Name: novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
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이 작품은 두뇌 한국 21 플러스 프로젝트 의료 과학, 연세대에 지원 됩니다. 또한,이 작품은 국립 연구 재단의 한국 (NRF-2017R1D1A1B03030315)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 절차는 연 세 대학 의과대학에서 적절 한 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 연 세 대학 대학의과 대학에 실험실 동물 관리 위원회의 지침에 따라 모든 실험 동물을 희생 한다.
1입니다. 시 약의 준비
주의: Paraformaldehyde (PFA), 아크릴 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 개인 보호 장비 (PPE; 실험실 외 투, 장갑, 보호 안경)와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>4% 아크릴 (금주 모임) 솔루션 (A4P0): 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 180 ml 40% 아크릴 솔루션의 20 mL를 추가.</li>
	<li>0.25% 버지니아-044 솔루션: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane의 0.5 g 추가] dihydrochloride (VA-044) 파우더 200 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를. 버지니아-044 분말은 실내 온도에 저장 될 수, 그러나 PBS에 가용 화 시 4 ° C에 저장 되어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 솔루션 실험에 필요한 만큼만 준비 합니다.</li>
	<li>협정 칵테일 솔루션: 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 225 mL에 아크릴의 10 g를 추가 하 고 4%와 200 mL에 양을 맞추십시오 PFA. 사용 전에 40 ml 50 mL 원뿔 튜브에 혼합물의 버지니아-044 분말의 100 mg을 추가 합니다.</li>
	<li>협정 솔루션 버퍼 지우기: 0.1 M PBS의 350 mL에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 40 g을 추가 하 고 0.1 M PBS 가진 500 mL에 양을 맞추십시오. MPACT 삭제 솔루션, 솔루션 버퍼를 삭제 하는 협정에 0.5% α-thioglycerol를 추가 합니다.</li>
	<li>이 연구에 사용 된 마우스 했다 2 주 된 BALB 남성 쥐; 이 연구에 사용 된 쥐 2 주 오래 된 남성 SD-쥐 했다.</li>
</ol>2. 마 취와 관류 수술
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
<ol><li>26-게이지 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 zoletil의 30 mg/kg으로 병원 체 무료 객실에 동물 anesthetize 5 동물 모니터링-10 분.</li>
	<li>동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단 마 취의 깊이 결정 하는 발가락 핀치 응답 메서드를 사용 합니다. 응답을 확인 합니다. 주: 마우스와 쥐 수술을 포함 하는 다음 단계 이전 연구11에 사용 되는 유사한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>5-6 cm 절 개 외피와 복 벽을 통해 흉 곽 아래를 확인 합니다.</li>
	<li>곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 미리 절 개의 사이트를 찾으려고 흉부 지역 palpating 횡 경 막에 절 개를 만들기 위해.</li>
	<li>절 개 흉 흉 막 캐비티를 폭로 전체 길이 걸쳐 확장.</li>
	<li>조심 스럽게 폐 치환. 쇄 골까지 흉 곽을 통해 상처를 확인 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여, 좌 심 실의 후부 끝에 작은 절 개를 확인 합니다. 오름차순 대동맥, 컷된 심 통과에 무뚝뚝한 또는 올리브 밀고 관류 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>바늘을 장악 하 고는 hemostat로 마음을 클램핑 하 여 누설을 방지. 또는, 수정된 hemostat 사용 하 여 바늘 팁 주위 대동맥을 클램프.</li>
	<li>오른쪽 아 트리 움, 하강 대동맥에 최소한의 피해를 보장 하기 위해 돌에 큰 절 개를 확인 합니다. 쥐 관류에 대 한 준비가 지금 이다.</li>
</ol>3. 전체 관류와 쥐의 해 부
주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
참고: 다음 전체 관류 단계는 비슷합니다 우 외에 의해 이전 연구에서 사용 되는 프로토콜. (2016) 10 , 11.
<ol><li>심장의 오른쪽 아 트리 움 어떤 기포를 소개 하지를 돌보는 18 게이지 주사 바늘에 연결 합니다.</li>
	<li>50 mL 주사기를 사용 하 여, 신속 하 고 균일 하 게 감기 0.1 M PBS 솔루션 포함 하는 헤 파 린 (10 단위/mL)의 50 mL 펌프.</li>
	<li>연동 펌프 튜브에 18-게이지 바늘을 연결 합니다.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 헤 파 린 (10 단위/mL)에 포함 된 감기 0.1 M PBS 솔루션의 200 mL와 함께 씻으십시오.</li>
	<li>10 mL/min의 순환 속도에 찬 4 %PFA 솔루션의 250 mL와 함께 수정. 쥐가이 단계에서 뻣 뻣 한 되어야 합니다.</li>
	<li>수집 하 고 처리를 위한 나머지 PFA 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>협정, 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말의 냉장 협정 칵테일 솔루션 조직 18 게이지 바늘, perfuse 및 머리와 척추를 제거. 코에는 목에서 정중 선 절 개 하 여 두개골을 노출 합니다. 이 추가 관류 단계 psPACT와 mPACT 방법;에 대 한 필요 하지 않습니다. 고정, 후 즉시 머리와 척추를 분리 하 고 두개골을 노출.</li>
	<li>어떤 잔여 목과 척추 근육을 제거 하 여 두개골의 기지를 노출 합니다.</li>
