Name: isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
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NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.

인체와 관련 된 연구는 헬싱키의 선언에 표현 하는 원칙에 따라 실시 했다. 연구는 다트머스 대학 기관 검토 위원회와 보호의 인간의 과목 (CPHS)를 위한 위원회에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 다트머스-히치콕 병원 (레바논, NH) hysterectomies를 받고 HIV 음성 여성에서 수술 전에 얻은 했다. 숙련 된 병리학 ECX, 병 적인 장애의 자유롭고 병 리의 사이트에서, CX, 및 그들에서 조직 샘플을 선택. 혈액 샘플은 다트머스 히치콕 의료 센터에서 모집 하는 자원 봉사 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 혈액 기증자 했다 익명입니다. 수술 실에서 갓 고립 된 전각, CX, 및 ECX 조직 고립과 분류 사전 별도, 살 균 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 우리의 실험실에 전송에 대 한 병 리로 옮겨 졌다.
1. 효소 소화의 조직
참고: 살 균 물질을 사용 하 고 생물 안전 캐비닛에서 작동.
<ol><li>수정 된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페 놀 레드, 100 U/mL 페니실린 스, 0.35 g/L NaHCO3, 20 mM HEPES 1 x HBSS를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>효소 칵테일을 준비 (수정 HBSS, 450 U/mL 콜라 4, 0.01% [wt/집] deoxyribonuclease, 2 mg/mL D-포도 당). 살 균 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 이상적으로,의 사용, 하루에 소화 효소를 준비 하지만 저장용-20 ° C에 얼 수 있다. 반복 및 주기를 해빙 하지 마십시오.</li>
	<li>수정 HBSS와 100 x 15 m m2 배양 접시에서 조직 린스. 조직의 사용 가능한 금액에 따라 페 트리 접시 크기와 사용 하는 효소 칵테일의 볼륨 조정 (단계 1.4.2 아래 참조). 참고: 조직 병 리, 1-10에서 배열에서 얻은 수술 샘플에 따라 크기가 다양 합니다.</li>
	<li>일회용 메스와 집게 물리적 처리:<ol>
<li>절단 하면서 건조를 방지 하기 위해 조직에 소화 효소 칵테일의 약 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 조직을 안정화 하 고 칵테일 소화 효소에 노출 하는 직물의 표면 영역을 증가 하는 메스를 말하다. 작은 조각 (< 2mm 측에)에 조직을 잘라. 모든 조직 조각 (5 mL/g 조직)를 충당 하기 위해 충분 한 소화 효소 칵테일을 추가 합니다. 페 트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>5% CO2 45 분 흘리 고 또는 거품을 생산 하지 않고 철저 하 게 혼합 소화 효소 칵테일을 회전 속도 확인을 위해 약 80 rpm에 회전에 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 X 거꾸로 가벼운 현미경으로 조직 준비 10 X 목표를 시각화. 참고: 소화, 후 작은 조직 조각 및 표시 상피 땀 샘을 포함 하 여 혼합된 셀 서 스 펜 션 존재 해야 ( 그림 1A참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 단일 셀의 물리적 분리
<ol><li>메 마른 환경에서 홀더를 가진 긴장 된 250 µ m 메쉬를 150 x 15 m m2 페 트리 접시에 놓습니다. 메쉬 페 트리 접시의 표면 위에서 약 0.5 c m 인지 확인 합니다.</li>
	<li>메쉬 수정된 HBSS의 2 mL와 습식 및 메쉬에 소화 조직 전송.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저의 평평한 표면에 사용 하 여, 부드럽게 하지만 단단히, 갈기는 메시를 통해 소화 다진된 조직. 주의: 너무 적극적으로 연 삭 메시 손상 되며 세포 사망률 증가. 이 단계 결합 조직 및 점액에서 상피 세포와 stromal 세포 (면역 세포를 포함 하는) 별도 것입니다.</li>
	<li>조직 파편 철저 하 게 분산 되어, 일단 상승 메시 및 홀더 페 트리 접시의 3 mL와 린스 위의 2-3 cm HBSS 복구 추가 셀을 수정.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 수집 합니다. 페 트리 접시에 수정된 HBSS의 2 mL와 젖은 홀더 20 µ m 메쉬를 배치 합니다. 들고 메쉬 망을 통해 세포 현 탁 액을 부 어 2-3 cm 배양 접시와 수정된 HBSS 6 mL와 린스. 참고:이 단계는 메쉬를 통과 하는 단일 셀에서 위에 유지 됩니다 상피 시트 분리 됩니다. 통해 흐름 혼합된 셀 서 스 펜 션, 면역 세포 및 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
