Name: investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
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Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.

참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석
1입니다. RNA 샘플의 준비
<ol><li>자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.</li>
	<li>시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 세포는 BrU의 응용 프로그램에 따라 신선한 미디어 사용을 하지 않습니다.</li>
	<li>BrU와 치료 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 5 mL 행 크의 버퍼에 셀을 세척 하 고 2 mL 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize. 8 mL 성장 미디어 반응을 중지, 15 mL 튜브에 세포를 전송 1000 x g 2 분에 대 한 셀 아래로 회전을 추가 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RNA 격리를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 총 RNA 추출 키트 ( 재료의 표참조) 또는 다른 메서드를 선호 하 고 진행 준비까지-80 ° C에서 RNA RNase 무료 H2o. 저장소에에서 elute.</li>
</ol>2입니다. 준비 구슬의 IP에 대 한
<ol><li>조사를 더하기 하나 pipetting 동안 손실에 대 한 계정 및 혼합 소용돌이 추가 샘플 수에 대 한 배치에 비즈를 준비 합니다. 회전 혼합 하 여 철저 하 게 반대로 마우스 IgG 자석 구슬 resuspend 고 RNase 무료 1.5 mL 튜브에 샘플 당 20 µ L 구슬 꺼내. 장소는 마그네틱 스탠드에는 구슬을 두고 약 20 s 1.5 mL 튜브에 수집.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내와 pipetting으로 400 µ L 1 x BrU IP 버퍼에서 resuspend. 아주 짧게 2에 대 한 튜브를 회전 탁상 원심 분리기에 s 마그네틱 스탠드에 다시 배치 하 고는 상쾌한 제거. 한 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>헤 파 린을 사용 하 여 구슬 블록 난다 바인딩입니다. 1 ml 1 구슬 resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL 헤 파 린 버퍼, 그리고 회전 30 분 세척을 위한 구슬, 단계 2.2에서 두고. 참고: 헤 파 린은 RNAs 바인딩을 위해 경쟁할 것 이다 마이너스로 충전 된 중합체 이다. tRNA 또는 다른 관련이 없는 RNAs 또한 사용할 수 있습니다 경우 다운스트림 응용 프로그램 시퀀싱 하지.</li>
	<li>BrU IP 버퍼 x 1 ml 1 구슬 resuspend 고 추가 1.25 µ g/샘플 안티-α-Bromodeoxyuridine 항 체, BrU 인식 합니다. 1 시간에 대 한 구슬 회전 하는 동안 품 어 또는 실 온에서 하룻밤.</li>
	<li>세척 단계 2.2에서 세 번 비즈. 1mm BrU와 떠나 난다 바인딩 IP 중의 위험을 구슬 하 고 이로써 항 체의 감도 낮추는 30 분 회전 보충 50 µ L/샘플 1 x BrU IP 버퍼에 구슬 resuspend.</li>
	<li>3 번 단계 2.2에서 구슬 세척 하 고 50 µ L/샘플 1xBrU-IP 버퍼에서 resuspend.</li>
</ol>3. 구슬에 RNA BrU 표시 바인딩
<ol><li>1.3 단계에서 RNA 추출에서 RNA 농도 측정 자외선 보이는 분 광 광도 법, 사용 하 고 40 µ g RNA 각 샘플에서 RNase 무료 H2O 200 µ L의 총 볼륨을 희석.</li>
	<li>열 변성 RNA와 짧게 탁상 원심 분리기에서에서 회전에 80 ° C에서 2 분 동안 RNA 샘플. BrU-IP + BSA/RNAse 억제제 x 200 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>50 µ L resuspended과 구슬 단계 2.6에서에서 각 샘플을 준비 하 고 회전 1 h. 세척 4 번 단계 2.2에서 구슬을 두고 추가 합니다.</li>
</ol>4. 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출에 의해 RNA의 정화
<ol><li>
RNA을 elute 및 페 놀 추출
	<ol>
<li>RNA, elute 200 µ L 차입 버퍼에 구슬 resuspend 그리고 그 후 신속 하 게 추가 200 µ L 페 놀, pH 6.6 (주의: 독성, 참조 단계 4.1.2 아래) 샘플에서 어떤 비 RNA 분자를 제거 하.</li>
