Name: long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel at JoVE.com

AFB, MAV와 NJG 라이언 Quinton 원고와 아드리안 Salic TDRFP NLS 구문에 대 한 의견 감사 하 고 싶습니다. AFB, MAV NIGMS 바이오 약리학 훈련 그랜트 5T32GM008541에 의해 재정 지원 됩니다. NJG은 Shamim Ashraf Dahod 유 방 암 연구 실험실의 일원 이다와 NIH 교부 금 GM117150 및 CA 154531, 카린 Grunebaum 재단, 스미스 가족 보너스 프로그램, Searle 학자 프로그램 그리고 흑색 종 연구에 의해 지원 됩니다. 얼라이언스입니다.

이 프로토콜 비 변형 및 chromosomally 안정 망막 안료 상피 (RPE-1) 셀 라인을 사용 하 여 라이브 셀 이미징 실험에 집중 한다. 그러나,이 프로토콜으로 세포 배양 조건을 필요에 따라 조정 됩니다 어떤 부착 셀 라인에 적응 될 수 있다. 모든 절차는 기관 biosafety 및 윤리 지침을 준수 해야 합니다.
1. 라이브 셀 이미징에 대 한 셀을 준비합니다.
<ol><li>
갓 해 동 하 고 초기 통로 RPE-1 셀 인간의 히스톤 H2B 형광 단백질 (예: H2B GFP), 융합 또는 FUCCI 시스템 (FUCCI 표현 하는 세포를 생성 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜 참조45에서 찾을 수 있습니다)를 표현 사용 mitotic 세포 운명 평가 하기
	<ol>
<li>핵 파열의 주파수 측정, H2B GFP와 단일 핵 지 방화 신호 (NLS TDRFP)를 융합 하는 빨간 형광 단백질의 탠덤 이합체 RPE-1 셀을 사용 합니다. 참고: 3 개의 녹색 형광 단백질의 구조는 단일 핵 지 방화 신호에 연동에서 융합 (GFP3-NLS) 또한 (참조42)에서 파열을 보여 주기 위해 사용 되었습니다.</li>
		<li>적절 한 성장 매체에 10cm 조직 문화 접시에 셀을 유지 합니다. RPE-1 셀에 유지 됩니다 페 놀 레드-무료, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 IU/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM:F12).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀에서 매체를 발음, 살 균, 실내 온도 버퍼링 인산 염 분 (PBS) 나머지 매체를 제거 하 고 PBS 발음의 10 mL와 함께 조직 문화 접시를 세척.
	<ol>
<li>0.25%의 2 개 mL를 추가 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세포를 트립 신, 또는 세포의 대다수는 접시에서 분리 될 때까지 3 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 필요 이상 trypsin에 세포를 보관 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 mL 혈 청 학적인 stripette와 trypsinized 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 분배 하는 완전 한 매체의 10 mL를 추가 합니다.
	<ol>
<li>실내 온도에 3 분 동안 180 x g 에서 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발음 되는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 상쾌한 고 철저 하 게 resuspend 펠 릿 10 ml 신선한 매체의 매체 serological stripette에 아래로 pipetting 부드럽게 하 여.</li>
	<li>
계산 셀46hemocytometer 또는 자동된 셀 카운팅 기계를 사용 합니다.
	<ol>
<li>30, 000 셀/ml 전체 매체의 새로운 원뿔 튜브에 세포를 희석.</li>
		<li>30000 RPE-1 (볼륨 1 mL) 당 세포 12 잘 유리 바닥 (#1.5 두께)의 다음날 (30-50% 합칠) 필요한 세포 밀도 달성 하기 위해 접시 이미징 플레이트. 참고: 항상 장갑과 접시를 처리 하 고는 유리 바닥을 터치 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>때까지 그들은 완벽 하 게 연결 하 고 유리 바닥 이미징 접시에 평평 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 셀 4 h 만큼 적게 첨부할 수 있습니다, 하는 동안 셀 약물 치료와 다음 날까지 몇 군데 되지는 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
Paclitaxel (디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해) 완전 한 매체와 혼합에 원하는 최종 농도를 철저 하 게 추가 합니다.
	<ol>
<li>완전 한 매체 제어로 사용 하 여 혼자 DMSO의 동일한 볼륨을 준비 합니다.</li>
		<li>따뜻한 셀에 추가 하기 전에 37 ° C에 마약 또는 DMSO를 포함 하는 매체. 이것은 갑작스런 온도 변화로 인해 초점 드리프트를 방지 합니다.</li>
		<li>Paclitaxel 또는 12 잘 이미징 접시의 개별 우물 혼자 DMSO를 포함 하는 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 설정 라이브 셀 이미징에 대 한 현미경