	<li>혼합된 셀 펜션과 10 분 Aspirate 액체에 대 한 500 x g에서 원심 분리기를 수집 하 고 펠 릿 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 대 한 수정된 HBSS 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>아니 브레이크와 혼합된 세포 현 탁 액 3 mL 이상 polysucrose 솔루션 및 30 분 동안 500 x g에서 상 온에서 원심 분리기의 레이어. Polysucrose 솔루션의 위에서 흰색 밴드를 수집 하 고 PBS로 세척. 참고:이 분수 농축된 혼합된 세포 현 탁 액, 면역 세포에 풍부 하 고 일부 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
</ol>3. 죽은 세포 제거
참고: 죽은 세포 (> 20%)의 큰 비율에에서 있는 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후, 자석 구슬 죽은 세포 제거 것이 좋습니다. 죽은 세포는 긍정적인 자기 구슬 선택 과정을 방해할 수 있기 때문에 제거 될 필요가 있다.
<ol><li>10 X 목적으로 가벼운 현미경에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 (500 g, 10 분, 4 ° C)의 모든 셀을 아래로 회전 합니다. 완전히 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 1 x 107 총 셀 (라이브 및 죽은), 제조업체의 지침에 따라 당 죽은 세포 제거 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>30 µ m 필터 자석 열에, 셀 서 스 펜 션 적용 놓고 자기 열을 구슬 표시 된 셀을 허용 합니다.</li>
	<li>권장된 (3 mL)으로 죽은 세포 제거 버퍼 열을 씻어. 흐름을 통해 라이브 셀을 포함 하는 수집 합니다. 죽은 세포 제거 후 셀 복구의 범위는 그림 1B에서 제공 됩니다. 참고: 이러한 셀 phenotypical 연구 (제 5) 얼룩이 cytometry 수행을 사용할 수 있습니다 또는 DC 절연 (제 4) 계속.</li>
</ol>4. DC 정화 긍정적인 자기 구슬 선택에 의해
<ol><li>죽은 세포 제거 (3.2 단계), 다음 셀 아래로 회전 하 고 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿 1 x 107 셀 (PBS, 0.5% 열 비활성화 인간의 AB 혈 청 (HS), 2 mM EDTA) 당 80 µ L 자석 선택 버퍼에 resuspend.</li>
	<li>DC 인구의 긍정적인 선택에 대 한 CD1a 또는 CD14 자석 구슬 (20 µ L 자기 당 구슬 1 x 107 셀) 제조 업체의 지침에 따라 추가 합니다. 4° c.에서 15 분 동안 품 어
</li>
	<li>자기 선택 된 셀을 세척 하 고 스핀 다운, 버퍼를 완전히 제거. 자기 선택의 500 µ L의 최소 셀 resuspend</li>
	<li>자석에 열을 연결 하 고 모든 나머지 세포 덩어리를 유지 하기 위해 열 상단 30 µ m 필터 추가. 필터 및 자기 선택 버퍼 권장 열 린스.</li>
	<li>열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 마그네틱 선택 3 번 린스 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 열을 전송, 자기 선택 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 열에서 선택한 셀을 출시 플런저를 적용.</li>
	<li>순도 높이려면 새 열을 사용 하 여 복구 된 세포 단계 4.4-4.6을 반복 합니다. 마그네틱 비드 선택 후 셀 복구의 범위는 그림 1C에서 제공 됩니다.</li>
</ol>5. 셀 순도의 평가: Flow Cytometry 그리고 현미경 검사 법
<ol><li>항 체 cytometry에 대 한 얼룩:<ol>
<li>20%를 포함 하는 PBS의 106 셀 100 µ L x 1 resuspend 열 비활성화 Fc 수용 체를 차단 하 고 얼음에 10 분 동안 품 어 버렸습니다.</li>
		<li>붙일 항 체 및 죽은 세포의 식별을 위해 시 약 분류는 원하는 추가 (예, 섹션 6.5 참조). 설정 하는 게이츠 고 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 하나의 얼룩 컨트롤을 준비 하나 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광을 설정 합니다. 사용 하는 항 체의 예는 표 1에 주어진 다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>자기 선택의 2 mL로 세포 세척. 참고: EDTA의 존재는 흐름 cytometric 분석에 대 한 응집 하는 세포의 형성을 피하기 위해 해야 합니다. 스핀 다운 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>튜브 당 2 %paraformaldehyde 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정.</li>