	<li>벗 겨 두개골을 rongeurs와가 위를 사용 합니다. 뇌와 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>4%에서 조직 저장 PFA 4 ° c; 조직 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 하이드로 겔 단위체 주입 및 쥐 및 마우스 CNS의 중 합
주의: 아크릴, SDS, α-thioglycerol 및 PFA irritants 있으며 따라서 처리 연기 후드와 적절 한 오 줌.
<ol><li>
협정 (패시브 기술 삭제)
	<ol>
<li>분리 하 고 전체 CNS (뇌와 척수) 고정된 쥐 및 쥐에서 냉장된 협정 칵테일 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말 및 24 h. 확인 조직 s에 완전히 몰입은 4 ° C에서 스토어의 솔루션을 포함 하는 50 mL 튜브에 문화 olution입니다.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 질소 탱크에 연결 된 하이브리드 시스템에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함: 37 ° c 시스템 설정 신선한 냉 (4 ° C) 협정을 포함 하는 50 mL 튜브에 조직 전송 칵테일 솔루션 관 모자, 연결한 다음 진공에 설정.</li>
		<li>유해는 하이드로 겔, 3 h, 또는 중 합 완료 될 때까지 떨고 인큐베이터 (150 rpm, 37 ° C)에서 샘플을 포함 하는 튜브를 배치 합니다.</li>
		<li>압 지를 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 제거 나머지 polymerized 히드로 조직을 둘러싼.</li>
		<li>50 mL 튜브 청소 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS)를 포함 하는 조직 전송.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 전체 선명도 달성 마우스 CNS 약 20 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (별도 수동 삭제 기술 처리)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>조직 전송 50 mL 튜브 4% 포함 된 PFA, 및 24 h. 4 ° C에서 저장소 확인 조직은 정착 액에 완전히 잠기 다.</li>
		<li>0.1 m M PBS에서 1 시간에 대 한 고정된 조직을 세척 하 고 A4P0 솔루션 (0.1 m M PBS에 4% 아크릴)을 전송. 24 h에 대 한 37 ° C에서 저장소.</li>
		<li>0.1 m M PBS에 씻어 5 분에 대 한 조직.</li>
		<li>0.25%에서 조직 담가 0.1 M PBS에 버지니아-044. 6-24 h, 37 ° C에서 저장 하 고 신선한 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션을 전송.</li>
		<li>10 분 휴지를 사용 하 여 젤 교 잡에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함 질소 탱크에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 시스템: 조직 신선한 감기 (4 ° C)를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션, 튜브 캡과 연결. 진공을 켭니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS) 삭제.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 품 어. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 17 일 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (수정된 수동 삭제 하는 기법)
	<ol>
<li>뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.</li>
		<li>단계-4.2.2 4.2.8 psPACT 프로토콜의 수행 합니다.</li>
		<li>전송 하는 조직 솔루션을 지우기. 협정 및 psPACT 프로토콜 달리 mPACT 0.5% α-thioglycerol 0.1 M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS 이외에 구성 된 개간 솔루션이 필요한 note. Α-thioglycerol는 더 신속 하 고 효과적으로 조직을 취소 하는 데 도움이 유엔 브라우닝 에이전트. 조직의 솔루션에 완전히 포장 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 2 주 걸립니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 굴절률 매칭과 허가 CNS의 Immunostaining
참고: n바퀴 (Nycodenz 기반 굴절률 매칭 솔루션) 0.8 g/mL Nycodenz 분말 30 mL 기본 버퍼 (0.01% 나트륨 아 지 드와 0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 트윈-20)에 녹아 있는 이루어져 있다. 솔루션 파우더의 적절 한 solvation 수 있도록 인큐베이터 떨고 37 ° C에 배치 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>0.1%에서 조직 품 어 2 h, 0.1 m M PBS에 Triton X-100 다음 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1 m M h 6에 대 한 PBS에와 차단.</li>
	<li>PBST에 세 번 섹션을 세척 (0.1 %0.1 M PBS에 트윈-20) 2 헤에 대 한 일에 대 한 섹션 주요 항 체 (이 경우, 혈관 얼룩는 반대로 토끼 PECAM CD31 항 체)에 얼룩.</li>
	<li>2 일에 대 한 2 차 항 체 (이 경우는 염소-토끼 IgG Cy3 형광 공액)에 2 %BSA 섹션을 얼룩.</li>
	<li>워시 분류 2 h, PBST에 세 번 조직 및 저장소 15 ml에서 n바퀴 2-10 일.</li>
	<li>이미징, 전에 35 또는 60 m m 조직 문화 접시에 레이블이 조직 n바퀴의 작은 금액을 이동 합니다. 접시의 아래쪽 가장자리 주위 실리콘 수정.</li>
	<li>신선한 n바퀴의 1.5-2 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>6. 이미지 처리
<ol><li>타일 confocal 레이저 스캐닝 microscopewith 10 배 확대를 사용 하 여 검색 이미지 삭제 조직의 취득 ( 재료의 표참조). 조직 Cy3 표시의 사용 하 여 550-600 nm의 파장.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