<ol><li>모든 지문 또는 이미지를 방해할 수 있는 먼지를 제거 하려면 광학 청소기 이미징 접시의 유리 바닥을 청소 합니다. 충분 한 광 청소기를 사용 하 여 전체 유리 표면에 젖은.</li>
	<li>유리 하단 접시 이미징 접시 어댑터에서 현미경 단계에, 요리에서 플라스틱 커버를 제거 놓고 유리 올랐다 챔버와 함께 요리를 커버 합니다. 챔버는 5% CO2의 구성 된 공기의 지속적인 흐름을 허용 하도록 밸브를 확인 합니다. 참고:을 축이다 5% CO2, 가스 배관 살 균 물 목욕 주택에 삽입을 통해 이동은. 95% 습도에 equilibrated 될 가스에 대 한 수 있습니다.</li>
	<li>시작/보정 현미경 제어 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 인코딩된 무대. 이 정확한 X Y 좌표를 확인 하 고 초점 드리프트를 방지 합니다.</li>
	<li>단계 대조 광학을 사용 하 여 셀에 집중 하 고 (자세히 설명 참조47) 빛을 집중 하 고 최적의 대비를 제공 하는 Kohler 조명 수행.</li>
	<li>
수집 소프트웨어를 사용 하 여 흰 빛과 모든 형광 채널 사용 되 고 (노출 카메라에 게 75% 픽셀 채도 이상적인, 빛의이 금액은 세포에 독성 제공)에 대 한 최적의 노출 시간을 결정.
	<ol>
<li>수집 소프트웨어를 사용 하 여 여러, 선택 겹치지 시야 이미징 각 우물에서. 셀은 유리 바닥 잘 준수 하 고 50%와 70% 합칠 사이 이미지 영역을 선택 합니다. 이 후속 분석을 어렵게 만들 것입니다 이멀전의 셀의 영역을 피하십시오. 참고: 두 번 같은 셀을 추적 하지 않으려면 각 우물에서 겹치지 않는 시야를 중요 하다. 셀 매우 운동 있다면, 그것은 중앙 점과 함께 하나의 큰 시야를 만들기 위해 다시 스티치에서 밖으로 발산 하는 여러 이미지를 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유지 하려면 모든 포인트 초점에 실험의 기간에 대 한 현미경의 autofocusing 기능을 활성화 합니다.</li>
	<li>Mitotic 세포 운명 평가, 수집 이미지에서 볼 때 각 선택한 필드 마다 10 분에 대 한 최대 96 h. Unperturbed에 유사 분열 정도 20-40 분, 10 분 간격으로 세포 분열 하는 경우를 식별 하려면 충분 한 샘플링을 제공 합니다 따라서 이미징 소프트웨어를 설정 합니다. 일시적인 이벤트 인 핵 파열을 식별 하려면 이미지 마다 5 분을 취득 합니다. 참고: 이미지 수집 소프트웨어를 구동 하는 컴퓨터는 자동 업데이트, 화면 보호기, 및 에너지 절약 모드 비활성화, 이들은 종종 긴 실험을 통해 이미지 수집 방해 수 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>이미징 실험을 시작 합니다. 정기적으로 이미지 수집 비디오의 과정을 통해 원활 하 게 실행 중인 확인 하십시오.</li>
</ol>3. 비디오 분석 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 식별 하
<ol><li>군데 세포 이미징 실험의 과정을 통해 건강 한가 확인 합니다. 실용적이 고 적극적으로 확산 제어 셀 DMSO로 치료 해야 합니다. 참고: 셀을 전시 하는 경우, 긴장의 표시 하지 비디오 quantitate 고 이미징 조건48를 최적화에 초점을 대신. 이미징 스트레스의 증상 blebbing/죽어가는 셀, 셀 첨부/확산에, 실패 하는 및 낮은 mitotic 색인 및 장기간된 유사 분열을 표시 하는 셀을 포함 합니다. 스트레스의 가능한 소스 변동 온도 또는 이미징 챔버 또는 phototoxicity48안으로 CO2 레벨에 포함합니다.</li>
	<li>10 X 20 X 목표와 전체 필드 보기는 이미징 때 개별 셀의 수백 존재할 수 있습니다. 따라서, 정량 지원, 보기의 필드 사용할 수 있는 소프트웨어 도구를 사용 하 여 작은 사분면으로 나눕니다. 각 사분면 내에서 셀을 별도로 (단계 3.3.1–3.6.2에서와 같이) 점수.</li>
	<li>
비디오 분석, 위상 대조 및 형광 이미지를 사용 하 여 병합 된 보기에서 각 셀을 추적 합니다. 소프트웨어 분석 도구를 사용 하 여 병합 된 뷰를 만드는.
	<ol>
<li>비디오의 시작 부분에서 시작, 단일 interphase 셀을 식별 하 고 세포 주기 단계 광학을 사용 하 여 진행률 추적. 단일 셀을 추적 하려면 관찰 셀 프레임을 눈으로 합니다. Interphase 셀 (평가 단계 대조 하 여)로 병합 된 그들의 형태학과 DNA 응축의 그들의 부족 (H2B GFP에 의해 평가)를 식별 (그림 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 (를 사용 하 여 단계 대조 광학) 반올림의 관찰에 의해 유사 분열을 입력 하는 셀을 식별 및 염색체 응축 (H2B GFP를 사용 하 여) (그림 1A-C). 두 셀 반올림 및 염색체 응축 쉽게 눈으로 시각화 됩니다.
	<ol>
<li>주석을 셀 유사 분열은 시간. 그것은 그것의 운명 (3.5 단계, 단계 3.6.1에서 유사 분열에서 세포 죽음 또는 단계 3.6.2 에서처럼 mitotic 미끄럼 anaphase)에 도달할 때까지 셀을 추적 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제어 셀 효율적으로 그들의 염색체를 정렬 하 고 anaphase 1 h (그림 1D) 안에 입력 해야 합니다. 셀 2로 또는 poleward를 이동 염색체 H2B GFP (그림 1A)와 표시의 시각화를 통해 대 타를 시작으로 단계 대조 광학 여 anaphase를 시각화. 주석을 시간 때 셀 anaphase 겪 습.</li>
	<li>
대조적으로, 세포 paclitaxel 치료 몇 시간 (3-40 h) (그림 1B-D)에 대 한 압축 된 염색체를 가진 둥근 유지 됩니다.