		<li>회전 혼합 샘플, 그리고 스핀 탁상 원심 분리기에 25000 x g에서 3 분. 참고: 페 놀 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 약 산 성 pH RNA 및 DNA 하지 추출 됩니다 보장 합니다. RNA의 친수성 특성상 위 수성 단계에서 유지 됩니다. 단백질의 소수 성 코어 페 놀을 바인딩할 하 고 낮은 유기 페 놀-단계로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 놀-클로 프롬 추출
	<ol>
<li>(처리에 경험에 따라 200 µ L의 약 190 µ L) 가능한 만큼 위 단계를 발음 하 고 200 µ L 페 놀/클로 프롬, pH 6.6 튜브로 이동 (주의: 독성, 참고). 샘플에 걸쳐 동일한 금액을 발음 해야 합니다.</li>
		<li>소용돌이 샘플 스핀 25000 x g에서 3 분에 대 한 믹스. 참고: 클로 프롬 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 클로 프롬 반전 녹음 방송14 및 중 합 효소 연쇄 반응을15를 억제 하 여 RNA의 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 페 놀 제거에 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(지금 약 180 µ L), 앞으로 수성 위 단계 발음 하 여 클로 프롬 적 출을 수행 하 고 200 µ L 클로 프롬을 포함 하는 관에 전송. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 스핀 25000 x g에서 3 분.</li>
	<li>(지금 약 170 µ L) 앞으로 수성 위 단계를 발음 하 고 17 µ L (1/10 볼륨) 3 M 채널3COONa, pH 6.0 포함 된 튜브에 그것을 전송. 중화 하 고 수성 해결책에서 RNA를 침전, RNA와 함께 침전 하 고 RNA 펠 릿을 더 보이는 게 2 µ L glycogen (20 mg/mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA와 혼합 소금 이온 사이의 바인딩을 증가 500 µ L 96% 에탄올을 추가 합니다. 드라이 아이스에 하룻밤-20 ° C에서 15 분 튜브를 둡니다.</li>
	<li>25000 x g, 4 ° C는 펠 렛을 방해 하지 않고 30 분 삭제 상쾌한에 샘플을 회전 하 고 모든 잔여 소금 제거 하려면 185 µ L 75% 에탄올에 펠 릿을 세척. 25000 x g, 5 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다.</li>
	<li>펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한을 완전히 삭제 하 고 열린 뚜껑으로 5 ~ 10 분 건조 펠 릿을 둡니다. RNase 무료 H2O 튜브의 측면에 적용 되는 펠 렛을 방해 하지 않으려면 10 µ L resuspend.</li>
</ol>5입니다. RNA의 분석
<ol><li>CDNA cDNA 반전 녹음 방송을 사용 하 여 준비 ( 재료의 표참조) 장비 또는 선호 하는 다른 방법을 사용 하 여 2 µ L RNA 샘플 및 1 µ g 효 모 총 RNA RNA 매체로 cDNA 합성 반응 (사용 되지 않음 cDNA 다음 세대 시퀀싱에 사용 하는 경우)에 대 한. 효 모 RNA 없이 1 µ g RNA를 사용 하 여 해당 입력의 cDNA 준비에 대 한.</li>
	<li>희석 cDNA 1시 25분와 혼합 희석 9 µ L cDNA 10 µ L 정량으로 마스터 믹스와 1 µ L fluorogenic 프로브, 두 재료의 테이블에에서 지정 된. 참고: cDNA 희석 cDNA 준비 및 사용 되는 정량 Pcr 방법에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>(예를 들어, 7500 빠른 실시간 PCR 시스템 또는 동등한) 다음 정량 프로그램 실행: 50 ° C, 20에서 2 분 95 ° C, 3의 40 주기에서 s s 95 ° C와 30에서 60 ° c.에 s</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase+2+modulates+&#945;-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production.">Polo-like kinase 2 modulates &#945;-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li><li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression.">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이?...