수동, 전기 이동 비 추출 방법에 고용 하는 동안 협정 크게 이전 조직 삭제 선명도2,3,,47 같은 방법으로 달성 일관성 향상 , 8, 기술은 여전히 가장 눌러 최대한 조직 선명도12를 달성 하는 데 필요한 시간의 길이 여러 가지 단점을 맺는 다. 현재 연구에서 선물이 조직 조직 무결성 및 구조6,10유지 하면서 지우기에 필요한 시간을 크게 줄일 수정된 협정 프로토콜. 또한, 처음으로 우리 조직의 전체 CNS 조직 및 더 높은 순서 설치류 모델 쥐10프로토콜 삭제 응용 프로그램을 보여 줍니다.
특히, psPACT 4% 아크릴에 0.25% 샘플 처리를 포함 한다 버지니아-044 하이드로 겔 형성 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 mPACT 추가 psPACT 시 빌드 동안 0.5% α-thioglycerol10솔루션 삭제 8 %SDS 보충. Unpolymerized 히드로 단위체 협정;와 투명도 달성 한 후 최종 조직의 무결성을 손상 시킬 수 있는 조직을 둘러싸고 있는 나머지를 제거 하기 위한 필요 방지 아크릴 및 후속 버지니아-044 단계 분리 또한, 최대 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간이 크게 줄어듭니다. Α-thioglycerol mPACT 메서드에서 추가의 추가 가속 청소13, α-thioglycerol는 원래 협정 방법에만 약을 사용 하 여 액세스 되는 조직 영역을 취소 하는 데 도움이 유엔 브라우닝 에이전트 처리 7 , 8 , 9.
그 동안 psPACT 원래 협정 프로토콜을 기준으로 광 투명성 향상, mPACT 가장 효율적으로 허용 한다 개간 그리고 두 전부의 후속 고해상도 이미징에 대 한 협정, psPACT 및 설치류 조직에 mPACT의 비교 시연 포유류 장기 고 그림 2, 그림 3, 그림 4에서 시연으로 sectioned 조각. MPACT 입증 방법 키 다른 두 개간 방법에 비해 투명성, 효율성, 그리고 조직 안정성에 차이를에서 처리 된 장기의 α-thioglycerol-기반 지질 희미하게. 이 특히 면역 형광 검사 confocal 현미경 검사 법 (그림 5DE)을 통해 혈 맥 관 구조 형태에 관하여 처리 기관의 급속 한 3D 분석에 대 한 허용.
Α-thioglycerol 개간 SDS 기반 솔루션의 추가 가속 광학 투명도 대 한 중요 한 동안, 그것은 또한 약간 조직 취약성을 증가 하 고 후 처리 손상에 더 취약 하 게. 그것의 효율성에 관하여 mPACT의 명확한 우월 능가이 제한; 그럼에도 불구 하 고, 작업은 현재 행해지고 최대한 개간으로 달성 될 수 있도록 보장 하기 위해 조직의 무결성의 비용을 최소화.
따라서, 우리의 결과 포유류 장기, 신경 네트워크, 혈 맥 관 구조, 조직 매트릭스 아키텍처 하 되이 국한 되지 않음 등의 기능과 해 부 특징의 3 차원 분석을 제공 하기 위한 강력한 수사 도구로 mPACT를 설정 합니다. MPACT 질병, 조직 손상, 발달 기형, 암, 신경 등의 이상에 기여 하는 더 높은 순서 생물 학적 메커니즘의 조사에 특히 유용할 수 있다고 앞으로 이동, 질병14,15,,1617. 질병에 관련 된 미세한 세포 메커니즘의 연구와 함께, mPACT는 얼마나 다양 한 이질적인 질병의 메커니즘을 관찰된 표현 형을 상호 작용 이해, 다중 스케일을 제공 하.