	<ol>
<li>세포의 죽음을 받 다 mitotically 체포 셀을 식별 합니다. 참고: 유사 분열 동안에 죽는 세포는 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 시각, 셀으로 bleb, 축소, 또는 파열 (그림 1B). H2B GFP를 이미징 하는 경우 염색체 세포 죽음 동안 또한 조각화 됩니다.</li>
		<li>셀 미끄럼을 받아야 하는 mitotically 체포 셀을 식별 합니다. 참고: 셀 mitotic 미끄럼을 받 다 관찰 된다 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 그들은 interphase에 다시 밖으로 평평 하 고 염색체 anaphase (그림 1C)을 겪고 하지 않고 decondense. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀을 일으키 다 큰 tetraploid 셀 그는 종종 multinucleated (그림 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>원래 시야에서 세포를 추적 계속. 보기의 전체 필드를 추적 하는 일단 잘 동일한에서 인수 별도 필드의 보기를 이동 하 고 세포를 추적 계속.</li>
</ol>4. 비디오 분석 셀 운명 Mitotic 미끄럼 다음 식별을
<ol><li>
세포 운명 다음과 같은 mitotic 미끄럼 (3.6.2 단계에서 설명)를 평가 FUCCI 시스템을 표현 하는 RPE-1 셀을 사용 하 여. 단계 대조 이미징, 뿐만 아니라 그것은 빨간 형광 (G1 단계 지표) 및 녹색 형광 (S/G2/M의 지표) 이미지 획득 하는 데 필요한).
	<ol>
<li>FUCCI RPE-1 셀 3.7 통해 3.3 단계에서 설명한 대로 추적 합니다.<ol>
<li>FUCCI 시스템은 제대로 작동 하는지 확인, 해당 컨트롤을 유효성 검사를 적절 하 게 라이브 셀 이미징 데이터의 분석에서에서 빨간색과 녹색 형광 단백질의 대체 식 세포. 제어 셀 G1 에서 S 단계 세포 진행으로 interphase 동안 완전히 핵 녹색 형광을 전시에 완전히 핵 빨간색 형광을 전시에서 전환 해야 합니다. 세포는 유사 분열의 완성을 통해 녹색 형광을 전시 계속 해야 합니다. 유사 분열, 즉시 다음 셀 다시 한번 interphase 동안 완전히 빨간색 형광을 전시 한다. 참고: 형광 흔적49를 사용 하 여 단일 셀의 FUCCI 시스템에서 RFP 및 GFP 형광 강도 계량 방법 존재이 종종 필요는 없습니다 형광 색상 변화는 강력 하 고 눈으로 볼 수 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 유사 분열에 체포 하는 셀을 식별 하 고 그들 mitotic 미끄럼을 받을 때까지 3.4 및 3.6.2에 설명 된 대로 추적 합니다. 셀 G1 단계 (그림 2A-C) 빨간색 형광에 유사 분열 동안 녹색 형광을 전시에서 슬립 유사 분열 그리고 interphase로 다시 변경 됩니다.
	<ol>
<li>단계 대조 및 epifluorescent 이미징 사용 하 여 셀 (2D 그림) 그들의 세포 운명 평가 하는 눈으로 미 끄 러이 추적 합니다.<ol>
<li>세포 주기를 다시 입력 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 빨강-녹색 변화 G1/S 전환 (그림 2A)를 나타내는 FUCCI 시스템을 사용 하 여 형광 식에 의해 식별 됩니다.</li>
			<li>G1 세포 주기 검거를 받아야 하는 셀을 식별 합니다. 이 세포는 지속 되는 붉은 형광의 식으로 식별 된 > 24 h (그림 2B).</li>
			<li>Interphase에 셀을 식별 합니다. 이 세포는 파열/blebbing/축소 위상 대비 영상 (그림 2C)를 사용 하 여 셀에 의해 식별 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 비디오 분석 핵 파열의 주파수를 식별 하
<ol><li>RPE-1 셀 H2B GFP와 TDRFP NLS를 사용 하 여 평가 핵 파열. 위상 대비 영상, 뿐만 아니라 빨간색 형광 (TRITC)와 녹색 형광 (FITC) 이미지를 모두 획득. 파열을 시각화 이미지 마다 5 분을 취득 합니다. 참고: 셀 라인 있는 TDRFP NLS 효율적으로 가져올 핵으로 최소한의 세포질 형광으로 생성에 중대 하다.</li>
	<li>이미지 셀 3.4 통해 3.3 단계에서 설명한 대로. TDRFP-NLS 형광 신호 및 H2B GFP 공동 interphase 동안 지역화 해야 합니다. 유사 분열 (세포 단계 광학 및 염색체 응축 H2B GFP에 의해를 사용 하 여 반올림 하 여 시각)으로, 시 핵 봉투는 침착 하 고 TDRFP NLS 신호 세포질 (그림 3A) 될 것 이다. 유사 분열, 다음 핵은 딸 세포에 개혁 그리고 TDRFP NLS 신호 핵 될 것입니다.</li>
	<li>라이브 셀 이미징에 의해 후속 interphase 동안 딸 세포를 추적 합니다. 주변의 세포질에 핵 지역화 TDRFP NLS의 일시적인 버스트를 관찰 하 여 핵 파열 이벤트를 식별 합니다. 분 이내에, 핵은 복구 되 고 TDRFP NLS 핵 (그림 3A)에 relocalized 것입니다. 참고: 종종, 핵 DNA H2B GFP에 의해 시각 것입니다 볼 수 작은 bleb으로 파열 사이트 밖에 내 다.</li>
	<li>Interphase 동안 파열 이벤트를 받아야 하는 핵의 일부를 점수. 이 분수를 점수, 셀의 총 수는 파열 이벤트를 받아야 하는 셀의 개수를 추적 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

