Name: co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants at JoVE.com

우리는 유용한 토론 및 의견을 위한 왕 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 호우에는 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 보조금 번호 31570001)와 및에 의해 자연 과학 재단의 광 동성 광저우 시 (no. 2016A030313401 및 201707010024 부여) 지원

1. 뇌관 디자인 전략 및 DNA 증폭
<ol><li>DNA 파편의 분자 클로닝을 위한 뇌관 디자인. 뇌관 20 bp 유전자 특정 바인딩 시퀀스 및 인접 한 DNA 분자의 상호 보완적인 겹치는 순서 (예를 들어 표 1 참조)는 20 ~ 25 bp 5'-끝 오버행 시퀀스 구성. 참고: 각 DNA의 후속 어셈블리 조각, 다른 단백질 식 카세트의 결합 그리고 인접 한 중첩 시퀀스의 인식에 따라 모든 최종 식 벡터와의 통합.</li>
	<li>DNA 파편, 발기인, 형광 기자, 대상 유전자와 터미네이터를 포함 하 여 그들의 해당 뇌관으로 표준 PCR 반응에 의해 반 독립적인 단백질 식 카세트의 건설에 필요한 고 높은 증폭 피델 리 티 중 합 효소입니다. 참고: DNA 증폭에 대 한이 연구에 사용 된 서식 파일은 이전 연구15,,2223에서 파생 됩니다. 어 닐 링 온도 확장 시간 PCR 반응의 뇌관과 유전자 종속 있습니다.</li>
</ol>2. DNA 조각 어셈블리 및 단백질 식 카세트의 건설
<ol><li>DNA 전기 이동 법에 의해 1 라운드 PCR 제품의 품질을 검토 하 고 분 광 광도 계에 의해 계량. 1 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 저하 및 오염 발생 한 여부를 확인 합니다. PCR 제품의 OD260/OD280 1.6과 1.8 사이 이어야 한다.</li>
	<li>다른 DNA 파편을 혼합 (0.05-0.1 pmol 각 단편에 대 한) 5 µ L의 최종 볼륨을 새로운 PCR 튜브에. 참고: 혼합 DNA 분자를 위한 동일한 단백질 식 카세트 함께 한 PCR 튜브에. 그것은 연결 하는 데 필요한 DNA 분자의 증가 수 때문에 DNA 어셈블리의 효율성을 줄일 수 있기 때문에, 함께, 다른 식 카세트에서 DNAs를 혼합 하지 마십시오. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>5 x ISO 재고 버퍼 준비: 500 mM Tris HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 m m deoxynucleotide (dNTP); 50mm dithiothreitol; 25% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 8000; 그리고 5mm 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD).</li>
	<li>ISO 재고 버퍼, T5 exonuclease, 고 충실도 DNA 중 합 효소의 62.5 단위, Taq 중 합 효소의 5000 단위 단위의 7.5 x 1 mL 마스터 혼합물 400 µ L 5에서에서 x 2를 만들기 ( 재료의 표참조), 및 소독된 이중 증 류 H2o. 참고: 이것은 이전 연구24,25,의26;에서 적응 이러한 볼륨은 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>튜브 및-20 ° c.에 게 마스터 혼합물 x 2의 aliquot 100 µ L 주의: 빈번한 중지 및 재개 2 x 마스터 혼합물의 낮은 DNA 어셈블리 효율을 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>2 x 마스터 혼합물의 15 µ L 5 µ L DNA 혼합물에 추가 하 고 60 분 동안 50 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3. 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 표현 위한 벡터의 건설
<ol><li>전체 반 독립적인 단백질 식 카세트는 제품을 사용 하 여 2 차 PCR에 의해 증폭 (0.5-1.0 µ L) 템플릿과 바깥쪽 뇌관 (예를 들어, 1 FP35S 및 식에 대 한 1-RNOS로 1 라운드 등온선 어셈블리 반응에서 카세트 1)입니다.<ol>
<li>50 µ L 반응 볼륨에서 고 충실도 중 합 효소의 사용 1 단위 다음 30 사이클 (94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 및 2 분 동안 68 ° C), 뒤에 5 분 동안 68 ° C에서 최종 확장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 단백질 식 백본 벡터 pUC18 및 pCAMBIA1300, 4 단위 Sma 를 추가 하 여 단백질 과도 식 및 유전자 변환, 각각, 디자인 되는 선형화 최종 10 µ L 반응 볼륨으로 나 고 1-잠복기 25 ° c.에서 2 시간 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화.</li>
	<li>5 µ L의 최종 반응 볼륨에 단백질 식 카세트 및 선형화 마지막 벡터의 아데닌 DNA 분자를 혼합. 그런 다음 마스터 버퍼와 60 분 50 ° C에서 배양 x 15 µ L 2와 혼합 하 여 2 차 DNA 재결합을 수행 합니다.</li>
	<li>2 차 등온 재결합 반응의 최종 제품을 사용 하 여 유능한 대장균 을 변형 표준 절차27에 따르면 셀 (예: DH5α). 식민지 PCR와 DNA 시퀀싱에 의해 긍정적인 식민지를 다시 확인 합니다. 미니 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 대장균 에서 긍정적인 플라스 미드를 추출 하 고-80 ° c.에 저장 주의: 장기 저장을 위한 테 버퍼에 녹아 있는 플라스 미드 또는 두 배 증류수 H2O 대장균 변종에서 그들을 유지 하는 것 보다 더 안정.</li>
</ol>4. Biolistic-사격 중재 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 과도 공동 식
<ol><li>사격에 대 한 담배 BY-2 현 탁 액 셀과 애기 청소년 식물을 준비 합니다.<ol>
<li>두 번 주당 130 rpm에서 설정 하는 통에 25 ° C에서 subculturing에 의해 Skoog (MS)와 村 重 매체에서 문화 BY-2 셀. 70 밀리미터 압력가 필터 종이 통해 진공 펌프는의 조각에 경작 수집 30 mL 3 d BY-2 셀 40 mbar 진공 압력을 설정 하 여 필터링 합니다.</li>
		<li>다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 건조에서 세포를 방지 하기 위하여 여러 방울 추가 BY 2 셀 액체 문화 매체의 페 트리 접시에 필터 종이 배치 하기 전에 (다음 단계).</li>
		<li>그것에 새로운 배양 접시 (85 m m x 15 m m) BY-2 셀으로 필터 종이 전송.</li>
		<li>표면 70% (v/v) 에탄올 0.05% 포함 된 vortexing는 혼합물에 의해 애기 thaliana (열 0) 씨앗을 소독 10 분 트윈 20.</li>
		<li>벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 회전 s는 상쾌한을 제거 하 고 100% 에탄올과 씨앗 30 미 피 펫 멸 균 후드에 새로운 살 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 한 번 세척. 그런 다음, 씨앗을 건조 하 고 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.</li>
		<li>다음 설정 사용 하 여 식물 성장 챔버로 그들을 전송 하기 전에 48 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장: 16 h 120-150 µ m m-2 s-1 강도, 22 ° C. 8 h 어두운 빛
</li>
		<li>폭격의 효율성을 증가 하는 새로운 ½ MS 중간 접시의 중앙에 30mm 직경 원형으로 7-하루 오래 된 샘플 식물을 전송 합니다. 주의: 중복 식물 전송 하 고 새로운 ½ MS 접시에 그들을 배치 하지 마십시오.</li>