		<li>교류 cytometer10,11에 샘플을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 (예를 들어, cytospin) 스핀과 Giemsa 얼룩 형태 분석을 사용 하 여:<ol>
<li>자기 선택의 200 µ L 셀 resuspend</li>
		<li>5 분 동안 스핀에 스핀 열 로드. 슬라이드를 완전히 건조 보자.</li>
		<li>수정 슬라이드 2 분 린스에 대 한 100% 메탄올에 침수에 의해 슬라이드 이온된 수로 그리고 건조 공기를 허용.</li>
		<li>표준 Wrights Giemsa 얼룩을 수행 합니다. 오신 셀 커버 하 고 10 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 씻어 말리 면. Wrights Geimsa 얼룩과 셀 커버, 1 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 헹 구 고 건조 한 공기.</li>
		<li>준비 (그림 2A, 40 X 목표) 거꾸로 현미경으로 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수용자 자극 DC 세포 기능을 평가 하기 위해 분석 결과
<ol><li>해 동 냉동된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)<ol>
<li>10% 셀 문화 미디어 따뜻한 HS 37 ° c</li>
		<li>적은 양의 언된 셀 미디어는 cryotube에 남아 때까지 37 ° C 물 목욕에는 cryotube를 배치 하 여는 PBMCs를 녹여. 메 마른 환경에서 미리 데워 진된 셀 문화 미디어 10%의 10 mL에는 cryotube의 내용을 전송 15 mL 튜브에 HS.</li>
		<li>원심에서 ~ 500 x g 7 분에 대 한 미디어를 제거, 펠 릿을 분산, 셀 문화 미디어 10 %HS, 그리고 원심 분리기의 10 mL에는 PBMCs resuspend 셀.</li>
		<li>세척 단계는 제 3 시간을 반복 합니다. 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T-셀 선택:<ol>
<li>부정적인 선택 자기 항 체 셀 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 순진한 T-세포를 분리.</li>
		<li>절연, 후 CD45RA 및 CCR7 항 체를 사용 하 여 순도 확인 하십시오. 참고: 일반적인 순도 > 99% naïve T 세포입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T 세포 확산 염료 얼룩이 지기:<ol>
<li>600 µ L 셀 확산 염료, 염료를 보호 하는 빛에 노출에서의 2 배 솔루션의 준비.</li>
		<li>순진한 T-세포 2 워시 x PBS. 500 µ L PBS에 셀 resuspend</li>
		<li>부드럽게 vortexing 동안 biosafety 내각에 셀 순 T-세포를 확산 염료의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어
</li>
		<li>세포 배양 10%의 5 mL을 추가 하 여 셀 라벨 중지 셀에 HS. 5 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심에서 셀 ~ 7 분, 500g x 미디어, 발음 및 세포 배양 10%의 4 ° C에 셀 resuspend HS. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 마지막 원심 분리 이전 계산 셀의 약 수를 가져가 라. 참고: 일반적으로, 최종 순 T-셀 번호 초기 PBMC 세포 수의 15%와 5% 사이 범위 것입니다.</li>
		<li>10%로 셀 문화 미디어 셀 resuspend 원하는 셀 농도에서 HS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC 수용자 naïve T 세포 공동 문화:<ol>
<li>1시 15분에서 격리 된 Dc와 순진한 T-세포는 96-글쎄, 라운드-하단 접시에서 접시 T-세포에 Dc의 비율. 3000 및 5000 셀/잘 Dc 범위에 대 한 최적의 수를 확인 합니다.</li>
		<li>원심에서 접시 ~ 500 x g 3 분 셀 우물의 센터에서 위치 확인. 셀 연락처 적절 한 신호 발생을 위해 중요 하다.</li>
		<li>6 일 동안 37 ° C에서 품 어. 확산 발생, 현미경 검사 법 (그림 3A)와 우물에 표시 되는 셀의 클러스터를 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry 확산을 평가 하기 위해 얼룩:<ol>
<li>6 일 후 세포 cytometry에 의해 시험 될 수 있다. Cytometry에 대 한 공동 문화 얼룩.</li>
		<li>PBS에서 노란색 생존 염료 (최대 방출 572 nm)의 2 배 솔루션을 준비 합니다. 참고: 혈 청 하지 않고 PBS 사용 하 여 중요 한, 혈 청으로 단백질 방해 염료).</li>
		<li>에 세포 격판덮개 원심 ~ 5 분 동안 500 x g.</li>
		<li>상쾌한의 100 µ L을 제거 합니다. 참고:이 시점에서 수집 하 고 저장 성 요인의 별도 분석을 위한 상쾌한.</li>