장기 라이브 셀 이미징의 가장 중요 한 측면은 몇 군데 되 고 세포의 건강을 하도록 하 고 있다. 세포 온도, 습도, 및 CO2 레벨에 관한 이하의 조건 등 최소한의 외부 환경 스트레스에 노출 될 필수적 이다. 로 셀 동작50영향을 알려져 있다 스트레스 이미징 photodamage 형광 여기 조명에서 제한 하는 것이 중요 이기도 합니다. Photodamage 제한 하는 것은 여러 가지 방법으로 다른<su...

반대로 mitotic 마약과 긴 단단한 종양의 다양 한 종류의 화학요법 식이요법에 사용 되었습니다 종종 위대한 효능1,2,3를 표시. Mechanistically, 이러한 약물 정상적인 mitotic 진행 하 고 급속 하 게 확산에 mitotic 체포 홍보 암 세포. 그러나, 셀 mitotic 체포에 대 한 응답에서 운명이 매우 변수: 셀의 일부 유사 분열에서 세포 죽음을 겪 습, 하는 동안 다른 유사 분열에서 나가고 interphase tetraploid 셀 (프로세스 라고 mitotic 미끄럼)으로 돌아갑니다4, 5,6,,78. 이러한 interphase 세포 apoptosis를 실행, 영구 세포 주기 검거를 받아야 하거나 입력할 수 있습니다 심지어 다시는 세포 주기4,,56,7,8,9 ,,1011. Interphase, 다시 약물 제거 다음 세포 주기를 입력에에 걸리고 여 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀은 암 세포 인구의 재 출현에 따라서 기여할 수 있습니다. 또한, 세포 유사 분열에서 슬립 tetraploid, 고 홍보는 종양 염색체 불안정 하 알려져 tetraploidy12,13,,1415재발. 세포 운명 안티 mitotic 약물 치료에 대 한 응답에서을 제어 하는 요소를 정의 하는 것은 따라서 현재 치료제를 최적화 하기 위해 중요 한입니다.
이 프로토콜에서 우리가 직접 관찰 하 고 장기간된 mitotic 체포 안티 mitotic 마약 paclitaxel에 대 한 응답에서을 받아야 하는 셀의 운명을 연구 하는 방법을 설명 합니다. Paclitaxel는 설립은 병원에서 치료는 유 방, 난소, 그리고 폐16,17,,1819, 의 그들을 포함 하 여 많은 종양 종류에 높은 효능 입증 20. 주목 나무의 껍질에서 파생 된 식물 알칼로이드는 Paclitaxel microtubules 안정화 및 따라서 그들의 통합과21,22를 방지. Paclitaxel에 의해 microtubule 역학의 감쇄 미치지 않습니다 G1 부터 G2 에서 세포 주기 진행 하는 동안 약 이어질지 않습니다 유사 분열 동안 스핀 들 어셈블리 검사점의 지속적인된 활성화 방해 하 여 kinetochore-microtubule 첨부 파일 (여기 심층에서 검토23,24)25. 결과적으로, anaphase 발병 paclitaxel 치료 세포와 장기 mitotic 체포에서 결과 방지 된다.
이 프로토콜 먼저 라이브 셀 이미징 실험에 mitotic 세포를 식별 하는 방법을 설명 합니다. 유사 분열은 두 눈에 띄는 셀 생물 학적 변경 부착 조직 배양 세포에서 구상 될 수 있다. 첫째, 염색체 핵 붕괴 직전 높은 응집 된다. 동안 종종 표준 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 감지, 염색체 응축 수 더 명확 하 게 검출 될 형광을 사용 하 여 태그를 레이블 염색체 (예: 붙일 표시 된 히스톤 단백질). 두 번째, mitotic 세포는 또한 셀 반올림에 기인 하는 극적인 형태학 변화에 의해 식별할 수 있습니다.
이 프로토콜 것입니다 다음 라이브 셀 이미징 접근을 사용 하 여 장기간된 mitotic 체포를 발생 하는 셀의 운명을 추적 하는 방법을 보여 줍니다. 세포 유사 분열에서 체포 중 세 가지 운명을 겪는 다. 첫째, 세포는 유사 분열 동안에 세포 죽음을 받을 수 있습니다. 이 현상은 죽어가는 세포 축소, bleb, 또는 파열 관찰은 가벼운 현미경 검사 법에 의해 쉽게 시각화 됩니다. 둘째, 세포는 유사 분열에서 종료할 수 그리고 interphase 염색체 분리 또는 cytokinesis 없이 다시 복귀, 프로세스 라고 mitotic 미끄럼. 염색체의 decondensation 또는 쉽게 mitotic 셀 병합이 프로세스를 식별 합니다. 유사 분열에서 슬립 셀도 종종 불규칙 한, 다중 lobed 핵을 표시 하 고 자주 여러 micronuclei5항구. 셋째, 세포 유사 분열에서 체포 anaphase 시작 하 고 긴 지연 후 유사 분열을 진행할 수 있습니다. 드문 높은 약물 농도에, 하는 동안이 동작 체포 셀 스핀 들 어셈블리 검사점을 만족 수 있습니다 또는 스핀 들 어셈블리 검사점은 부분적으로 약화 또는 결함이 있는 제안 합니다. Anaphase 발병 염색체 분리 및 후속 cytokinesis 라이브 셀 이미징 사용 하 여 구상 될 수 있다.