과학 및 임상 조회의 근본적인 목적은 관련 기관의 구조와 기능;의 완벽 한 이해를 달성 그러나, 포유류 장기의 상당히 복잡 한 자연 완전히이 목표1을 달성 하는 방 벽으로 수시로 제공 합니다. 명확성 (명확한 지질 교환 아크릴 때 교배 엄밀한 이미징 호환 Tisssue-하이드로 겔)2,3,4, 건물 그대로 조직에서 히드로 아크릴 기반 하이브리드 포함, 달성 다양 한 기관, 뇌, 간, 그리고 비장를 포함 하 여5그들의 구조적 무결성 유지 하면서 광학 정리. 선명도 시각화 뿐만 아니라 복잡 한 셀룰러 네트워크 및 단면 필요 없이 조직 형태학을 정밀 하 게 해 부를 기회에 따라서 사용할 수 있습니다.
조직 허가 달성 하기 위해 선명도 샘플의 지질 콘텐츠 제거 하 전기 이동 방법을 사용 합니다. 물리적으로 안정적인 조직-히드로 하이브리드 생산에 대 한 선명도 지적 하는 동안 연구 전기 이동 조직 개간 (등) 방법의 사용 조직 품질, 브라우닝, epitope 손상을 포함 한 변수 결과 산출 하 고 단백질 손실5,6. 이러한 문제를 해결 하려면 수동, 이온-세제 기반된 delipidation 기술 등 치료를 대체 하는 협정 (수동 선명도 기술) 등 수정된 프로토콜 개발된7,,89되었습니다. 그러나 결과에 더 일관성을 달성에 불구 하 고, 협정 최대한 정리를 얻기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. 또한, 이러한 기술의 아무도 아직 적용 되었을 전체 CNS 양식 또는 쥐 및 기니 피그와 같은 큰 설치류 모델.
현재 연구는 psPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정), 전체 CNS와 마우스와 쥐 모델10에 내부 장기의 빠른 통관을 촉진을 위한 새로운 방법론을 제안 하 여 이러한 한계를 해결 하고자 합니다. 특히, psPACT 처리 조직 4% 아크릴에 0.25% 하이드로 겔 형성; 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 버지니아-044 mPACT는 기본적으로 동일한 단계를 수행 하지만 키 시 약으로 서 0.5% α-thioglycerol와 개간 SDS 기반 솔루션을 보완. 두 기술을 마구 크게 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 내 생 적인 조직 및 cerebrospinal 순환 시스템. 원리의 증거로, 허가 조직10혈관 패턴 분석에 confocal 현미경 검사 법의 사용을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Clearing solution</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>40% Acrylamide Solution</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&amp;acute;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymerization (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Clearing solution (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, Polymerization</td></tr><tr><td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Buffer</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Solution transfer</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Clearing tube</td></tr><tr><td>35 mm Cell culture dish</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anesthetize&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Blotting paper for gel removal</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