		<li>식물의 수 분을 유지 하 고 다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 식물 건조 방지를 조직 표면에 ½ MS 액체 매체의 몇 방울을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드 DNA와 금 입자 코트.<ol>
<li>와 동 골드 microcarrier 솔루션, 철저 하 게 3 분에 대 한 새로운 1.5 mL 튜브 준비.</li>
		<li>튜브와 소용돌이에 다음과 같은 솔루션을 순차적으로 추가: 25 µ L (1.5 m g) 골드 입자, 소용돌이 10 s; 25.46 mg/L spermidine, 소용돌이 10 s;의 10 µ L 5 1µg / µ L 플라스 미드 DNA의 µ L, 소용돌이 3 분; 25 277.5 mg/L CaCl2 솔루션의 µ L, 소용돌이 1 분. 주의:이 단계 동안 vortexing를 유지.</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않고 5 s와 신중 하 게는 상쾌한 밖으로 피 펫에 대 한 최대 속도 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하는 골드 microcarriers 아래로 회전 합니다. 절대 에타 놀의 200 µ L로 세척 하 고 다시 일시 중단 소용돌이 의해 펠 릿 5-10 s. 스핀 다운 5 s와 제거는 에탄올에 대 한 최대 속도.</li>
		<li>절대 에타 놀 및 aliquot 6 µ L 입자 현 탁 액 3 macrocarriers의 중간에 18 µ L에 다시 금 입자를 일시 중단 합니다. 그들이 건조 한 공기 보자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입자 사격을 통해 식물으로 DNA를 전송.<ol>
<li>다음으로 입자 배달 시스템 설정: 1100 psi, 28 mm Hg 진공, 1 cm 간격 거리 및 9 cm 입자 비행 거리.</li>
		<li>세 가지 다른 위치에서 세 번에 대 한 한 중간 접시에 셀/식물을도 배 하 고 사격 직후 어둠의 셀/식물을 유지. 주의: 시스템에 고압 가스 및 고속 입자의 협회 때문에 입자 배달 시스템을 작동할 때 안전 안경 착용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 신호 관찰 6 ~ 72 시간에 대 한 식물 성장 챔버에 어둠 속에서 포 격하 셀/식물을 유지. 24 h 어두운와 22 ° C에 식물 성장 챔버를 설정 주의: 식 효율과 형광 신호 강도 발기인, 유전자 및 식물/조직-의존 합니다.</li>
</ol>5. 공동 Agrobacterium에의해 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 안정적인 유전자 변형 애기의 생성-변화를 중재.
<ol><li>Thaw Agrobacterium 유능한 세포 (PMP90) 얼음에 30 분 동안 대기 후 2 µ L 이진 벡터 (100-200 ng) (준비 위) 유능한 세포에 추가. 10 분 동안 얼음에 혼합물을 앉아.</li>
	<li>미리 냉장된 0.1 cm electroporation 베트로 혼합물을 전송 합니다. 멧 electroporation 시스템에 삽입 하 고 다음 설정으로 electroporation 수행: 1.6 k v, 600 옴, 25 µ F.</li>
	<li>electroporation 직후는 베트에 SOC 액체 매체의 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 세포를 플라스틱 120 분 200 rpm에서 수평 궤도 통에 28 ° C에서 품 어.</li>
	<li>5 분 동안 실 온에서 2,348 x g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한의 대부분, 부드럽게 다시 피 펫 팁 일지도 셀을 일시 중단, 50 mg/L Hygromycin B를 포함 하는 파운드 접시에 그들을 확산 그리고 28 ° C에서 2-3 일 동안 품 어.</li>
	<li>애기 thaliana Col 0 식물에서 Agrobacterium, 이전에 설명한 대로 꽃 딥28 메서드에서 여러 단백질 식 카세트와 통합 이진 벡터 pCAMBIA1300 포함 된 변환 안정적인 유전자 변형 식물을 생성 합니다.</li>
	<li>0.05%를 포함 하는 70% (v/v) 에탄올과 혼합 하 여 유전자 변형 애기 씨앗의 표면 소독 트윈 20. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 10 분 회전을 위해 소용돌이 s, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 30 한 번 100% 에탄올과 씨앗 s.</li>
	<li>살 균 후드에서 무 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 플라스틱. 그 후, 건조 한 공기 하 고 긍정적인 progenies 심사 Hygromycin B를 포함 하는 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.</li>
	<li>2 일 동안 4 ° C에서 번호판을 품 어. 그런 다음, 전송 그들 문화와 식물 성장 챔버에 7 일.</li>
	<li>형광 현미경 형광 신호를 확인 하 여 7 일 오래 된 생존 청소년 식물을 선택한 다음 추가 homozygous 식물의 심사에 대 한 토양에 식물을 전송 합니다.</li>
</ol>6. 제약 치료
<ol><li>약 제 치료에 대 한 세포 또는 식물 부 화 하기 전에 그것의 적절 한 작동 농도 액체 MS 매체에서 각 약물을 희석.<ol>
<li>Wortmannin 치료: DMSO에 wortmannin 분말을 용 해 하 여 1 m m wortmannin의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 16.5 µ M wortmammin를 포함 하는 액체 MS 매체로 청소년 식물 또는 식물 세포를 전송 및 이미징 하기 전에 30-45 분 동안 품 어.</li>
		<li>Brefeldin A (BFA) 치료: DMSO에 BFA 분말을 용 해 하 여 1mm BFA의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 식물 세포 또는 식물 청소년 10 µ g/mL BFA 이미징 하기 전에 30-45 분을 포함 하는 액체 MS 매체에 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. confocal 현미경 이미징 및 단백질 Subcellular 공동 지역화 분석
<ol><li>젊은 식물 또는 기존의 유리 슬라이드에 현 탁 액 셀 전송 및 부드럽게 표준 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 이미징에 대 한 상단 커버 슬라이드를 입었다. 다음 설정을 사용 하 여: 63 X 물 목표 (한다 1.4), 0 배경, 700 증가, 0.168 mm 픽셀 크기, 및 광 전 증폭 관 관 탐지기. 485에서 단백질 GFP 태그 자극 nm 525에서 형광을 검출 하 고 nm. 514에 자극 RFP 태그 단백질에 대 한 nm 575에 감지 nm.</li>