겪고 mitotic 미끄럼에 의해 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀의 운명을 추적 하 라이브 셀 이미징 방법은 또한 설명 합니다. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀 후속 interphase에, 튼튼한 G1 세포 주기 검거, 실행 하거나 다시 세포 분열4의 새로운 라운드를 시작 하는 세포 주기를 입력 합니다. Mitotic 미끄럼 다음 세포 주기를 다시 입력 하는 셀의 일부분을 FUCCI (형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기) 시스템을 사용 하 여 접근 방식을 설명 합니다. FUCCI G1/S 전환의 직접적인 시각화 가능 하며 장기 라이브 셀 이미징 생체 외에서 그리고 vivo에서26,27와 함께 사용 될 수 있습니다. FUCCI 시스템은 두 개의 붙일 레이블된 단백질, hCdt1의 잘린된 형태 활용 (chromatin 라이선스 및 DNA 복제 요소 1) 및 hGeminin, 누구의 수준 진동 세포 주기 위치에 따라. hCdt1 (빨간 형광 단백질을 융합) SCFSkp2 G1 단계 어디 그것 복제, DNA를 라이센스 하는 역할을 하지만 E3 유비퀴틴 리가 여 ubiquitinated 동안 높은 수준에서 현재 고 방지 하기 위해 S/G2/M 단계 동안 저하 다시 복제 DNA26의입니다. 대조적으로, hGeminin (녹색 형광 단백질에 융합), hCdt1의 억제제 인 레벨 피크 S/G2/M, 동안 이지만 E3 유비퀴틴 리가 APC에 의해 ubiquitinatedCdh1 G1 에 걸쳐 유사 분열의 끝에 타락 26. 셀 S/G2/M 동안 G1, 및 녹색 형광 동안 빨간색 형광을 전시로 FUCCI 세포 주기 단계, 간단한 형광 판독을 제공 따라서. FUCCI 시스템은 중요 한 사전 (bromodeoxyuridine 얼룩) 등 다른 방법을 통해 증식 세포, 셀 고정 필요 하지 않습니다에 대 한 필요 없이 단일 셀 이미징에 대 한 추가 허용 하기 때문에 약리 세포 인구를 동기화 하는 치료. 이 프로토콜에 설명 하지, 하지만 추가 라이브 세포 센서 또한 G128, DNA 리가 RFP29 및 PCDNA GFP30 센서 helicase B 센서를 포함 하 여 세포 주기 진행을 시각화 하기 위해 개발 되었습니다. S 단계, 및 최근 FUCCI-4 센서는 세포 주기31의 모든 단계를 감지합니다.
마지막으로, 핵 파열을 감지 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다. 최근 연구는 암 세포의 핵 봉투는 불안정 하 고, 하는 경향이 수 있도록 nucleoplasm와 혼합할 하 세포질의 내용을 밝혀 있다. 이 현상, 핵 파열 되 나 DNA 손상 및 타고 난 면역 반응32,33,,3435,36,37, 의 자극을 홍보할 수 있습니다. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. 핵 파열의 근본적인 원인은 불완전 특징이 유지, 핵 구조에서 변형 핵 파열42의 발생률이 증가 연관 알려져 있다. Paclitaxel 치료의 한 잘 알려진 효과 유사 분열; 다음 기 막히게 비정상적인 핵 구조의 생성 따라서, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 핵 파열을 계량 하는 방법을 설명 합니다, 또한 paclitaxel 치료 핵 파열 이벤트의 빈도 증가 하는 경우를 탐험 하면서. 핵 파열 (예: 탠덤 이합체 핵 지 방화 신호, TDRFP-NLS를 융합 하는 RFP의 반복) 세포질에 핵-타겟 형광 단백질의 관찰된 누설에 의해 감지할 수 있습니다. 이 누설 파열 이벤트의 간단한 정량 가능 눈으로 분명히 표시 됩니다.
이 프로토콜 인코딩된 무대와 autofocusing 소프트웨어 widefield epifluorescence 현미경을 필요 합니다. 인코딩된 단계 자동 소프트웨어 이미징 기간 동안 셀에 초점을 유지 하는 동안 정의 된 X-Y 좌표, 정밀 자동화 된 운동에 대 한 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 장비와 37 ° C에서 셀 5% CO2 습도 유지 필요로 분위기. 이 온도 내에서 전체 현미경을 포함 하 여 달성 될 수 있다 고 분위기 제어 인클로저, 또는 그 로컬 무대 최고 장치를 사용 하 여 온도 및 환경 유지. 이 프로토콜에 사용 되는 단계 대조 목표는 계획 형 석 10 x 0.30의 숫자 조리개와. 그러나, 20 X 목표 단일 초점 평면에서 두 둥근된 mitotic 그리고 평평 interphase 셀을 식별 하기에 충분 한 있습니다. 단계 대조를 수행 하는 경우 (이 방법에 설명 된) 대로 이미징, 커버 수 유리 또는 플라스틱. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하는 경우 빛의 도발은 방지 하기 위해 유리 커버를 사용 하는 것이 필수적입니다.