		<li>두 번 PBS로 세포 세척: 150 µ L/잘 PBS의 추가에 원심 ~ 5 분 동안 500 x g 150 µ L를 피펫으로와 상쾌한의 제거. 각 잘에 남아 상쾌한의 50 µ L 인지 확인 합니다.</li>
		<li>각 우물에 2 x 생존 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>부 화, 중 원하는 항 체 마커 마스터 혼합물을 준비 합니다. 예: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, 등
</li>
		<li>각 우물에 항 체의 혼합물을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>셀 2 워시 x PBS + 2 %HS: 150 µ L/잘 PBS + 2%의 추가 HS. 원심에서 ~ 500 x g를 피펫으로와 상쾌한의 5 분 제거 150 µ L에 대 한.</li>
		<li>100 µ L / 2% 파라 포름알데히드의 우물을 추가 하 여 셀을 수정. 필요한 경우: 폴 리 프로필 렌 흐름 cytometry 튜브에 세포와 미디어를 전송. 튜브 4 ° C에서 보관 고 흐름 cytometric 분석까지, 빛에서 보호 될 수 있습니다.</li>
		<li>교류 cytometer에서 읽기 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하 고 DC 하위 집합 및 해 부 위치 사이 비교 기회를 제공 합니다.
여기 우리는 생체 외에서 기능적 특성의 평가 대 한 인간의 FRT 조직에서 Dc의 정화를 허용 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이후 Dc 낮은 숫자에 점 막 사이트에서 찾을 수 있습니다, 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 및 자석 구슬 가진 셀 격리 전에 죽은 세포 제거 하 여 조직 세포 준비를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 개발 했다. 죽은 세포의 적절 한 제거는 키, 그들은 구슬 격리에 방해가 됩니다. 이 기술은 (4-6 h), 시간의 비교적 짧은 시간에 긍정적으로 고립 된 세포 (≈ 90%)의 순도 제공 하 고 하룻밤 배양, 세포 배양 체 외에서 또는 절연 이전 마이그레이션에 대 한 필요 없이 각각의 Dc를 활성화할 수 있습니다 및 그들의 phenotypic 특성을 변경 합니다. 우리의 프로토콜 최대-성숙의 마커 (CD86, HLA-DR, CD83)13의 규제의 부족에 의해 측정 된 세포 활성화, 트리거되지 않습니다. 또 다른 장점은 비 분해 효소 소화 표면 마커를 쪼개 하지 않습니다 하 고 즉시 세포 격리 또는 조직 소화14다음 phenotypical 분석에 대 한 수의 사용 이다.
이 프로토콜에 중요 한 자석 열의 막힘을 피하기 위해 단일 세포 현 탁 액의 발생이 이다. 이것을 보장 하기 위해, 죽은 세포 자기 셀 선택, 필터 필요 자기 열 위에 사용 될 전에 제거 해야 합니다 그리고 조직 3 세대 보다 더 큰 2 개의 란 사이 분할 되어야. 두 번째 열 정화의 첫 번째 라운드 후의 사용 높은 셀 순도 열쇠입니다.
격리 방법의 한 가지 한계는 고유의 낮은 수 Dc의 FRT 조직에서 일반적으로 허용 하지 않는 좋은 셀 복구 조직 1 g 보다 작은. 그러나 이러한 상황에서, phenotypical 분석 여전히 수행할 수 있습니다 사용 하는 풍부한 세포 현 탁 액을 혼합. 이것은 가능 하 표면 마커를 쪼개 하지 않는 세포 표현 형의 즉각적인 분석을 위한 조직 소화14후 사용, 비 분해 소화 방법 때문 이다. 또한, 환자 나이 복구 하는 셀의 수를 영향을 미치는 요소를 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 이전 시연 CD1a + 절연 CD14 + 선택13; 보다 phenotypically 더 균질 인구를 제공 합니다. 그러나, CD1a + Dc는 CX ECX에서 복구 하기 어렵다. CD14 또한 대 식 세포에 표현 될 수 있다, 하는 동안 우리가 발견 FRT CD14 + 고립 된 인구 공동 식 DC 마커 및 Dc13의 특징 기능은 수용자 순진한 T-세포를 자극 하는 그들의 능력에 따라 Dc, 풍부 하다.
이후 Dc 복구의 수는 일반적으로 낮은 (< 100000 총 셀), 기능 연구는 낮은 세포 수에 대 한 최적화 될 필요가. 여기 우리가 3000 Dc/잘 실행 될 수 있는 한 수용자 자극 분석 결과의 최적화를 보여줍니다. 우리 호르몬 응답, 사이토카인, 그리고 FRT Dc13HIV-자극 및 HIV-캡처 시 항균 성 펩 티 드 생산을 포함 하 여 이러한 셀과 다른 기능 연구를 실시 했습니다. 일단 Dc 격리 도금, 세포 생존 능력 감소로 그 시간 후에 24 h, 내 분석 수행 되어야 한다.
이 프로토콜은 다른 DC 하위 집합을 적용할 수 있습니다 또는 적절 한 표시자를 선택 하 여 다른 세포 유형 결합 자석 구슬 및 원치 않는 셀 형식을 제거 하 결합 순차적 양수와 음수 구슬 선택. 한 주의 하지만, 그 선택의 모든 라운드 셀의 일부 비율 손실 됩니다, FRT Dc의 격리에 대 한 이미 드문, 그리고 조직의 크기는 일반적으로 작은, 그래서 다른 마커 (및 필요한 선택의 여러 라운드입니다. 세척 관련) 바람직하지 않습니다. 또한,이 프로토콜 다른 조직14,15다른 면역 세포 또는 Dc 격리 하기 위해 적응 될 수 있다.

FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성

<table><tbody><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL&amp;nbsp; filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm polystyrene dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Treated cell culture dish</td></tr><tr><td>Isotemp Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Pre-separation filter (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 cell proliferation dye</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie yellow viability dye</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 color, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 color, VBR</td></tr></tbody></table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.

다음 조직 소화, 상피 시트와 땀 샘의 릴리스 관찰 될 수 있다, 그림 1A;와 같이 이것은 효소 소화 성공적인 나타내는 긍정적인 컨트롤입니다. 총 실행 가능한 세포 및 조직의 그램 당 복구 Dc의 숫자도 표시 됩니다 그림 1B 및 그림 1C, 각각. 면역 세포 밀도 원심12,13이전 stromal 세포의 5-30% 사이 나타냅니다. 그림 2 는 형태 (그림 2A)와 격리 된 Dc의 순도 (그림 2B, C). 2 라운드 선택의 프로토콜에서 수행 됩니다, 예상된 순도 85-92% (그림 2C) 사이 범위. 복구 된 셀 개수 변수 이며 초기 조직 기증자와 크기 변화에 따라 달라 집니다. 고립 된 세포의 특성 설명된13되었습니다. 그림 3 DC 기능을 평가 하는 대표적인 수용자 자극 분석 결과를 보여준다. 그림 3A 확산 발생, 그림 3B cytometry로 확산 정량화를 보여줍니다 때 나타나는 특성 T 세포 풀을 보여 줍니다. 바이러스 성 캡처 또는 cytokine 및 chemokine 생산 등 다른 기능 분석 수행된13수도 있습니다. 그림 4 는 농축된 혼합된 셀 사용 (그림 4A)의 흐름-cytometric 분석 후 뚜렷한 FRT 해부학 구획에 다른 Dc 인구를 식별 하는 제어 전략. DCs와 대 식 세포 표시 높은 autofluorescence 항 체와 부정적인 컨트롤의 적정 중요 하다. FMO 컨트롤 그림 4B에 표시 됩니다. 그림 4C 등 CD1c +, CD207 +, CD103 + Dc 특정 DC 하위 집합을 식별 하는 방법의 예를 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57100/57100fig1.jpg"> 그림 1: 조직 처리 및 셀 가용성. (A) 상피 시트와 땀 샘 조직 소화 후 출시의 대표 이미지. 조직 처리 및 각 FRT 구획에 죽은 세포 제거 후 복구 가능한 세포의 총 수의 (B) 범위: endometrium (EM), endocervix (CX), 및 ectocervix (ECX). 모든 도트는 다른 주제에서 셀을 나타냅니다. (C) 수의 Dc 자석 구슬 격리 후 조직의 그램 당 회복. B와 C는13에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57100/57100fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57100/57100fig2.jpg"> 그림 2: 형태학 및 고립 된 세포의 순도. (A) 다음 Giemsa 얼룩 현미경 검사 법에 따라 격리 된 세포의 수지상 형태학. (B) 식의 phenotypic 마커 비드 격리, cytometry 정한 전후. (C) 대표 순도 CD1a + 및 CD14 + 구슬 격리 후 얻은. 13에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57100/57100fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57100/57100fig3.jpg"> 그림 3: 확산 분석 결과. T-세포의 (A) 대표 현미경 이미지 클러스터 확산 동안 형성: 단계 대조 (왼쪽), 확산 (가운데), 얼룩 염료 및 오버레이 (오른쪽). (B)의 공동 문화 후 확산의 유도의 대표적인 예 절연 자궁내 막 CD1a + 또는 CD14 + Dc 이며 T-세포 냉동된 PBMCs. B에서 얻은 수용자 순진한13에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57100/57100fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57100/57100fig4.jpg"> 그림 4: 고 농축에 Dc의 Phenotypical 특성 혼합 셀 정지는 FRT.에서 (A) 게이팅 혼합된 세포 현 탁 액에 Dc의 식별에 대 한 전략. 다 색 음모에 각 문이 인구는 다음 패널에 표시 됩니다. 등고선 플롯 표시 CD11c + CD11b +와 CD11c + CD11b-빌 게이츠, 각각. 분석;에서 그들을 제외 하는 동일한 채널을 사용 하 여 원치 않는 셀을 식별 하는 마커를 얼룩이 질 수 있다 예, 죽은 세포, CD3 + 고 CD19 + 셀. (B) FMO 컨트롤 적절 한 게이트를 확립 합니다. (C) DC 하위 집합 다음 제어 전략의 차별. 등고선 플롯 셀 숫자 낮은10때 더 정확 하 게 인구 분포를 표현 하기 위해 다 색 플롯 대신 선택 되었다. 낮은 셀 번호 조직 Dc는 드문 인구 제어 전략의 끝에 예상 된다. 13에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57100/57100fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>셀 표식</td>
			<td>형광 색소</td>
			<td>클론</td>
			<td>농도</td>