	<li>피어슨 Spearman 상관 (PSC) 공동 지역화는 앞에서 설명한8플러그인으로 이미지 J 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 형광 신호의 공동 지역화 비율을 계산 합니다. 피어슨 상관 계수 또는 Spearman의 순위 상관 관계 계수 (그림 4) 결과에 표시 됩니다. 생산된 r 값 1-1에서 될 것입니다. 반면 + 1과-1 완전 긍정적이 고 부정적인 상관 관계, 각각, 2 개의 신호의 0, 2 개의 신호 감지 상관 관계가 보여줍니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+machinery+of+live+cells.">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way.">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells.">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li><li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall.">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation.">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li><li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Expression+Systems+in+Plants:+Potentialities+and+Constraints.">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li><li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize.">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246 (2017).</li><li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method:+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies.">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li><li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization,+movement+and+interactions+in+planta.">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li><li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells.">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li><li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes.">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li><li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions.">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression,+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants.">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li><li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+red+fluorescent+protein+eqFP611:+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants.">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptors+(VSRs)+and+secretory+carrier+membrane+proteins+(SCAMPs)+are+essential+for+pollen+tube+growth.">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li><li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptor+(VSR)+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes.">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li><li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR.">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li><li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination.">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li><li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly.">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li><li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha.">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells.">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li><li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated,+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells.">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li><li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells:+evidence+for+two+pathways.">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li><li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression,+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus,+Aspergillus+nidulans.">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li><li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+gene+silencing+regularized.">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li><li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants.">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li><li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing.">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li><li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+for+all:+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants.">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).</li><li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops.">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li><li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+&amp;#34;purple+endosperm+rice''+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system.">Development of &amp;#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li><li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+formation,+evolution,+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes.">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 튼튼하게 공동 식물에 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 새로운 방법 설명 했다. 그것은 과도 식 및 유전자 변환 사용할 수 있으며 현재 형광 단백질 기반 바이오 이미징, 분자, 및 생 화 확 적인 응용 프로그램 및 기술9,10,13와 호환 . 또한, 그것은 단백질 공동 식에 대 한 몇 가지 개별 식 플라스 미드를 사용 하는...