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.
수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.
다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 위한 새로운 가능성을 제공 합니다. 주된 단백질 축적으로 불용 성 집계 PD에서 α-synuclein 이며 α-synuclein 유전자의 유전자 곱셈 발생 가족 PD5α-synuclein의 수준, 질병에 직접 연결 합니다. 또한, α-synuclein 농도 의존 방식으로 집계합니다. Α-synuclein mRNA 수준의 Downregulation 그러므로 성공적으로 달성 하고있다 RNA 간섭 PD 설치류 모델6,7에 신경 세포 손실 감소를 사용 하 여 흥미로운 치료 전략 이다.
그것은 질병 또는 치료 내정간섭에 기인 하는 RNA 생산의 변화를 측정할 수 있을 해야 합니다. 첨단 방법 등 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량), 뒤 반전 녹음 방송 RNA의 측정 정상 상태 수준은 구별 또는 transcriptional 규칙에 의해 발생 하는 변경의 수 변경 RNA 안정성입니다. RNA 감소율의 조사를 위해 널리 사용 되는 방법은 transcriptional 기계 화합물 α-amanitin 악티노마이신 D 뒤에 부패 RNAs의 측정 등을 사용 하 여 차단 합니다. 그러나, 세포 apoptosis8,9의 유도 등에서 전사의 전반적인 방해와 관련 된 몇 가지 문제가 있다. 세포 독성 효과 옆에 transcriptional 억제제는 또한 느린 세포질 통풍 관에 α-amanitin 악티노마이신 D (참조10검토)의 특이성의 부족 등 여러 가지 기술적인 문제를 제시.
전사의 전반적인 막힘을 피하기 위해, 뉴클레오티드 아날로그 사용 되었습니다, 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), 부 순 등. 이들은 쉽게 포유류 세포에 의해 채택 고 새로 합성된 RNA, RNA의 특정 시간 프레임 내에서 펄스 라벨 사용에 통합. BrU 5-EU와 4-부 엉, 보다 적은 독성 그것은 선택11,12의 기본 아날로그.
BrU IP RNA 합성 속도, 안정성 모두를 조사 하 고 따라서 총 RNA에 변화의 근본 원인 사이 구별을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 RNA 합성의 측정에 초점을 것입니다 고2 RNA 안정성의 조사에 대 한 자세한 내용은 참조를 참조. RNA 합성을 조사, 세포는 BrU 예 1 h BrU-IP1 (그림 1C) 다음으로 이라는 짧게. 이 시간 내에 짧은 라벨 합성 하는 RNA의 측정을 가능 하 게 하 고 관찰 된 변화 보다 RNA 합성에 실시간 정량 하 여 총 RNA에 변화를 측정 하 여 규정의 더 나은 견적을 줄 것 이다. 그러나 그것은,, 그 라벨에, 예를 들어 1 h만 하더라도 저하 아직도 있을 수 있다 관찰 RNA 수준에 영향을 미치는 언급 한다.
BrU IP 실험에서 RNA는 실시간 정량1 또는 다음 세대 시퀀싱2,13다운스트림 분석에 적합 합니다. 다른 표준 RNA 검출 방법, 북부에 게 더 럽 히기 등 ribonuclease 보호 분석 결과, 특정 RNAs에 적용할 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ribolock Rnase inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td></tr><tr><td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Taqman RNA probes</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Flurogenic probes</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR system</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cell line</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s buffer</td><td></td><td></td><td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td></tr><tr><td>DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP Buffer</td><td></td><td></td><td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &amp;mu;g/&amp;mu;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and supplemented with 1mg/mL heparin</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td></tr></tbody></table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.

BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.
BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같?...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

9.5K 조회수.  Aarhus University. RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

비디오: Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-seq) is a method that aims to enrich for methylated RNA and ultimately identify modified transcripts. Briefly, sonicated RNA is incubated with an antibody for 5-methylated cytosines and precipitated with the assistance of protein G beads. The enriched fragments are then sequenced and the potential methylation sites are mapped based on the distribution of the reads and peak detection. MeRIP can be applied to any organism, as it does not require any prior sequence or modifying enzyme knowledge. In addition, besides fragmentation, RNA is not subjected to any other chemical or temperature treatment. However, MeRIP-seq does not provide single-nucleotide prediction of the methylation site as other methods do, although the methylated area can be narrowed down to a few nucleotides. The use of different modification-specific antibodies allows MeRIP to be adjusted for the different base modifications present on RNA, expanding the possible applications of this method.

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

The methylated RNA immunoprecipitation assay is an antibody-based method used to enrich for methylated RNA fragments. Coupled with deep sequencing, it leads to the identification of transcripts carrying the m5C modification.

메틸화 RNA 면역 침전 분석연구 m5C 변형에 대한 애비독증

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

면역학 및 감염병학

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

생화학

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

생물학

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

요약

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