선명도의 개발 이후 기술 삭제 bioelectrochemical 수 있는 3 차원 표현 형 매핑 투명 한 조직 내의 다양 한 큐빅 (명확 하 고 가리지 뇌 이미징 등 새로운 개간 방법론에 대 한 칵테일 및 전산 분석), 스위치 (상호 작용 시간의 시스템 제어) 및 화학 제품의 활동, 지도 (확대는 프로테옴의 분석), 및 협정 (수동 선명도 기술)에 대 한 기존의 툴킷 확대 설립 되었습니다 생물학 직물의 현미경 분석입니다. 현재 향상 하 고 전체 중앙 신경 시스템 (CNS), 신장, 비장, 그리고 전체 마우스 배아를 포함 하 여 그대로 설치류 조직의 배열에 대 한 원래 협정 절차를 최적화 하는 것을 목표로 공부 합니다. PsPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정) 되 나, 이러한 소설 기법 셀 회로 고 그대로 정상 및 병 적인 조직에서 subcellular 구조 시각화의 높은 효능 수단을 제공 합니다. 다음 프로토콜에서 우리는 psPACT 및 mPACT 통해 그들의 구조적 무결성의 최소한의 침공으로 최대한 조직 허가 달성 하는 방법에 세부, 단계별 개요를 제공 합니다.