			<td>샘플 당 항 체의 양</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(버퍼의 100 µ l)에</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>vioblue450</td>
			<td>HI30</td>
			<td>1.0 µ g/5µl</td>
			<td>0.4 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11b</td>
			<td>PE</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>1.0 µ g/5µl</td>
			<td>0.4 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11c</td>
			<td>PerCp/Cy5.5</td>
			<td>Bu15</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>0.4 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCR5</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>2D 7</td>
			<td>0.25 µ g/5µl</td>
			<td>0.1 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCR7</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>REA108</td>
			<td>99 µ g/ml</td>
			<td>0.2 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>BV-570</td>
			<td>L243</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>0.2 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>FITC</td>
			<td>AC122</td>
			<td>82.5 µ g/ml</td>
			<td>0.16 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>APC</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>16 µ g/ml</td>
			<td>0.03 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>viogreen</td>
			<td>REA614</td>
			<td>137 µ g/ml</td>
			<td>0.27 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD163</td>
			<td>APC</td>
			<td>GHI/61</td>
			<td>80 µ g/ml</td>
			<td>0.16 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD207</td>
			<td>APC</td>
			<td>1OE2</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>0.4 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD1a</td>
			<td>FITC</td>
			<td>HI149</td>
			<td>0.5 µ g/5µl</td>
			<td>0.2 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD1a</td>
			<td>AF-700</td>
			<td>HI149</td>
			<td>0.5 mg/ml</td>
			<td>1.0 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD103</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>B-Ly7</td>
			<td>0.25 µ g/5µl</td>
			<td>0.1 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD83</td>
			<td>PE</td>
			<td>HB15e</td>
			<td>0.25 µ g/5µl</td>
			<td>0.1 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>APC 화재</td>
			<td>63D 3</td>
			<td>400 µ g/ml</td>
			<td>0.8 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD209</td>
			<td>FITC, PE, APC</td>
			<td>120507</td>
			<td>1.25 µ g/0.25 ml</td>
			<td>0.01 µ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>좀비 생존 노란색 염료</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7AAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 mg/ml</td>
			<td>0.2ug</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Dc cytometry에 의해 FRT에 특성에 대 한 항 체의 예.

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K 조회수.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. 여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

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Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

연구

암 연구학

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

면역학 및 감염병학

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

생물학

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.