공상 형광 성 융해 단백질 세포 역학 및 subcellular 지 방화를 연구 하 고 그들의 생리 적 기능 및 작동 메커니즘1,2, 양지 유용한 도구로 간주 되고있다 3 , 4. 공동 익스프레스 spatiotemporal 근거, 분포, 그리고 셀4 endomembrane 시스템 내에서 복수 위해 문제의 단백질으로 잘 알려진 세포 기관이 기자 단백질에 특히 유리 하다 , 5 , 6 , 7 , 8.
공상 형광 성 융해 단백질은 과도 식 통해 식물 및 안정적인 유전자 변환, 그들의 각각 장점과 제한9,,1011에 표현할 수 있습니다. 단백질의 과도 식 biolistic 폭격-, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하는 편리한 접근 이다-, 또는 protoplasts 및 AgrobacteriumDNA 과도 식 electroporation 중재-중재 하는 잎에 침투 그대로 식물 세포, 그림 1A, B12,13,14,,1516와 같이. 그러나, 단일 식물 세포에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식 여러 독립 식 플라스 미드의 혼합물을 요구 한다. 따라서, 여러 개의 플라스 미드 단백질 공동 식 식물에 대 한 고용의 단점은 동시에 동일한 셀 단일 플라스 미드에 비해 입력 몇 plasmids의 극적으로 감소 된 우연 저수준 공동 식 그리고 각 유형의 셀17,18에 전송 되는 플라스 미드의 미친 듯이 임의의 금액으로 인 한 단백질 식 레벨의 변형입니다. 또한, 그것은 기술적으로 단일 Agrobacterium 단백질 공동 식9,,1011에 대 한 여러 독립 식 플라스 미드를 도전. 따라서, Agrobacterium-담배의 침투에 의해 과도 식 나뭇잎 중재 단백질은 그림 1B와 같이 한 번에 한 플라스 미드를 표현. 반면, 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 식물의 세대 보통 Agrobacterium 이진 변환 벡터를 전달 함으로써 이루어집니다. 그러나, 유전자 이동 및 식물 게놈으로 삽입 중재 이진 벡터는 단일 형광 성 융해 단백질 (그림 1B)9,,1012표현만 합니다. 여러 공상 형광 단백질을 동시에 표현 하는 유전자 변형 식물 생성 여러 라운드를 유전 교차점 및 심사, 공동 표현 될 유전자의 숫자에 따라 년 개월에서 걸릴 수 있습니다 필요 합니다.
식물에 있는 여러 단백질의 공동 식에 대 한 단일 식 벡터 이전으로 보고 되었습니다 고용 연구19,,2021. 그러나, 효소 소화의 여러 라운드 및 DNA 분자 및 백본 벡터 DNA 결 찰 일반적으로에 단백질 공동 식 또는 오버 식에 대 한 최종 플라스 미드의 생성. 여기, 우리는 공동 식물에 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 새롭고 강력한 방법을 개발 했습니다. 모두 과도 식에 대 한 식물에 여러 단백질 공동 식와 영광 패션에 안정적인 변화는 매우 효율적이 고 편리한 방법 이다. 그것은 단백질 공동 식에 대 한 여러 기능적으로 독립적인 단백질 식 카세트를 포함 함으로써 기존 방법의 단점을 극복 하는 하나의 벡터를 사용 합니다. 또한, 그것은 매우 다양 한 시스템은 dna에서 조작 및 어셈블리 DNA 소화 및 결 찰의 추가 단계 없이 최적화 된 간단한 원스텝 반응에 의해 달성 된다. 작동 원리는 그림 2에 나와 있습니다. 또한, 그것은 공상 형광 성 융해 단백질을 기반으로 하는 현재 세포, 분자, 및 생 화 확 적인 접근을 완벽 하 게 호환입니다.