<table><tbody><tr><td>phenol red-free, DMEM:F12 media</td><td>Hyclone</td><td>SH3027202</td><td></td></tr><tr><td>10% fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin.</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gemini</td><td>50-753-3104</td><td></td></tr><tr><td>12-well glass bottomed imaging dish</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>TSZ Chem</td><td>RS036</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>NC0215085</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Chamber</td><td>In Vivo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7432000201</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>10 cm polystyrene tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Disposable Serological Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>5804R 15 amp Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>97007-370</td><td></td></tr><tr><td>1000 microliters Pipette</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>20 microliters Pipette</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipette Tips</td><td>Sharp</td><td>p1126</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipette Tips</td><td>Sharp</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Galaxy 170S</td><td>Eppendorf</td><td>CO17011005</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td>Integra</td><td>156401</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H117P1N4</td><td></td></tr><tr><td>Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H31XYZE</td><td></td></tr><tr><td>Andor Digital Camera</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>D10NLC</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements AR Software</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>SOLA LED Illuminator for Fluorescence</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>Ti-IVS-100</td><td></td></tr><tr><td>Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEP59391</td><td></td></tr><tr><td>Ti-C System Condenser Turret</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEL51000</td><td></td></tr><tr><td>Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEL56200</td><td></td></tr><tr><td>Te-C LWD Ph1 Module</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MEH41100</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MRH10101</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>MRH48230</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live-cell imaging to assess cell fate in response to paclitaxel

