay To Detect Macrophage Death Following Nigericin Exposure

Source: den Hartigh, A.B. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the lactate dehydrogenase assay to detect inflammasome-mediated macrophage death. The macrophages are exposed to lipopolysaccharide for priming, followed by exposure to nigericin to cause inflammasome-induced cell death, which is determined by the lactate dehydrogenase assay.

Nigericin 노출 후 대식 세포 사멸을 감지하기 위한 Lactate Dehydrogenase 방출 분석

1. LDH Release Assay
NOTE: For the LDH release assay, seed the cells in a 96-well plate. Do not remove the medium after priming.

	Replace the medium with ...