<table><tbody><tr><td>KOD-FX Polymerase</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold microcarrier particles</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Rupture disk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Stopping screen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He particle delivery system</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780&amp;amp;7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Power Supply</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants

단백질의 subcellular spatiotemporal localization(s)에 대 한 정보는 세포에서의 생리 기능을 이해 하는 중요 한. 형광 단백질 및 형광 성 융해 단백질의 생성 격렬 하 게 사용 되었습니다 효과적인 도구로 직접 단백질 지 방화 및 셀에서 역학을 시각화. 특히 관심의 단백질와 공동 식 후 잘 알려진 세포 기관이 마커를 비교 유용 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 단백질 공동 식 식물에 대 한 고전적인 접근 일반적으로 여러 개의 독립 식 플라스 미드를 포함 하 고 따라서 낮은 공동 식 효율, 식 수준 변화, 그리고 높은 시간을 포함 하는 단점을가지고 유전자 교차 및 심사 비용입니다. 이 연구에서 우리는 식물에 여러 공상 형광 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 여러 개의 반 독립적인 표현 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 사용 하 여 기존 방법의 한계를 극복 했다. 각 단백질 식 카세트 자체 기능 단백질 식 요소를 포함 하 고 따라서 그것은 유연 하 게 다양 한 식 수요에 맞게 조정할 수 있다. 또한, 그것은 간단 하 고 편리 하 게 수행 하는 어셈블리 및 조작 DNA의 추가 소화 및 결 찰 단계 없이 최적화 된 원스텝 반응을 사용 하 여 식 플라스 미드에 조각. 또한, 현재 파생 된 형광 단백질 바이오 이미징 기술 및 응용 프로그램, 무서 워, BiFC 등 완벽 하 게 호환 됩니다. 방법의 유효성 검사,으로 우리 붙일 융합 공동 급행 vacuolar 정렬 수용 체와 분 비 캐리어 막 단백질이 새로운 시스템을 채택. 결과 그들의 관점의 subcellular 지 방화는 과도 식과 유전자 변형 식물에 의해 이전 연구에서와 같이 보여.

식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. 그것은 종래의의 장벽을 통해 휴식 같이 그림 1A, B를 통해 접근 단백질 공동 식에 여러 개의 분리 된 플라스 미드를 사용할 과도 식 또는 안정적인 유전자 변환. 이 새로운 방법에서는, 우리는 단백질 공동 식 한 번에 (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants at JoVE.com

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K 조회수.  South China Agricultural University. 공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

비디오: Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

연구

환경과학

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

유전학

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

면역학 및 감염병학

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

생물학

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...