라이브 셀 이미징은 직접 시간의 연장된 기간 동안 단일 세포에서 생물 학적 현상을 시각화 하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 지난 10 년간, 새롭고 혁신적인 기술을 크게 라이브 셀 이미징의 실용성을 향상 했다. 세포는 이제 초점에 보관 하실 수 있습니다 하 고 지속적으로 유지에서 37 °C, 5% CO2 동안 몇 일 동안 셀 문화 조건 군데. 또한, 다른 실험 조건을 나타내는 여러 필드 볼 수 있습니다 취득 될 동시에, 따라서 높은 처리량 실험적인 데이터를 제공 하. 라이브 셀 이미징 직접 시각화 및 동적 셀룰러 이벤트의 시간 정량 함으로써 고정 셀 이미징에 상당한 이점을 제공 합니다. 라이브 셀 이미징 또한 그렇지 않으면 되었습니다 놓친 것 인구 기반 분석을 사용 하 여 단일 셀의 행동에 변화를 식별할 수 있습니다. 여기, 우리 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하기 위해 라이브 세포 이미징 프로토콜을 설명 합니다. Mitotically 여부를 시각화 하는 방법을 체포 유사 분열 또는 interphase에 다시 슬립에서 직접 셀 다 설명 합니다. 우리는 또한 형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기 (FUCCI) 시스템을 사용 하 interphase 셀 mitotic 미끄럼에서 태어난 세포 주기를 다시 입력 할 수 있는 부분을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 핵 파열 이벤트를 식별 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, H2B GFP를 표현 하는 RPE-1 셀 안티 mitotic 또는 차량 제어 (DMSO)로 치료 되었고 라이브 셀 이미징으로 분석. 분석은 100% 제어 mitotic RPE-1 세포의 유사 분열 (그림 1A, 1d)를 입력 한 후 anaphase 22 분의 평균을 시작 밝혔다. 대조적으로, RPE-1 셀 paclitaxel 치료 몇 시간 (그림 1D) 지속 깊은 mitot...