최적화 된 수동 청소 기술을 사용 하 여 전체 CNS의 투명 한 모델의 생성
마우스와 쥐 전체 CNS 조직의 광 정리 빠른 속도로 다양 한 수동 개간 기법 (그림 1)를 사용 하 여 달성 되었다. 조직 시간이 지남에 비운의 회로도 그림 2A에 표시 됩니다. 원래 협정 메서드와 달리 psPACT (프로세스 별도 협정) 히드로 하이브리드를 형성 하기 위하여 4% 아크릴 아 미드 (A4P0)와 0.25% 버지니아-044 초기자 솔루션 샘플을 두 개의 별도 단계에서 치료 포함 됩니다. mPACT (수정 된 협정) psPACT 8 %SDS 지우기 0.5% α-thioglycerol 솔루션을 보완 하 여 더욱 향상 시켰습니다. 협정, psPACT, 그리고 하루 14 mPACT 통해 처리 샘플 비교 되며 그림 2B에 제시.
이전 연구에서 우리가 보고 그 동안 원래 협정 프로토콜 달성 23 일, psPACT에에서 광 정리 및 mPACT 전체 마우스 CNS 단지 20 및 14 일, 각각10. 현재 연구에서 우리가 mPACT 프로토콜을 통해 마우스 뇌 샘플 처리 우리 발견 그들은 (그림 2B)는 14 일 후 광학 투명도 달성. 쥐 전체 CNS 샘플은 psPACT를 통해 처리 되 고 mPACT 또한 보여주었다 그 mPACT 최고의 효율으로 허가 최대한 달성으로 조직 각각 30, 20 일에 허가 했다 (그림 3A, B). 성인 쥐 두뇌 전체 CNS 반대로 혼자 mPACT로 (그림 4A) 단순한 5 일에 허가 했다. 삭제 된 쥐 두뇌의 혈관 패턴 psPACT 및 (그림 4B, mPACT 데이터 뇌의 해 부와 기능 분석에 대 한 이러한 개간 절차의 유틸리티를 보여 주기 위해 mPACT 처리 후 면역 형광 검사를 통해 분석 되었다 에 우 외. 2016 표시)10.
이들을 사용 하 여 최적화 수동 조직 프로토콜을 삭제, 우리 전체 CNS의 손상, 투명 모델을 시각화 수 있지만 세 가지 프로토콜 중 개간 시간 달랐다. 최적화 된 수동 삭제 방법 짧은 기간에 장기 선명도 달성. 함께 찍은, 이러한 결과 지우기 방법 mPACT 분명 CNS 더 안정적이 고 이전 보다 빠르게 수동 삭제 방법을 생성할 수 있습니다 것이 좋습니다. 따라서, mPACT 포유류 장기의 미래에 구조 및 해 부 분석 사용 하기 위해 큰 잠재력을 보유 하 고 효능과 안전성 면에서 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공 한다.
광학 허가 내부 기관과 mPACT를 사용 하 여 배아의 생성
전체 CNS 조직 뿐만 아니라 성인 쥐 비장 및 신장 맑게 되었다 mPACT로 19과 23 일에 각각 (그림 5AB). E10.5 및 E13.5에서 마우스 배아 했다 또한 mPACT 프로토콜을 통해 처리의 3 일 후 삭제 됩니다. 그림 5C -E 마우스 배아, 쥐 cauda 말 및 쥐 비장 꼬리 지역의 microvasculature로 전체 태아 혈관 패턴의 시각화를 표시합니다. 이러한 결과 mPACT 다양 한 조직 및 3D 해 부 분석에 대 한 장기의 투명 한 모델 생성에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig1.jpg"> 그림 1: 최적화 된 수동 개간 기법 (협정)의 도식 대표. 3 협정 프로토콜의 각 개별 단계에 대 한 개요는 각 단계에 필요한 시 약 함께 제공 됩니다. 원래 협정 프로토콜은 4 %PFA, 4% 아크릴 (금주 모임) 솔루션 및 0.25% 버지니아-044 초기자 솔루션의 차가운 혼합물으로 히드로에서 중 합 조직입니다. 후 조직 질소 가스를 사용 하 여 생산은, 솔루션을 삭제 하는 8 %SDS 수 동적으로 지워집니다. 조직;의 하이드로 겔 형성을 위한 4% 금주 모임 솔루션 및 0.25% 버지니아-044 초기자 솔루션의 별도 처리 프로세스를 사용 하는 psPACT (프로세스 별도 협정) 이러한 조건은 원래 협정 프로토콜의 다. MPACT (수정 된 협정) 추가 8% SDS psPACT 프로토콜의 솔루션을 지우기에 0.5% α-thioglycerol를 추가 합니다. 모든 세 가지 프로토콜에 대 한 그대로 조직에서 incubated은 > 최대한 클리어런스 iss 달성까지 떨고 인큐베이터에서 37 ° C =. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig2.jpg"> 그림 2: 마우스 전체 중앙 신경 시스템 (CNS) 수동 조직 개간 하 여의 광학 투명도. (A) Schematization 전체 CNS 조직의 시간이 지남에 협정 기반 방법을 통해 삭제. 3 수동 개간 프로토콜 (원래 협정, psPACT, mPACT) 마우스 처리 후 14 일에 모든 CNS의 (B) 비교. MPACT 14 일 이상 처리 대상이 마우스 뇌의 (C) 광학 정리. 이 그림은 우 외. 201610에서 수정 되었습니다. 2 c에서 문자가 키가 3 m m입니다. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig3.jpg"> 그림 3: 쥐 전체 CNS 조직 게시물-psPACT 및 mPACT 광학 투명도. (A) 성인 쥐 전체 CNS 조직 달성 30 일 후 psPACT와 최대한 광 정리. (B) 성인 쥐 전체 CNS 조직 달성 20 일 후 mPACT로 최대한 광 정리. 다이어그램의 크기를 나타낼 전체 CNS 치료 전후 눈으로 측정 된 전후. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig4.jpg"> 그림 4: mPACT 처리 및 microvasculature 시각화 sectioned 성인 쥐 두뇌의. (A) mPACT 3 ~ 5 일에 처리 후 4 m m 두꺼운 성인 쥐 두뇌의 비교 섹션. (B) psPACT 처리 후 안티 CD31 항 체로 시각화 성인 쥐 두뇌에 있는 혈관 패턴 3D 투영 스케일 바, 1500 µ m, 100 µ m. 이 그림은 우 외. 201610에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig5.jpg"> 그림 5: 설치류 기관과 전체 마우스 배아 mPACT 처리. mPACT 달성 성인 쥐 (A) 비장 및 (B) 신장에 광학 투명도 19 ~ 23 일, 각각. (C) mPACT는 3 일 후 투명 한 E10.5 및 E13.5 마우스 배아를 생산. MPACT로 개간 후 마우스 배아의 꼬리 영역에서 안티 CD31와 microvasculature의 (D) 시각화. (E) mPACT 통해 처리 후 쥐 cauda 말에 안티-CD31와 (F) 쥐 비장 맥 관 구조의 3D 투영 이 그림은 우 외. 201610에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  Yonsei University College of Medicine. 여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

연구

신경과학

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

암 연구학

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

의학

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

생물학

SHORT 및 LSFM을 이용한 인간 뇌의 고해상도 3D 재구성

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

저자 스포트라이트: Advancing 3D Cytoarchitecture Analysis - Rapid Volumetric Reconstruction of the Human Brain (3D 세포구조 분석의 발전 - 인간 뇌의 신속한 체적 재구성) 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.