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

long-term-live-cell-imaging-to-assess-cell-fate-response-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.9K 조회수.  Boston University School of Medicine. 라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

비디오: Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

연구

암 연구학

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell lines or increasing its expression with overexpression cell lines. Transient and stable transfection are two methods that are often used for exogenous gene expression. Transient transfection is only useful for short-term expression, whereas stable transfection allows exogenous genes to be integrated into the host cell genome where it will be continuously expressed. As a result, stable transfection is usually employed for research into long-term genetic regulation. Here we describe a simple protocol to generate a stable cell line overexpressing tagged death receptor 3 (DR3) to explore DR3 function. We picked single clones after a retroviral infection in order to maintain the homogeneity and purity of the stable cell lines. The stable cell lines generated using this protocol render DR3-deficient HT29 cells sensitive to antimitotic drugs, thus reconstituting the apoptotic response in HT29 cells. Moreover, the FLAG tag on DR3 compensates for the unavailability of good DR3 antibody and facilitates the biochemical study of the molecular mechanism by which antimitotic agents induce apoptosis.

Establishing a stable cell line overexpressing a gene of interest to study gene function can be done by stable transfection-picking single clones after transfecting them via retroviral infection. Here we show that HT29-DR3 cell lines generated in this way elucidate the mechanisms by which death receptor 3 (DR3) contributes to antimitotics-induced apoptosis.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

의학

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

환자 유래 종양 오가노이드의 약물 평가를 위한 자동 Kinetic Imaging

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell lines. PDO models can be generated by culturing patient tumor cells in extracellular basement membrane extracts (BME) and plating them as three-dimensional domes. However, commercially available reagents that have been optimized for phenotypic assays in monolayer cultures often are not compatible with BME. Herein, we describe a method to plate PDO models and assess drug effects using an automated live-cell imaging system. In addition, we apply fluorescent dyes that are compatible with kinetic measurements to quantify cell health and apoptosis simultaneously. Image capture can be customized to occur at regular time intervals over several days. Users can analyze drug effects in individual Z-plane images or a Z Projection of serial images from multiple focal planes. Using masking, specific parameters of interest are calculated, such as PDO number, area, and fluorescence intensity. We provide proof-of-concept data demonstrating the effect of cytotoxic agents on cell health, apoptosis, and viability. This automated kinetic imaging platform can be expanded to other phenotypic readouts to understand diverse therapeutic effects in PDO models of cancer.

저자 스포트라이트: Developing Multiplexed Kinetic Assay for Organoid-Based Drug Response Analysis (오가노이드 기반 약물 반응 분석을 위한 다중 역학 분석 개발)

Patient-derived tumor organoids are a sophisticated model system for basic and translational research. This methods article details the use of multiplexed fluorescent live-cell imaging for simultaneous kinetic assessment of different organoid phenotypes.

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

요약

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라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라이브

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

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